植物細胞培養(yǎng)及次生物質生產(chǎn)

植物細胞培養(yǎng)及次生物質生產(chǎn)第1頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五細胞培養(yǎng)培養(yǎng)類型根據(jù)培養(yǎng)規(guī)模：小規(guī)模和大批量培養(yǎng)根據(jù)培養(yǎng)方式：懸浮、平板、看護培養(yǎng)根據(jù)要求產(chǎn)物：用于誘變和生產(chǎn)次生(級)產(chǎn)物(Secondaryproducts)的細胞培養(yǎng)第2頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五懸浮培養(yǎng)

單細胞培養(yǎng)

細胞規(guī)?；囵B(yǎng)

培養(yǎng)細胞的次級代謝及產(chǎn)物積累

第3頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五懸浮培養(yǎng)（Suspensionculture）懸浮培養(yǎng)

是細胞培養(yǎng)的基本方法，是將單個游離細胞或小細胞團在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)增殖的技術。特點

1.培養(yǎng)細胞可不斷增殖，且生長速度快。

2.液體狀態(tài)下便于細胞和營養(yǎng)物質的充分接觸和交換，細胞狀態(tài)可以相對保持一致。第4頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五細胞懸浮培養(yǎng)的應用SuspensioncellsPlantsArtificialseedsIsolationprotoplastsMutationselectSecondaryproducts第5頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五細胞懸浮培養(yǎng)的建立愈傷組織的誘導懸浮系的建立與繼代培養(yǎng)懸浮細胞的生長動態(tài)懸浮細胞同步化第6頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五愈傷組織的誘導選擇適宜的外植體：幼胚下胚軸子葉選擇適宜的培養(yǎng)基：MS，B5，N6較高激素濃度必要的附加物質第7頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五要求：松散性好、增殖快、再生能力強。其外觀一般是色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色，呈細小顆粒狀，疏松易碎適宜懸浮培養(yǎng)適宜再生植株第8頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五懸浮系的建立與培養(yǎng)callus150~250mlflaskcentrifugeisolationsubculture1g/10mlmedium100~120rmpculturetransfer1time/3d80rpm第9頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五第10頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五成功的懸浮細胞培養(yǎng)體系特征懸浮培養(yǎng)分散性良好，細胞團較小，一般在30～50個細胞以下。均一性好，細胞形狀和細胞團大小大致相同。懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。細胞生長迅速，懸浮細胞的生長量一般2～3天便可增加一倍。第11頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五第12頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五第13頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五懸浮細胞的生長動態(tài)第14頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五懸浮細胞生長的衡量根據(jù)不同培養(yǎng)時間的細胞數(shù)變化，或細胞質量變化。生長速率(p)：不同時間細胞密度(x)的自然對數(shù)與起始密度(x0)的自然對數(shù)之差與培養(yǎng)時間(t)的比值

