核移植技術(shù)與動物克隆

核移植技術(shù)與動物克隆第1頁/共100頁Nucleartransplantation＆AnimalCloningTechnology◆What技術(shù)原理◆How技術(shù)方法◆Why技術(shù)應(yīng)用第2頁/共100頁細(xì)胞拆合與重組概述1、細(xì)胞拆合技術(shù)的發(fā)展概況1952年Briggs和King首創(chuàng)了核移植的方法1967年Careter發(fā)現(xiàn)細(xì)胞松馳素B能誘發(fā)體外培養(yǎng)的小鼠成纖維細(xì)胞的排核作用1972年P(guān)rescott等首先應(yīng)用離心結(jié)合CB分離哺乳類細(xì)胞的胞質(zhì)體獲得成功細(xì)胞核、質(zhì)分離技術(shù)與細(xì)胞融合技術(shù)匯合起來，建立了細(xì)胞重組技術(shù)第3頁/共100頁胞質(zhì)體（cytoplast）：除去細(xì)胞核后由膜包裹的無核細(xì)胞，由細(xì)胞松弛素B處理后，經(jīng)離心得到。核體（karyoplast）：由胞質(zhì)體分離出來的核，帶有少量胞質(zhì)并圍有質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)。胞質(zhì)雜種細(xì)胞：將胞質(zhì)體和另一完整細(xì)胞融合得到的細(xì)胞。雜種細(xì)胞：核體與完整細(xì)胞融合。重組細(xì)胞：核體與另一種細(xì)胞的胞質(zhì)體融合。第4頁/共100頁1、2、3親本細(xì)胞4、6核體5、7胞質(zhì)體8、9雜種細(xì)胞10重組細(xì)胞11胞質(zhì)雜種細(xì)胞ⅠPEG介導(dǎo)Ⅱ篩選第5頁/共100頁2、細(xì)胞拆合與重組的概念（1）細(xì)胞拆合:

把完整細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核用特殊的方法分離開來，或把細(xì)胞核從細(xì)胞質(zhì)中吸取出來，或用紫外線等把細(xì)胞中的核殺死，然后再把同種或異種的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)重新組織起來，培育新的細(xì)胞或新的生物個體第6頁/共100頁（2）細(xì)胞重組（cellreconstruction)

將細(xì)胞融合技術(shù)與細(xì)胞核質(zhì)分離技術(shù)結(jié)合，即在融合介子的誘導(dǎo)下，使胞質(zhì)體與完整細(xì)胞合并，或胞質(zhì)體與核體重新組成，構(gòu)成細(xì)胞的過程第7頁/共100頁3、細(xì)胞拆合的方法（1）物理拆合法

用紫外線或激光將核破壞，再用微玻璃針或微吸管將其他細(xì)胞核注入（最早使用） 將細(xì)胞融合技術(shù)與顯微外科手術(shù)結(jié)合，作微吸管將細(xì)胞核連同周圍少量細(xì)胞質(zhì)吸出，再注入已去核的細(xì)胞中第8頁/共100頁顯微操作法進行細(xì)胞核移植第9頁/共100頁（2）化學(xué)拆合法☆細(xì)胞松馳素（Cytochalasin）B結(jié)合高速離心

☆CB阻斷細(xì)胞質(zhì)分裂，不干擾核分裂；引起細(xì)胞表面形狀的改變和排出細(xì)胞核。機理：CB是真菌的一種代謝產(chǎn)物，可以切斷微絲，并結(jié)合在微絲末端阻抑肌動蛋白聚合，但對解聚沒有明顯影響，因而可以破壞微絲的三維網(wǎng)絡(luò)！第10頁/共100頁一、核移植

核移植供體核移植受體核移植方法激活、培養(yǎng)與胚胎移植二、動物克隆基本方法克隆羊“多莉”的培育三、現(xiàn)狀與前景第五章核移植技術(shù)與動物克隆第11頁/共100頁核移植技術(shù)與動物克隆

原理和方法將受體卵細(xì)胞

去核（？）向去核卵細(xì)胞植入（？）供體細(xì)胞（？）移植后的細(xì)胞激活后可以象受精卵一樣發(fā)育形成動物個體，并具有與核供體細(xì)胞相同的基因第12頁/共100頁第二代試管嬰兒

