牙周病分子生物學

牙周病分子生物學第1頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日一、概述二、牙周病的分子致病

1.微生物的毒力因子

2.宿主因子三、核酸雜交法檢測牙周病有關(guān)細菌第2頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日定義（Definition）

分子生物學技術(shù)研究與牙周病密切相關(guān)生物大分子（蛋白、核酸）的一門新興學科──前瞻性、交叉性。第3頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日研究內(nèi)容宿主基因水平或分子水平闡明牙周病發(fā)病機制和流行規(guī)律牙周病原菌的蛋白和核酸(DNA、RNA)分子結(jié)構(gòu)──追蹤病原菌傳播途徑、發(fā)現(xiàn)病原體變異。牙周病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律與微觀的病原菌或宿主基因特征聯(lián)系起來──牙周病臨床的分子診斷、分子指征、分子預(yù)后乃至基因治療第4頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日牙周病的分子致病MolecularPathogenesisofPeriodontalDisease第5頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日微生物的毒力因子

研究牙周病原菌的蛋白和核酸分子結(jié)構(gòu)，評價毒力因子的作用。宿主因子

研究細胞因子和遺傳因子的作用。第6頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日微生物的毒力因子MicrobialViralenceFactors第7頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日內(nèi)毒素(lipopolysaccharide,LPS)

G-菌胞壁外膜的脂多糖成分（磷脂－多糖－蛋白質(zhì)）。第8頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日十二烷基磺酸鈉－聚丙烯凝膠電泳

SDSgel銀染色

Silverstain內(nèi)毒素－免疫印跡

LPS-immuno-blotting第9頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日牙齦素(gingipains)最初稱為胰酶樣蛋白酶(trypsin-likeprotease,TLP),又稱卟啉素(porphypains)存在于Pg的外膜、膜泡或胞外的一組蛋白酶超速離心(10000g×20min,4℃)提取胞外膜泡——高凝膠液相色譜法(GF-HPLC)分離純化。第10頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日精氨酸－牙齦素(Arginine-gingipains,Rgps):

特異性切斷蛋白質(zhì)與精氨酸殘基結(jié)合的肽段，由rgpA(前肽區(qū)、蛋白酶區(qū)、粘附區(qū))和rgpB(無粘附區(qū))二個基因編碼賴氨酸－牙齦素(Lysine-gingipain,Kgp):

特異性切斷蛋白質(zhì)與賴氨酸殘基結(jié)合的肽段，由kgp(前肽區(qū)、蛋白酶區(qū)、粘附區(qū))單個基因編碼第11頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日Pg同源突變株的性狀改變

突變株 性狀改變rgpA 粘附能力部分喪失

降解I型膠原能力喪失rgpA、rgpB 抑制中性粒細胞功能喪失

菌毛缺失kgp 菌落無法變黑(影響利用血紅蛋白)rgpA、rgpB、kgp 胞外蛋白水解活性喪失第12頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日牙齦素功能有助于粘附定植：對纖維蛋白的親和力。毒性作用：破壞宿主組織細胞的活性成分(蛋白、多肽)、降解膠原；促進緩激肽釋放，提高血管通滲性，增加齦溝液量，組織水腫。幫助細胞生長：將組織蛋白質(zhì)降解為短肽鏈，擴大細菌營養(yǎng)攝取范圍，為細菌生長和毒力發(fā)揮提供養(yǎng)分。干擾宿主免疫反應(yīng)：影響中性白細胞功能，降解宿主細胞的LPS受體CD14，降解細胞因子IL-1β、IL-6、IL-8及TNFα等。第13頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日菌毛亞單位蛋白結(jié)構(gòu)基因(fimA)

粘附有關(guān)的毒力因子──纖毛素(fimbrilin)

粘附素(adhesin)血細胞凝集素(hemagglutinin)第14頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日1988年Dickinson等首先獲得含編碼Pg纖毛素基因的克隆質(zhì)粒PUC13Bg12.1，該基因為染色體上的單拷貝基因，它的氨基酸序列與其他菌毛無同源性，可利用該特異基因作探針鑒定Pg，可進一步研究Pg菌毛的致病作用。第15頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日膠原酶基因(prtc)