p＝(lnx-lnx0)/t鮮重：真空減壓過濾后稱重，反應細胞生長情況干重：鮮細胞烘干至衡重，反應細胞質量第15頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五影響懸浮細胞生長的因素起始愈傷組織的質量接種細胞密度：懸浮細胞的起始密度一般在0.5~2.5×105個細胞/毫升。接種初期的細胞密度過低往往使延遲期加長。最低有效密度：即能使細胞分裂、增殖的最低接種量。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基、方式、溫度、繼代周期。第16頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五影響懸浮細胞生長的因素培養(yǎng)基應用條件培養(yǎng)基（生長過愈傷組織或懸浮細胞的液體培養(yǎng)基）提供單細胞生長和分裂所需的特殊代謝物?；九囵B(yǎng)基成分的調(diào)節(jié)視不同的培養(yǎng)目的而定培養(yǎng)基設計時，一般均以誘導愈傷組織形成的培養(yǎng)基為基礎進行調(diào)整。常用的培養(yǎng)基有MS、B5、LS、N6等。植物激素和其他附加成分的應用。第17頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五影響懸浮細胞生長的因素培養(yǎng)方式：搖瓶，反應器（氣動式、攪拌式）；分批培養(yǎng)，半連續(xù)培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)溫度25℃繼代周期指具有一定起始密度的細胞，從開始培養(yǎng)到細胞數(shù)目和總重量增長停止的一個過程。培養(yǎng)周期的長短是由起始細胞密度、延遲期的長短、生長速率等決定。繼代培養(yǎng)（Subculture）：繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴繁殖培養(yǎng)過程。第18頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五懸浮培養(yǎng)細胞的同步化細胞同步化：同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細胞都同時通過細胞周期的某一特定時期。植物細胞在懸浮培養(yǎng)中容易團聚并進入不同程度的分化狀態(tài)，因此，要達到完全同步化是十分困難的。同一培養(yǎng)體系的植物細胞經(jīng)常不能處于同一細胞周期，這種差異使懸浮細胞分裂、代謝以及生理生化狀態(tài)等復雜化。通過一定的理化措施可以使同一體系中的細胞達到相對同步化。什么措施？第19頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五細胞周期第20頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五饑餓法饑餓導致的細胞分裂受阻常常是使細胞不能合成DNA，即不能進入S期，或細胞分裂不能進行，即不能進入M期。因此，通過饑餓法可以獲得處于G1和G2期的同步化細胞。氮饑餓時，通常獲得G1期的同步化細胞磷和碳饑餓時，獲得G1和G2期的同步化細胞。將饑餓細胞轉入完整培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)時，細胞分裂又可重新恢復。第21頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五抑制劑法通過一些DNA合成抑制劑處理細胞，使細胞滯留在DNA合成前期，當解除抑制后，即可獲得處于同一細胞周期(G1)的同步化細胞。常用抑制劑主要有5-氟脫氧尿苷(FudR)和羥基尿(HU)。用羥基尿處理獲得同步化細胞的方法在小麥、玉米、西芹等植物細胞培養(yǎng)中已有成功應用。利用破壞微管的藥物將細胞阻斷在中期，常用的藥物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性較小。第22頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五分選法依據(jù)：細胞體積大小方法常規(guī)分選方法是梯度離心精細的分選可采用流式細胞儀優(yōu)點操作簡單分選細胞維持了自然生長狀態(tài)，不會有其它處理帶來的副作用缺點分選精細度較差第23頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五低溫處理可以提高培養(yǎng)體系中細胞同步化的程度Okamura等曾采用此方法使胡蘿卜懸浮細胞較好地同步化。梅興國等（2001）采用6℃低溫處理紅豆杉細胞也獲得較明顯同步化效果?？赡艿脑虿煌臏囟葘毎挠薪z分裂有極明顯的影響，在一定范圍內(nèi)，溫度下降使細胞分裂速度減慢，細胞周期延長，從而相應地延長了分裂期的時間，使分裂指數(shù)提高，細胞同步化率升高。第24頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五單細胞培養(yǎng)意義分離方法培養(yǎng)方法第25頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五植物單細胞培養(yǎng)的意義建立單細胞無性系，有助于研究植物細胞的特性和潛力，了解細胞間的相互關系，研究細胞分化、發(fā)育和形態(tài)發(fā)生的分子機理。采用生物化學的方法，對培養(yǎng)的單細胞進行人工誘發(fā)突變，或建立遺傳轉化受體。在細胞水平上對花粉進行培養(yǎng)，可排除體細胞干擾。利用生物反應器可大規(guī)模地培養(yǎng)細胞，進行次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。第26頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五單細胞分離方法機械法具體做法：將葉片輕輕研碎、過濾離心、收集凈化從未分化的疏松易碎的愈傷組織，通過搖床振蕩獲得分散的單細胞或小細胞團優(yōu)點：細胞不受酶傷害；有利于進行細胞的生理和生化研究。第27頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五單細胞分離方法酶解法酶對細胞壁有一定的軟化作用，所以采用酶法時，必須加入甘露醇等滲透壓保護劑；可通過加入硫酸葡聚糖鉀來提高游離細胞的產(chǎn)量。(纖維素酶，果膠酶)優(yōu)點可獲得較多的葉肉游離細胞（但對禾本科植物葉片效果不好）。第28頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五細胞懸浮過濾與培養(yǎng)基混合植板培養(yǎng)克隆愈傷組織第29頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五細胞平板培養(yǎng)(platingculture)指將一定密度的懸浮細胞接種到一薄層固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的技術。Bergman(1960)首創(chuàng)單細胞的分離：一般采用酶分離法，小細胞團不能超過6個細胞。單細胞懸浮液的制備：分離的單細胞經(jīng)培養(yǎng)基洗滌2次以后，調(diào)整密度為5×103個/毫升植板：將1份已調(diào)整好密度的單細胞懸浮液與4份35℃的固體培養(yǎng)基充分混合均勻，然后均勻地平鋪于培養(yǎng)皿中，其厚度為5mm左右。第30頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五細胞平板培養(yǎng)（platingculture)平板培養(yǎng)的效果一般用植板率來衡量。植板率是能長出細胞團的單細胞在接種單細胞總和中所占的比例。每個平板形成的細胞團數(shù)植板率＝每個平板接種的細胞總數(shù)第31頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五細胞平板培養(yǎng)(platingculture)優(yōu)點：單細胞在培養(yǎng)基中分布均勻，便于在顯微鏡下對細胞進行定點觀察，是單細胞株篩選和突變體篩選的常用方法。由于它具有篩選效率高、篩選量大、操作簡便等優(yōu)點，被廣泛應用于細胞分裂、分化、生理生化、遺傳變異、次生代謝產(chǎn)物合成等。缺點：通氣狀況不好，排泄物質易積累造成毒害或影響組織吸收。第32頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五第33頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五看護培養(yǎng)（nurseculture）Muir(1953)首創(chuàng)此法獲得煙草單細胞體系。優(yōu)點：簡便易行，效果好。缺點：不能在顯微鏡下追蹤細胞分裂、生長過程。第34頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五第35頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五微室培養(yǎng)(microchamberculture)在人工制造的無菌小室中，將一滴懸浮細胞液培養(yǎng)在少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖形成細胞團的方法。由Jones等在1960年設計的。優(yōu)點：可對培養(yǎng)細胞連續(xù)進行顯微觀察，了解一個細胞的生長、分裂、分化等過程缺點：培養(yǎng)基少，營養(yǎng)和水分難以保持，pH變動幅度大，培養(yǎng)細胞僅能短期分裂。細胞起始密度：30～80個/室。第36頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五雙層濾紙植板培養(yǎng)Horsch等（1980）建立培養(yǎng)皿培養(yǎng)基飼養(yǎng)細胞層培養(yǎng)細胞

