分子生物學(xué)研究法

分子生物學(xué)基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白質(zhì)操作技術(shù)

第五章

分子生物學(xué)研究法扉頁：當(dāng)你進入實驗室時，要像脫去外衣那樣放下你的想象力，因為實驗操作中不能有一丁點兒的想象，否則，你對事物的觀察就會受影響；當(dāng)你翻開書本的時候，你又必須盡可能展開想象的“翅膀”，否則，你就不可能走在別人的前面。分子生物學(xué)研究法RNA基本操作技術(shù)真核生物基因組DNA龐大，有大量重復(fù)序列，很難直接分離得到靶基因片段。而cDNA來自反轉(zhuǎn)錄的mRNA，無冗余序列，通過篩選cDNA文庫，可較快地分離到相關(guān)基因。分子生物學(xué)研究法5.3RNA基本操作技術(shù)5.3.1總RNA的提取5.3.2mRNA的純化5.3.3cDNA的合成5.3.4cDNA文庫的構(gòu)建5.3.5基因文庫的篩選分子生物學(xué)研究法5.3.1總RNA的提取細胞中的總RNA包括：mRNA1%~5%rRNA80%~85%tRNAsRNA15%~20%分子生物學(xué)研究法Trizol總RNA提取試劑

TIANGENrRNA電泳后的三條特征性條帶28S、18S、5S(特別是28S和18S特征性條帶)是鑒定總RNA純度和完整性的重要參數(shù)。分子生物學(xué)研究法RNA的抽提方法1.實驗室常用方法：異硫氰酸胍－苯酚抽提法Trizol試劑：苯酚和異硫氰酸胍組成，可迅速破壞細胞結(jié)構(gòu)，釋放細胞質(zhì)及細胞核中的RNA，并使核糖體蛋白與RNA分子分離，還能保證RNA的完整。

Trizol提取步驟：首先在液氮中研磨材料，勻漿，加入trizol試劑，再加入氯仿抽提，分離水相，異丙醇沉淀。分子生物學(xué)研究法RNAExtractionbyTRIzol分子生物學(xué)研究法使用BioSpcetrometer分光光度計進行快速檢測核酸分子生物學(xué)研究法mRNAExtractionfromCellCulture分子生物學(xué)研究法mRNAExtractionfromTissue分子生物學(xué)研究法2.硅膠膜純化柱法將含有目的RNA的細胞破碎液通過該柱，RNA吸附在硅膠膜上，然后在低鹽濃度下可從硅膠上直接洗脫RNA。分子生物學(xué)研究法RNA的濃度和純度的判斷：可通過測定其OD260和OD280OD260＝1時，相當(dāng)于濃度為40μg/mL，當(dāng)OD260/OD280＝1.8～2.0時，說明RNA純度較好。分子生物學(xué)研究法5.32.mRNA的純化寡聚（dT）－纖維素柱色譜法：利用mRNA3’端含有PolyA+的特點，當(dāng)RNA流經(jīng)寡聚dT纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異性地結(jié)合在柱上，再用低鹽溶液或蒸餾水洗脫mRNA。經(jīng)過兩次此柱可得到較高純度的mRNA.分子生物學(xué)研究法分子生物學(xué)研究法PromegaPolyATtractmRNA分離系統(tǒng)分離多聚(A)mRNA。將用生物素標(biāo)記的寡聚(dT)引物與細胞總RNA共溫育，加入與微磁球相連的抗生物素蛋白，用磁場吸附通過寡聚(dT)引物與抗生物素蛋白及強力微磁球相連的mRNA。分子生物學(xué)研究法圖5-14PolyATtractmRNA的分離純化過程簡圖。分子生物學(xué)研究法每個OligotexKit包括用于結(jié)合polyA+mRNA的Oligotex樹脂，和用于洗滌、洗脫結(jié)合的mRNA的離心柱。OligotexmRNAKits可從總RNA中純化mRNA，回收polyA+體外轉(zhuǎn)錄子。OligotexDirectmRNAKits可從細胞和組織中純化mRNA。mRNAExtractionfromTotalRNA分子生物學(xué)研究法5.3.3cDNA的合成cDNA（complementaryDNA）：在體外以mRNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶合成的一段雙鏈DNA。分子生物學(xué)研究法圖5-15cDNA合成過程示意圖。第一鏈cDNA的合成：以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，由反轉(zhuǎn)錄酶催化，需引物（常用oligodT）。第二鏈cDNA的合成：以第一鏈為模板，由DNA聚合酶催化。分子生物學(xué)研究法圖5-16cDNA合成中的分子修飾。分子生物學(xué)研究法cDNA的合成分子生物學(xué)研究法5.3.4cDNA文庫的構(gòu)建cDNA文庫：是指將某種生物體基因組轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA片段分別與克隆載體重組，儲存于某種受體菌中，該群體就稱該生物基因組的cDNA文庫。分子生物學(xué)研究法構(gòu)建cDNA文庫的基本程序：①mRNA的提取和純化。②合成cDNA第一鏈。③將mRNA-cDNA雜交分子轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈cDNA分子。④將雙鏈cDNA重組到噬菌體載體或質(zhì)粒載體上。⑤將重組子體外包裝成具有感染力的噬菌體顆粒導(dǎo)入到大腸桿菌寄主細胞中增殖。分子生物學(xué)研究法構(gòu)建基因組文庫的基本程序：分子生物學(xué)研究法構(gòu)建基因組文庫的基本程序：分子生物學(xué)研究法構(gòu)建基因組文庫的基本程序：分子生物學(xué)研究法基因文庫的建立分子生物學(xué)研究法基因組DNA文庫cDNA文庫基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較分子生物學(xué)研究法基因組文庫與cDNA文庫的差別基因組文庫中包含了所有基因，而cDNA文庫只包含表達的基因，缺乏內(nèi)含子和調(diào)控序列，在研究基因結(jié)構(gòu)時用處不大cDNA文庫代表了mRNA的來源，轉(zhuǎn)錄本在豐度上有差別，而基因組文庫在理論上均等地代表了所有基因序列不同細胞類型制備的cDNA文庫包含一些共同序列和獨特序列，可用于分離差別表達的基因，基因組文庫中不能基因組文庫由于含有不表達序列，比cDNA文庫大mRNA在不同組織之間存在豐度差異，因此cDNA文庫在構(gòu)建時對于mRNA含量較少的就比較困難，而基因組文庫不存在這樣的問題分子生物學(xué)研究法5.3.5基因文庫的篩選基因文庫的篩選是指通過某種特殊方法從基因文庫中鑒定出含有所需重組DNA分子的特定克隆過程。分子生物學(xué)研究法5.3.5.1核酸雜交法分子生物學(xué)研究法5.3.5.2PCR篩選法前提：已知足夠的序列信息并獲得基因特異性引物。步驟：（1）將文庫保存在多孔培養(yǎng)板上

（2）用設(shè)計好的目的基因探針對每個孔進行PCR篩選，鑒定出陽性孔（3）把陽性孔中的克隆稀釋到次級多孔板中進行PCR篩選。（4）重復(fù)以上程序，直至鑒定出與目的基因?qū)?yīng)的單個克隆為止。分子生物學(xué)研究法5.3