Pg的膠原酶能降解I型膠原，破壞牙周組織附著。已測知表達膠原酶活性的prtc基因序列，它存在于Pg的三種主要血清型中，編碼1個37501.38μ蛋白質(zhì)。第16頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日白細胞毒素基因(lktA、B、C、D)

Aa是口腔中唯一能產(chǎn)生白細胞毒素(leukotoxin,LKT)的細菌，白細胞毒素僅能殺死人或靈長類的多形核白細胞、單核細胞和巨噬細胞，抑制破壞宿主的免疫防御機制?，F(xiàn)已克隆和測知lktA的序列，且在受體菌中得到表達。編碼毒素結(jié)構(gòu)，激活白細胞毒素。第17頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日第18頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日第19頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日第20頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日第21頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日第22頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日宿主因子HostFactors第23頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日細胞因子(cytokines)

細胞生物學 細胞因子 cytokine(CK)免疫學 淋巴因子 lymphokine

interleukincytikine(LI)血液學 集落刺激因子 colonystimulation

factor(CSF)分子生物學 生長因子 growthfactors(GFS)第24頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日活化的免疫細胞和某些基質(zhì)細胞分泌的微量生物活性物質(zhì)。本質(zhì)是蛋白質(zhì)或多肽。在體內(nèi)發(fā)揮廣泛的生物學作用，與生長、分化、免疫、腫瘤、造血和創(chuàng)傷愈合等多種生理、病理狀態(tài)有關(guān)。正常情況下發(fā)揮廣泛生理功能，一旦失調(diào)異常分泌，又與疾病相關(guān)。第25頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日目前發(fā)現(xiàn)的細胞因子有10余族，每族又有若干亞族，共100多種，功能大多已闡明，部分已克隆成功，其基因定位、結(jié)構(gòu)與受體結(jié)合機制等均有大量研究。第26頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日白介素(1-18型糖蛋白)(interleukin,IL)腫瘤壞死因子(tumornocrosisfactor,TNF)粘附分子(adhesionmolecule,AM)干擾素(interferan,IFN)轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforminggrowthfactor-β,TGF-β)成纖維細胞生長因子(fibroblastgrowthfactors,FGFs)第27頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日細胞因子作用特點特異性(自分泌、旁分泌作用)

對靶細胞存在不同程度特異性。多樣性、多功能性

對不同靶細胞、不同濃度或不同生理狀態(tài)靶細胞可有不同作用。整體性

對細胞、組織的調(diào)控不是僅靠1種，而是多因子參與及多步驟反應(yīng)，由幾種因子協(xié)同或拮抗配合形成網(wǎng)絡(luò)(network)發(fā)揮作用。第28頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日遺傳因子(geneticfactors)

基因水平闡明牙周病發(fā)生、發(fā)展和流行規(guī)律。第29頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日細菌是引發(fā)牙周炎必不可少的因素，但不是唯一因素，宿主也起重要作用。單純遺傳能為患嚴重牙周炎提供50%以上危險性，如：白細胞減少癥白細胞粘附缺陷病Down綜合征掌跖角化－牙周破壞綜合征第30頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日牙周病的基因研究6號染色體組織相容性位點變異

產(chǎn)生IgG2能力降低，IgG2是保護性的，能調(diào)理識別細菌，以利吞噬殺死。染色體1qH131殘基多態(tài)性

組氨酸純合子吞噬細胞識別IgG2的hFcrRⅡa

受體親和力高(IgG包裹的致病

菌易被吞噬清除)

精氨酸純合子受體親和力低

組/精氨酸雜合子親和力居中第31頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日染色體2q13的IL-1β基因多態(tài)性

產(chǎn)生的IL-1β約為該基因陰性的4倍，40歲后患重度牙周炎的可能性是陰性個體的20倍6號染色體TNF-α基因多態(tài)性

產(chǎn)生大量TNF-α，增強對感染的反應(yīng)性第32頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日第33頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日第34頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日第35頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日第36頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日核酸雜交法