看護濾紙轉移濾紙第37頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五植物細胞規(guī)模化培養(yǎng)意義規(guī)?；囵B(yǎng)體系的建立生物反應器規(guī)?；囵B(yǎng)的技術問題第38頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五意義應用培養(yǎng)細胞系統(tǒng)合成有用的天然產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、輕化工業(yè)等領域具有重要意義。目前有約25％的法定藥品來自植物，其有效成分均為次生產(chǎn)物。許多植物次生代謝產(chǎn)物是優(yōu)良的食品添加劑和名貴化妝品原料。有些是生物毒素的主要來源，可用于殺蟲、殺菌，而對環(huán)境和人畜無害，是理想的環(huán)保產(chǎn)品第39頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五部分代表性植物次生產(chǎn)物及其植物資源工業(yè)用途次生產(chǎn)物植物資源醫(yī)藥可待因罌粟薯蕷皂苷配基三角葉薯蕷奎寧金雞納樹地高辛狹葉毛地黃莨菪胺曼陀羅長春花堿長春花農(nóng)業(yè)化學除蟲菊酯除蟲菊食品，飲料留蘭香薄荷化妝品茉莉油茉莉花第40頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的技術要求 從工程的角度講必須要進一步研究和開發(fā)適宜于植物生長和生產(chǎn)的生物反應器，建立最佳的控制和調(diào)節(jié)系統(tǒng)。從培養(yǎng)技術方面講必須滿足以下三個條件：培養(yǎng)的細胞在遺傳上應是穩(wěn)定的，以得到產(chǎn)量恒定的產(chǎn)物。細胞生長速度快，短時間內(nèi)能生產(chǎn)較多產(chǎn)物產(chǎn)物不被迅速降解，最好能分泌到培養(yǎng)基中第41頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五植物細胞規(guī)模化培養(yǎng)體系的建立種子細胞選擇外植體高產(chǎn)細胞種子細胞增殖與放大培養(yǎng)大規(guī)模培養(yǎng)體系建立第42頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五種子細胞選擇外植體選擇植物類型：遺傳基礎。在確定生產(chǎn)某一種化合物以后，首先必須準確選擇那些能夠產(chǎn)生目的化合物的植物種類及品種或單株。組織器官：由于天然產(chǎn)物一般為次生代謝產(chǎn)物，而植物次生代謝產(chǎn)物的積累具有組織器官的特異性，因此，在起始細胞培養(yǎng)時盡量選擇自然狀態(tài)下產(chǎn)生天然產(chǎn)物的器官、組織作為外植體。第43頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五種子細胞選擇高產(chǎn)細胞系的篩選懸浮細胞系單細胞克隆種細胞增殖第44頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五種子細胞選擇直選法李志勇等（2002）直接從起始細胞中挑選不同細胞團建立了10個大蒜細胞懸浮系，比較研究顯示，不同懸浮細胞系的SOD合成能力最大差異可達5倍。適當增加選擇壓力，采用一些誘變的方法梅興國（2001）通過在培養(yǎng)基中添加1.6mM的L-Phe，篩選出了抗Phe的紅豆杉細胞懸浮系，其紫杉醇含量高于原型細胞3～5倍。第45頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五種子細胞增殖與放大培養(yǎng)目的準備材料提供技術參數(shù)過程搖瓶反應器第46頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五大規(guī)模培養(yǎng)體系的建立培養(yǎng)方式成批培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)方式的選擇根據(jù)次生產(chǎn)物積累而定，通常還根據(jù)不同要求進行改進。當細胞生長和產(chǎn)物合成需要不同的培養(yǎng)基時，就需要采用兩步法培養(yǎng)，先在細胞生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)大批量細胞，當細胞生長至合成產(chǎn)物的階段后，將其轉至產(chǎn)物合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在產(chǎn)物合成階段又可采用連續(xù)培養(yǎng)方式以延長細胞生產(chǎn)時間。第47頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五生物反應器類型及特點是指用于高等生物細胞批量化培養(yǎng)的裝置及其相應控制系統(tǒng)。適合植物細胞培養(yǎng)的反應器應該具有適宜的氧傳遞、良好的流動性和較低的剪切力。攪拌式氣動式固定化式其它—光照生物反應器，轉鼓式第48頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五反應器類型體積（L）培養(yǎng)植物種類攪拌式7，15D.carota胡蘿卜攪拌式20，15500N.tabacum煙草攪拌式5000C.roseus長春花螺旋攪拌式20C.blumei五彩蘇提升攪拌式2.5P.elliotii濕地松鼓泡式20，30，130P.ginseng人參鼓泡式65，1500N.tabacum煙草外環(huán)氣升式10，30，85C.roseus長春花導筒氣升式20，210D.lanata狹葉毛地黃轉鼓式1－4V.rosea長春花植物細胞培養(yǎng)生物反應器第49頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五攪拌式反應器第50頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五氣動式反應器又稱空氣提升式反應器特點：剪切力小，但攪拌不很均勻。