◆卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)單精子注射(Intracytoplasmicsperminjection，ICSI)

●核移植？第13頁/共100頁第四代試管嬰兒

◆借助別人卵漿增強自己卵子活力◆特征：卵漿置換◆主要針對那些卵子質(zhì)量不高、活力差的高齡女性

●核移植？第14頁/共100頁一、核移植技術(shù)1、核移植供體◆胚胎、胎兒細(xì)胞——胚胎細(xì)胞核移植

胚胎卵裂球、干細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞等◆體細(xì)胞——體細(xì)胞核移植

◆完整的二倍體，含供體動物的完整基因組◆在受體細(xì)胞質(zhì)環(huán)境中，完成分化過程的倒轉(zhuǎn)（重編程reprogram），能重新完成從受精到發(fā)育成一個正常動物個體的全過程第15頁/共100頁如何獲取供體細(xì)胞核？◆

顯微操作

◆細(xì)胞松弛素結(jié)合高速離心核體胞質(zhì)體第16頁/共100頁2、核移植受體細(xì)胞◆去核卵母細(xì)胞（收集方法？）

◆細(xì)胞體積較大◆決定細(xì)胞向某一方向分化的初始信息儲存于卵細(xì)胞中受體細(xì)胞的種類：卵母細(xì)胞、受精卵、2-細(xì)胞胚胎。其中卵母細(xì)胞最為普遍。作為核移植受體的處于第二次減數(shù)分裂中期（MII）的卵母細(xì)胞可以經(jīng)超排卵或體外成熟培養(yǎng)的卵巢細(xì)胞得到第17頁/共100頁如何給受體細(xì)胞去核？◆顯微操作

◆細(xì)胞松弛素結(jié)合高速離心◆紫外照射

第18頁/共100頁3、核移植的方法◆去核卵細(xì)胞胞漿內(nèi)顯微注射

◆核體透明帶下注射，再刺激核體與胞質(zhì)體融合

第19頁/共100頁4、移植后重組細(xì)胞的激活、培養(yǎng)、胚胎移植◆激活（使卵母細(xì)胞從MII期解放，轉(zhuǎn)到“受精”狀態(tài)）◆重組胚的體內(nèi)或體外培養(yǎng)◆胚胎移植

第20頁/共100頁第21頁/共100頁重構(gòu)卵的激活正常情況下,受精過程中，精子進入卵子后,卵母細(xì)胞質(zhì)中會出現(xiàn)一系列的反應(yīng),如游離Ca2+濃度增高、母源性的mRNA啟動轉(zhuǎn)錄、MPF等因子活性下降等。這些反應(yīng)是卵母細(xì)胞被激活的標(biāo)志，不經(jīng)過這些變化,胚胎就不能正常發(fā)育。核移植過程中的激活就是模仿受精過程中精子的刺激作用。目前，激活的方式主要有：電激活和化學(xué)激活重構(gòu)胚移入受體之前的培養(yǎng)方法有體外培養(yǎng)和體內(nèi)培養(yǎng)兩種方法。第22頁/共100頁●核移植成功的重要前提盡量保證核供體和受體細(xì)胞處于同樣的細(xì)胞周期（同步狀態(tài)）Cellcycleco-ordinationinembryocloningbynucleartransfer