(molecularhybridization)

檢測牙周病相關(guān)細菌第37頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日概述第38頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日細菌分類學四個水平細菌形態(tài)和行為水平：顯微結(jié)構(gòu)、運動性、酶、生化及營養(yǎng)需要等細菌組分水平：胞壁組分、脂類、細胞色素及噬菌體系分析蛋白質(zhì)水平：氨基酸系列、可溶性蛋白凝膠電泳及血清學基因水平：G＋Cmol%，DNA-DNA雜交，質(zhì)粒及遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)導(dǎo)第39頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日牙周病有關(guān)的特殊細菌證據(jù)充分的致病菌 中等證據(jù)的致病菌伴放線放線桿菌Aa 直腸彎曲菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans) (campylobacterrectus)牙齦卟啉單胞菌Pg 纏結(jié)優(yōu)桿菌(Porphyromonasgingivalis) (Eubacteriumnodatum)福塞似桿菌Bf 具核梭桿菌Fn (Bacteroidesforsythus) (Fusobacteruimnucleatum) 中間普氏菌Pi (prevotellaintermedia) 微小消化鏈球菌Pm (Peptostreptocoscusmicros) 中間鏈球菌群 (Intermediusstreptococci) 牙密螺旋體Td (Treponemadenticola)第40頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日常規(guī)方法不能鑒定牙周大量標本細菌的原因：大多為厭氧菌培養(yǎng)條件要求高鑒定繁雜每牙周袋至少取2個區(qū)樣本每樣本至少分離10株以上可疑菌第41頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日原理

所有生物體都以DNA形式通過4種堿基順序來貯存遺傳信息，同種生物含相同的DNA序列，生物種差別越大，DNA堿基順序差別越大。鳥嘌呤腺嘌呤胞嘧啶胸腺嘧啶G＋A＝C＋TCT示蹤劑標記的特定堿基序列的核酸片段，能和互補堿基配對、特異地結(jié)合。第42頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日4種核苷酸組成DNA2條互補鏈繞成雙螺旋結(jié)構(gòu)(氫鍵)－嚴格配對規(guī)律牢固結(jié)合，使DNA具遺傳信息貯存庫功能（恒定性、專一性）DNA上相鄰3個核苷酸編排1個密碼子，決定1個特定氨基酸DNA核苷酸順序決定蛋白質(zhì)的氨基酸順序－決定細胞結(jié)構(gòu)和功能第43頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日核酸探針(probe)定義能與特定核酸序列發(fā)生特異性互補的已知核酸片段，用于檢測待測樣品中是否存在與探針相同或相近的DNA序列。第44頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日牙周病相關(guān)菌的核酸探針是牙周病相關(guān)菌染色體DNA上的有種屬特異性的一小段DNA（或RNA）分子的堿基序列，為帶標記的單股核苷酸，能以互補方式與相應(yīng)DNA鍵結(jié)合。用已知細菌的DNA探針去探測未知細菌的DNA，若能雜交形成DNA雙鏈則認為該菌為與探針相同的菌。第45頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日放射性同位素標記：如32P、35S、3H

靈敏度高

理化影響小

污染環(huán)境使用某些半抗原：如生物素、地高辛、熒光素

特異性較低

敏感性較低第46頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日合成小段單鏈DNA方法日臻完善

寡核苷酸的化學合成可由高度自動化的儀器完成核酸雜交技術(shù)得到發(fā)展第47頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日探針類型全基因探針：屬內(nèi)代表菌株分離出DNA并進行標記，制備簡便，特異性較差，有時可與相近屬菌種發(fā)生雜交克隆DNA片段探針

隨意探針：代表菌DNA用限制性內(nèi)切酶酶切，隨意克隆一些片段，找到僅能與本屬內(nèi)菌株雜交的DNA片段

特異性高，但需大量試驗方能驗證其特異性特定探針：克隆屬內(nèi)代表菌特異性蛋白或毒力因子的基因，從該基因中取一段作為探針，檢驗致病菌具獨特作用，但需對其特異性、敏感性驗證第48頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日探針的驗證特異性驗證：