Flash第51頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五固定化反應器種類：包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物多采用瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽和聚丙烯酰胺等附著式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物多采用尼龍網(wǎng)、聚氨酯泡沫和中空纖維等。Alfermann等(1983)用氣升式系統(tǒng)，采用海藻鈣固定細胞成功地用30L和200L的反應器生產(chǎn)地高辛。Jose等(1983)進一步用中空纖維反應器培養(yǎng)胡蘿卜和碧東茄生產(chǎn)代謝產(chǎn)物酚類物質Flash第52頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五規(guī)?；囵B(yǎng)中有關工程技術問題懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)必須適應植物細胞特性細胞體積大。其平均直徑比細菌大幾十倍通常以2～200個細胞，直徑2mm大小的非均勻小細胞團形式存在?？辜羟心芰θ?。生長速度慢，周期長，培養(yǎng)基成分復雜，有利于微生物生長，因此在培養(yǎng)中維持無菌環(huán)境難度較大但又十分重要。第53頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五規(guī)?；囵B(yǎng)中有關工程技術問題培養(yǎng)液的流變特性－－粘度變化原因：細胞密度和細胞狀態(tài)的變化細胞密度：當?shù)陀?g/L時(煙草細胞)，培養(yǎng)液粘度基本不變，而高于此值時，粘度增加。細胞狀態(tài)：培養(yǎng)密度在10g/L時，大細胞團(長春花細胞)的營養(yǎng)液表觀粘度明顯大于小細胞團的表觀粘度。第54頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五規(guī)?；囵B(yǎng)中有關工程技術問題氧氣含量調(diào)節(jié)KLa（氧的傳遞系數(shù)，Nv=Kla(C*-C)

