細(xì)胞自噬檢測(cè)

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細(xì)胞自噬染色檢測(cè)試劑盒(MDC法)

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

自噬(autophagy)是細(xì)胞受到刺激后吞噬自身的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器，最終將吞食物在溶酶體內(nèi)降解的過(guò)程，自噬體(autophagosome)為雙層膜包被的圓形或橢圓形結(jié)構(gòu)，內(nèi)含細(xì)胞質(zhì)、長(zhǎng)壽蛋白質(zhì)和異常蛋白聚集物，損傷或多余細(xì)胞器如線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和微體、病毒和細(xì)菌等。自噬是一種進(jìn)化上保守的降解過(guò)程，可靶向長(zhǎng)壽命蛋白、細(xì)胞器及其他細(xì)胞質(zhì)組分并通過(guò)溶酶體途徑進(jìn)行降解。自噬通路的激活對(duì)多種細(xì)胞功能都是必需的，包括饑餓狀態(tài)下的存活、細(xì)胞內(nèi)組分清除、發(fā)育及免疫等過(guò)程。

單丹磺酰尸胺(Dansylcadaverine,MDC)是一種熒光色素，是嗜酸性染色劑，尋常被用于檢測(cè)自噬體形成的特異性標(biāo)記染色劑，其檢測(cè)激發(fā)濾光片波長(zhǎng)355nm，阻斷濾光片波長(zhǎng)512nm。Leagene細(xì)胞自噬染色檢測(cè)試劑盒(MDC法)適用于培養(yǎng)細(xì)胞的自噬染色，又稱為MDC染色液，可與EB合用雙染。

產(chǎn)品組成：

編號(hào)DA0041名稱100TStorage試劑(A):MDCStain(500×)試劑(B):Stainbuffer試劑(C):Washbuffer使用說(shuō)明書(shū)30μl50ml250ml-20℃避光4℃4℃1份自備材料：1、低速離心機(jī)2、1.5ml離心管3、載玻片、蓋玻片4、熒光顯微鏡

操作步驟(僅供參考)：

(一)玻片法

1、收集細(xì)胞，用300～500μl的Washbuffer清洗細(xì)胞1次，800～1000g離心5min，

棄上清。

2、參與適量的Stainbuffer重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)理細(xì)胞濃度至106/ml。

3、取5μlMDCStain(500×)加至245μlStainbuffer，混勻，即為MDCStain(10×)。

400-0000-455.

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4、取90μl細(xì)胞懸液至新的1.5ml離心管中，參與10μl的MDCStain(10×)，輕輕混勻。5、37℃或室溫避光染色15～45min。

6、800～1000g離心5min，棄上清，收集細(xì)胞，用300～500μl的Washbuffer清洗細(xì)

胞2次，800～1000g離心5min，棄上清。

7、參與100μl的Washbuffer重懸細(xì)胞，滴加于載玻片上并加蓋玻片。

8、熒光顯微鏡下觀測(cè)(激發(fā)濾光片波長(zhǎng)355nm，阻斷濾光片波長(zhǎng)512nm)，計(jì)數(shù)并拍照。(二)96孔板法

1、配制MDC染色工作液：按MDCStain(500×)：Stainbuffer=1：499的比例混合，即為MDC染色工作液。如不能及時(shí)用完，應(yīng)-20℃避光保存。

2、輕輕吸除96孔板中的培養(yǎng)液，參與100μlMDC染色工作液至各孔，37℃5%CO2避

光孵育15～60min。3、各孔參與100μlWashbuffer清洗2～3次。4、熒光顯微鏡下觀測(cè)(激發(fā)濾光片波長(zhǎng)355nm，阻斷濾光片波長(zhǎng)512nm)，計(jì)數(shù)并拍照。(三)MDC與EB雙染法1、收集細(xì)胞，用300～500μl的Washbuffer清洗細(xì)胞1次，800～1000g離心5min，

棄上清。2、參與適量的Stainbuffer重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)理細(xì)胞濃度至106/ml。3、取5μlMDCStain(500×)加至245μlStainbuffer，混勻，即為MDCStain(10×)4、取90μl細(xì)胞懸液至新的1.5ml離心管中，參與10μl的MDCStain(10×)和0.2uMEB染色液，輕輕混勻。5、滴加于在玻片上，室溫避光染色15～30min，加蓋玻片。6、熒光顯微鏡下觀測(cè)(激發(fā)濾光片波長(zhǎng)512nm)，計(jì)數(shù)并拍照。染色結(jié)果：正常細(xì)胞凋亡細(xì)胞細(xì)胞被均勻染成黃綠色熒光染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞核碎裂成點(diǎn)狀，被染成大小不一、致密濃染的綠色顆粒本卷須知：1、MDCStain和EB對(duì)人體有一定害處，請(qǐng)防備操作。2、AO常與EB染色合用，可區(qū)分出正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