4 基因工程的操作過程

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4基因工程的操作過程

ADNA的體外重組(切、接)B重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增(轉(zhuǎn)、增)C轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定(檢)

4基因工程的操作過程切接轉(zhuǎn)

增檢

4基因工程的操作過程ADNA的體外重組(切與接)同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接重組率

同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接5'GAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAA5'5'AATTCGGCTTAA5'5'AATTCGGAATTCCTTAAG5'

5'

退火5'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGT4-DNAligase5'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG

5'

5'

5'5'

GAATTCCTTAAG

GAATTCCTTAAG

同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接5'BclI5'TACTAG5'5'GATCATTGATCAACTAGT5'

5'

GGATCCCCTAGGBamHI5'GATCCG

GGATCCCCTAGG

5'

5'

GCCTAG5'

退火5'5'TGATCCACTAGGTGATCCACTAGGT4-DNAligase5'5'TGATCCACTAGGGGATCACCTAGTGGATCACCTAGTGGATCACCTAGT

5'

5'

5'5'

TGATCCACTAGG

GGATCACCTAGT

重組率重組率的定義重組率=含有外源DNA的重組分子數(shù)/載體分子總數(shù)在常規(guī)試驗(yàn)條件下，重組率一般為25-75%

重組率是衡量連接反應(yīng)效率的重要指標(biāo)，較高的重組率可以大大簡(jiǎn)化DNA重組的后續(xù)操作。

重組率提高重組率的方法提高外源DNA片段與載體的分子比：5:1-10:1

載體DNA分子在連接前先除去磷酸基團(tuán)：5'GAATTCCTTAAGEcoRI5'pAATTCGGCTTAAp5'GAATTCCTTAAG5'

堿性磷酸單酯酶5'GCTTAAOH5'

堿性磷酸單酯酶5'HOAATTCG

5'

退火HOOH5'G-A-A-T-T-CC-T-T-A-AGHOOHGA-A-T-T-CC-T-T-A-A-G

5'

4基因工程的操作過程B重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增(轉(zhuǎn)與增)轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)轉(zhuǎn)化率

轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增

轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細(xì)菌(如大腸桿菌等),1970年建立此技術(shù)，其原理是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，細(xì)菌細(xì)胞此時(shí)的狀態(tài)叫做感受態(tài)

轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備：100ml菌體培養(yǎng)至OD600=0.5,離心收集菌體用10ml冰冷的20mMCaCl2溶液懸浮菌體，離心收集菌體用1ml冰冷的100mMCaCl2溶液懸浮菌體冰浴放置12-24小時(shí)，備用

轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：取100ml感受態(tài)細(xì)胞，參與相當(dāng)于50ng載體的重組DNA連接液，混勻冰浴放置半小時(shí)在42℃保溫2分鐘(熱脈沖)快速將轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰浴中放置1-2分鐘參與1ml新鮮培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)1小時(shí)(擴(kuò)增)涂在適合的固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選

轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化革蘭氏陽性細(xì)菌(

如枯草桿菌、鏈霉菌等)接納外源DNA的主要屏障是細(xì)胞壁，因而這類細(xì)菌尋常采用原生質(zhì)體(細(xì)胞去壁后的形態(tài))轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)移質(zhì)粒或重組DNA分子酵母菌、霉菌、植物細(xì)胞也可用原生質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)電穿孔轉(zhuǎn)化將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；駾NA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場(chǎng)。在強(qiáng)大電場(chǎng)的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡(jiǎn)單，而且?guī)缀鯇?duì)所有含細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的受體細(xì)胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率區(qū)別很大同樣的原理，電穿孔法也可用于質(zhì)粒消除試驗(yàn)

轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的定義轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標(biāo)，其定義為：每微克載體DNA在最正確轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù)。由于在一般的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)規(guī)模下，每個(gè)受體細(xì)胞最多只能接受一個(gè)載體分子，因此轉(zhuǎn)化率的定義也可以表征為：每微克載體DNA轉(zhuǎn)化后，受體細(xì)胞接納DNA的個(gè)數(shù)，即克隆數(shù)(在篩選時(shí)，未接納載體或重組子的

受體細(xì)胞不長)

轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的定義例如，pUC18對(duì)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為108,即每微克pUC18中只有108個(gè)分子能進(jìn)入受體細(xì)胞。一微克pUC18共有3.4X1011個(gè)分子(6.02X1017/2686X660),也就是說，每3400個(gè)pUC18分子才有一個(gè)分子進(jìn)入受體細(xì)胞另一方面，在實(shí)際操作過程中，轉(zhuǎn)化一微克pUC18共需2ml感受態(tài)細(xì)胞，大約含有2X1010個(gè)大腸桿菌細(xì)胞，也就是說，每200個(gè)細(xì)胞只有一個(gè)細(xì)胞能接納pUC18DNA

轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的用途利用轉(zhuǎn)化率和重組率等參數(shù)可以幫助設(shè)計(jì)DNA重組試驗(yàn)規(guī)模例如，某一DNA重組試驗(yàn)的重組率為20%,轉(zhuǎn)化率為107/mg載體，經(jīng)切接處理后的載體轉(zhuǎn)化率比自然的載體低100倍，欲獲得104個(gè)重組克隆，需投入多少載體DNA進(jìn)行重組試驗(yàn)？若重組率為100%,則轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生104個(gè)重組克隆需要：104/107X10-2=0.1mg載體DNA考慮到試驗(yàn)系統(tǒng)的重組率為20%,所以實(shí)際投入載體應(yīng)為：0.1/20%=0.5mg載體DNA

載體投入量確定后，外源DNA的投入量即可按10∶1的要求算出(5mg),甚至還可以估算需要涂布多少塊平板進(jìn)行篩選

轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的影響因素載體及DNA重組分子方面：載體本身的性質(zhì)：不同的載體轉(zhuǎn)化同一株受體細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率不同載體的空間構(gòu)象：質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高，經(jīng)酶切連接操作后的載體由于空間構(gòu)象難以恢復(fù)，其轉(zhuǎn)化率一般要比新制備的

超螺旋質(zhì)粒低兩個(gè)數(shù)量級(jí)插入片段的大?。簩?duì)質(zhì)粒載體而言，插入片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低

轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的影響因素受體細(xì)胞方面：受體細(xì)胞必需與載體相匹配，例如：pBR322轉(zhuǎn)化大

腸桿菌JM83株，轉(zhuǎn)化率很低；但對(duì)

大腸桿菌ED8767株的轉(zhuǎn)化率則較高

轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的影響因素轉(zhuǎn)化方法方面：受體細(xì)胞的預(yù)處理：影響最大供受體的比例：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化方法：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化106-107/mgDNA105-106/mgDNA0.1ml感受態(tài)細(xì)胞109個(gè)原生質(zhì)體50ngDNA50ngDNA

l-DNA轉(zhuǎn)染電穿孔轉(zhuǎn)化

107-108/mgDNA106-109/mgDNA

轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增擴(kuò)增操作轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增操作是指轉(zhuǎn)化完成之后細(xì)胞的短時(shí)間培養(yǎng)。在試驗(yàn)時(shí)，擴(kuò)