）： 如在4L的氣升式反應器中進行長春花細胞培養(yǎng)時，KLa在20h-1左右時。細胞生長與次生產(chǎn)物合成維持在良好狀態(tài)； 在15L通風式反應器中培養(yǎng)的煙草細胞，當KLa在5~10h-1的范圍內(nèi)，生物量和代謝產(chǎn)物隨KLa增加而增加。溶氧濃度：毛地黃細胞培養(yǎng)，當培養(yǎng)基氧濃度從10％飽和度上升至30％，細胞生長速率從0.15d-1上升至0.20d-1，如果繼續(xù)上升至40％，細胞生長速率反而下降至0.17d-1。第55頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五規(guī)?；囵B(yǎng)中有關工程技術問題CO2調(diào)節(jié)在通氣過程中，混入2％～4％的CO2能消除高通氣速率對長春花細胞生長和次生代謝產(chǎn)物合成的不利影響。第56頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五規(guī)?；囵B(yǎng)中有關工程技術問題泡沫和表面黏附性植物細胞培養(yǎng)中易產(chǎn)生泡沫，且覆蓋蛋白質和粘多糖，細胞極易被包埋在其中從循環(huán)的培養(yǎng)液中帶出來，形成非均相培養(yǎng)而影響培養(yǎng)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和生產(chǎn)率。消除方法化學消泡：天然油脂、高級醇類、聚醚類機械消泡第57頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五規(guī)?；囵B(yǎng)中有關工程技術問題剪切力對植物細胞的影響適當?shù)募羟辛梢栽黾优囵B(yǎng)系統(tǒng)的通氣性保持良好的混合狀態(tài)和分散性提高細胞生物量和次生產(chǎn)物量過高的剪切力導致細胞團變小、細胞破損來源攪拌槳形式、攪拌速度、通氣速率第58頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五培養(yǎng)細胞的次生代謝及產(chǎn)物積累植物次生代謝（secondarymetabolism）1891年由Kossel提出，非細胞生命活動所必需。植物次生代謝產(chǎn)物(secondarymetabolites)