必須與50種菌屬的80~300株菌株進行雜交

必須與相近細菌屬中的大量菌間排除“交叉雜交”

如伴放線放線桿菌－嗜血桿菌屬菌株敏感性驗證：

必須與同屬各地區(qū)分離的100株以上菌種進行雜交

如核酸雜交結(jié)果與生化反應(yīng)鑒定結(jié)果有出入，應(yīng)進一步驗證生化結(jié)果。第49頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日寡核苷酸(oligonucleotide)探針序列細菌 探針名稱 序列Aa Aa-2 CTTCGGGCACYAGGGCTAAACCCCPg Pg-1 CAATACTCGTATCGCCCGTTATTC Pg-3 CTGTGGAATCTTGACGGTATATCG Pg-4 GTATAAAAGAAGTTTAAAYCCTT Pg-5 CCGATGCTTATTCTTACGGTACAT Pg-6 CCTTAGGACAGTCTTCCTTCACGCBf Bf-2 CGTATCTCATTTTATTCCCCTGTA Bf-4 CTGTAGAGCTTACACTATATCGCA

Pi Pi-1 GGTCCTTATTCGAAGGGTAAATGC Pi-2 CCCTAGGYGCGCTCCTCGCGGTTA第50頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日特定DNA片段探針序列（基因探針）細菌 靶基因序列 長度Aa Lkta 5’-CAGCAAGCTGCACAGTTTGCAAA-3’ 238bp 5’-CATTAGTTAATGCCGGGCCGTCT-3’ 16SrDNA 5’-GCTAATACCGCGTAGAGTCGG-3’ 443bp 5’-ATTTCACCCTCACTTAAAGGT-3’16SrDNA 5’-CTCAGAGATGGTTTGTGCC-3’ 273bp 5’-AGATTCACTCCCCATCGCTG-3’ Pg FimA 5’-ATAATGGAGAACAGCAGGAA-3’ 131bp 5’-TCTTGCCAACCAGTTCCATTGC-3’ PrtC 5’-ACAATCCACGAGACCATC-3’ 584bp 5’-TTCAGCCACACCGAGACG-3’ 16SrDNA 5’-AGGCAGCTTGCCATACTGCG-3’ 404bp 5’-ACTGTTAGCAACTACCGATGT-3’

第51頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日續(xù)表細菌 靶基因序列 長度Pg 16SrRNA 5’-GCGTATGCAACTTGCCTTAC-3’ 518bp 5’-GTTTCAACGGCAGGCTGAAC-3’ Fn 5047 5’-CAAATGCTTGTGTCAATAATACT-3’ 0.5Kb

5’-TTTAGAAGAAATGGTAGAATAAT-3’ 50590 5’-ATTGTGGCTAAAATTASTAGTT-3’ 1Kb 5’-ACCCTCACTTTGAGGATTATAG-3’Pi18SrRNA 5’-CCTAATACCCGATGTCCACA-3’ 855bp 5’-AAGGAGTCAACATCTCTGTATCC-3’ Td TdpA 5’-AAGGCGGTAGAGCCGCTCA-3’ 311bp 5’-AGCCGCTGTCGAAAAGCCA-3’第52頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日PCR擴增16SrRNA基因－病原菌檢測遺傳學分類rRNA是細胞中最多的一種RHA，很多分子組成核蛋白體(核糖體)，rRNA分子大小一般用超速離心的沉降系數(shù)S表示，S越大，分子也越大。第53頁，共62頁，2023年，2月20日，星期日16SrRNA基因：細菌染色體上編碼rRNA相對應(yīng)的DNA序列保守區(qū)－穩(wěn)定性（細菌共有，稱“分子化石”）可變區(qū)－特異性（保守區(qū)間有V1－V10可變區(qū)，含種屬差異信息，如出現(xiàn)3個堿基以上差異，便可判