的類型培養(yǎng)下的植物細胞次生代謝產(chǎn)物積累特性提高細胞次生產(chǎn)物量的途徑第59頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五植物次生產(chǎn)物的主要類型酚類化合物－黃酮類、醌類和簡單酚類黃酮類： 結構：C6-C3-C6

生物合成前體：苯丙氨酸和丙二酸單酰輔酶A。 功效：為治理心血管疾病和高血壓的藥物成分。醌類化合物： 結構：由苯式多環(huán)芳烴衍生的芳香二氧化合物， 種類：苯醌、萘醌。 功效：呈現(xiàn)顏色，具有抗菌、抗癌作用。第60頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五萜類化合物組成單元：異戊二烯合成途徑：異戊二烯途徑種類：單萜、倍半萜、二萜、三萜以及甾類化合物。萜類化合物已超過2萬種。單萜和倍半萜是植物揮發(fā)油和香料的主要成分，有的具有重要的藥用價值。倍半萜：抗瘧疾藥物青蒿素。二萜生物堿：抗癌藥物紫杉醇。三萜皂甙：人參皂甙。甾體皂甙：薯蕷皂甙。第61頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五含氮化合物包括：生物堿、胺類、非蛋白質氨基酸和生氰苷種類：5500種以上分布：雙子葉植物生物堿的作用：藥用，植物抗毒素。目前對生物合成途徑研究比較清楚的有：煙草的煙堿(nicotine)、毒藜堿(anabasine)和吡咯生物堿

(pyrrolizidinealkaloid)，毛茛科植物的小檗堿(berberine)，曼陀羅屬植物的莨菪堿(tropine)和東莨菪堿(scopolamine)。第62頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五培養(yǎng)條件下植物細胞次生產(chǎn)物積累的特性生長偶聯(lián)型產(chǎn)物合成與細胞生長成正比，如長春花中長春花堿的合成、煙草細胞煙堿合成、薯蕷中薯蕷皂甙的合成。中間型產(chǎn)物僅在細胞生長下降時合成，細胞處于指數(shù)生長期或停止生長產(chǎn)物都不合成，蒽醌類物質合成的植物細胞、莨菪烷類合成的植物細胞等屬于此類型。非生長偶聯(lián)型產(chǎn)物合成在細胞生長停止以后。如紫草寧。第63頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五提高細胞次生產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑選擇適宜的起始材料－－種類、部位梔子（Gardeniajasminoides）胚軸銀杏 子葉當歸 根紅豆杉幼嫩的莖茜草葉柄培養(yǎng)基既要滿足植物細胞的生物量增長，還要滿足細胞合成及積累次生產(chǎn)物的需要。第64頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五提高細胞次生產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑前體（precursor）的應用作用：提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量。選擇對某一目的產(chǎn)物來講可能有多種前體物質同一種前體物質又可能有多條代謝路徑從而形成不同的代謝產(chǎn)物。針對其合成的關鍵生化過程進行前體物質添加。多數(shù)前體物質對細胞生長本身并不十分有力注意前體濃度。過量也可能產(chǎn)生反饋抑制。第65頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五人參皂甙的生物合成途徑乙酰輔酶A

甲羥戊酸（MVA）反式角鯊烯（C30）

2,3-氧化鯊烯環(huán)阿屯醇達瑪烯二醇香樹素植物甾醇人參皂甙Rg1人參皂甙Ro第66頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五提高細胞次生產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑激發(fā)子（elicitor）的應用也稱誘導子，是指能夠誘導植物細胞中某些反應，并形成細胞特征性自身反應的分子。非生物激發(fā)子，如輻射、金屬離子、茉莉酸類似物（茉莉酸甲酯，M-JA）等。生物激發(fā)子外源激發(fā)子：菌絲、微生物機體提取物及微生物產(chǎn)生的多糖、蛋白和脂肪酸等內(nèi)源性激發(fā)子：來源于植物結構的化合物。如降解細胞壁的酶、細胞壁碎片、寡聚糖等有機分子。第67頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五提高細胞次生產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑激發(fā)子促進次生產(chǎn)物積累與其種類和濃度有關激發(fā)子對南方紅豆杉細胞培養(yǎng)合成紫杉醇的影響激發(fā)子適宜濃度（mM）與對照比提高產(chǎn)物效率（倍）M-JA0.17.0花生四烯酸0.16.5硝酸柿胺1.05.5水楊酸0.14.5硝酸鹽0.013.0第68頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五M-JAMg/L0.00.110.01.0第69頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五提高細胞次生產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑培養(yǎng)技術的選擇包括反應器的選擇和培養(yǎng)方式的選擇培養(yǎng)技術的選擇不僅要考慮細胞生長和產(chǎn)物積累的效率，同時還應考慮技術基礎和生產(chǎn)成本。第70頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五提高細胞次生產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑兩相培養(yǎng)(two—phaseculture)指在植物細胞培養(yǎng)體系中加入水溶性或脂溶性的有機化合物，或者是具有吸附作用的多聚化合物，使培養(yǎng)體系由于分配系數(shù)不同而形成上、下兩相，細胞在其中一相中生長并合成次生代謝物，這些次生代謝物又通過主動或被動運輸?shù)姆绞结尫诺桨?，并被另一相所吸附。?1頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五兩相培養(yǎng)組成：培養(yǎng)相和提取相組成類型：液-液系統(tǒng)和液-固系統(tǒng)液-液系統(tǒng)：分離相主要使用液體石蠟、烷類化合物。分離相和培養(yǎng)基的化學性質和比重不同。液-固系統(tǒng)：是指提取相以固態(tài)形式存在于系統(tǒng)中，主要通過吸附分離目的產(chǎn)物，目前使用的主要有活性炭、硅酸鎂載體、沸石、蠶絲以及樹脂。第72頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五紅豆杉細胞兩相培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇實驗材料：東北紅豆杉細胞系培養(yǎng)基：第一相：B5培養(yǎng)基，第二相：5％(v/v)的松油醇，產(chǎn)物釋放劑：5％(v/v)二甲基亞砜。接種量:10g(鮮重)/100ml培養(yǎng)基/250mL三角燒瓶。培養(yǎng)條件：25℃，120rpm，黑暗培養(yǎng)。第73頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五■細胞干重；▲紫杉醇產(chǎn)量；兩相系統(tǒng)——；單相系統(tǒng)－－

第二相的加入，使得紫杉醇產(chǎn)量提高到30.19mg/L，比對照增加103%；63％的紫杉醇從胞內(nèi)的釋放出來，其中有75％轉移至有機相。第74頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五提高細胞次生產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑兩步培養(yǎng)在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞在生產(chǎn)培養(yǎng)基中積累產(chǎn)物第75頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五提高細胞次生產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑器官組織在反應器中的培養(yǎng)技術發(fā)狀根（毛狀根，hairyroot）培養(yǎng)生產(chǎn)次生產(chǎn)物，已在人參、丹參、紫草、顛茄和黃芪等植物中進行了探索性研究，并取得良好進展。冠癭組織培養(yǎng)用于次生產(chǎn)物的生產(chǎn)。第76頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五第77頁，共87頁，2023年，2月20日，星期五毛狀根毛狀根(hairyroots)是發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacteriumrhizogenes）感染雙子葉植物后，其Ri質粒上的T-DNA片斷整合進植物細胞核基因組中誘導產(chǎn)生的一種特殊表現(xiàn)型。毛狀根可以不依賴激素快速生長，根多叢生，多分枝，多根毛，無向地性。