如何使處在細(xì)胞周期不同階段上的核供體和受體處于同步狀態(tài)？第23頁/共100頁一、核移植核移植供體核移植受體核移植方法激活、培養(yǎng)與胚胎移植二、動物克隆基本方法克隆羊“多莉”的培育三、現(xiàn)狀與前景第五章核移植技術(shù)與動物克隆第24頁/共100頁克隆來源于英語“clone”或“cloning”的音譯，起源于希臘文“Klone”，原意是用“嫩枝”或“插條”繁殖。曾譯為無性生殖或無性繁殖，即由同一個祖先細(xì)胞分裂而形成的純細(xì)胞系，這個細(xì)胞系每個細(xì)胞的基因彼此是相同的。第25頁/共100頁隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，通過核移植與基因工程等技術(shù)也可獲得無性系，于是人們把實現(xiàn)無性繁殖的操作稱之為克隆，克隆由名詞轉(zhuǎn)化為動詞。克隆=復(fù)印1997年3月WHO解釋：克隆為遺傳上同一的機體和細(xì)胞系（株）的無性生殖第26頁/共100頁動物克隆發(fā)展簡史（略）第27頁/共100頁爪蟾的核移植實驗1958年JohnGurdon和Machineer第28頁/共100頁認(rèn)為：細(xì)胞分化并不需要遺傳物質(zhì)的不可逆修飾！1970年JohnGurdon蛙蹼角質(zhì)化細(xì)胞第29頁/共100頁魚類的核移植●從1961年開始，童第周等以金魚和鳑鮍魚為材料，進行魚類不同亞科間的細(xì)胞核移植獲得成功，用以研究雜交細(xì)胞核與純種細(xì)胞核在發(fā)育功能上的差異，以及細(xì)胞質(zhì)對細(xì)胞核的影響．●1989年，童第周、牛滿江又將鯽魚胚胎細(xì)胞核移入鯉魚去核的未受精卵中，實現(xiàn)了不同種間的核質(zhì)雜交，成功地?zé)o性繁殖了“鯉鯽核魚”新品種。第30頁/共100頁核移植小鼠（1981年1月Science雜志）哺乳類的細(xì)胞核移植第31頁/共100頁問題：除了核移植外，還有其它克隆動物的方法嗎？1、哺乳動物克隆的基本方法：利用胚胎分割或卵裂球分離技術(shù)從2個細(xì)胞至胚胎的的早期胚胎產(chǎn)生兩個或兩個以上的個體通過細(xì)胞核移植構(gòu)建新的重構(gòu)胚或重建胚。第32頁/共100頁第33頁/共100頁第34頁/共100頁2、克隆羊多莉的培育第35頁/共100頁第36頁/共100頁第37頁/共100頁第38頁/共100頁問題：◆3個母親克隆出多莉，3只公羊能克隆出一只小公羊來嗎？◆多莉100％是白面綿羊的復(fù)制品嗎？◆如何做到100％復(fù)制自己（雌性、雄性）？第39頁/共100頁問題：體細(xì)胞核移植時，如何使處在細(xì)胞周期不同階段上的核供體和受體處于同步狀態(tài)？核全能性的恢復(fù)（重編程）？第40頁/共100頁血清“饑餓”法第41頁/共100頁實驗成功的關(guān)鍵：血清饑餓

使細(xì)胞核和去核卵細(xì)胞處于細(xì)胞周期中相匹配的階段 使結(jié)合在基因（DNA）上的調(diào)控蛋白脫落下來 重新編程（reprogram,remodel

）第42頁/共100頁返回第43頁/共100頁◆Threecategoriesofcellsinvivo◆Cyclingcells

Dividingcontinuously—Stemcells◆G0cellsDonotdividenormally,butdividewhengivenanappropriatestimulus:livercells,lymphocytes◆TerminallyDifferentiatedcellsHighlyspecialized,havelosttheabilitytodivideuntiltheydie:musclecells,redbloodcells,nervecells第44頁/共100頁第45頁/共100頁試驗結(jié)果424只成體綿羊細(xì)胞核移植277個融合細(xì)胞（63.8%）移入母羊輸卵管成功247個（89.2%）發(fā)育到桑椹期的胚胎29枚(11.7%)植入13只母羊子宮后1頭羊懷胎產(chǎn)出總成功率0.23%第46頁/共100頁一頭全白的小羊羔，依偎在生下它但與它毫無血緣關(guān)系的代育母親——一頭蘇格蘭黑臉羊旁邊，這張著名的照片向世人顯示，生物技術(shù)的新時代來臨了。第47頁/共100頁多莉羊之父威爾穆特第48頁/共100頁多利羊（Dolly)風(fēng)暴1997．2．27Nature（385：810－813）

英國愛丁堡羅斯林研究所

伊恩威爾穆特小組：

多利羊

1996.7 出生

1996.11 收到文章

1997.2 文章發(fā)表第49頁/共100頁第50頁/共100頁第51頁/共100頁多莉羊成為明星第52頁/共100頁多莉和它的三個孩子第53頁/共100頁第54頁/共100頁第55頁/共100頁問題：“多莉”是第一只克隆成功的動物嗎？為什么她的誕生會引起轟動？第一只體細(xì)胞克隆成功的哺乳動物！第56頁/共100頁問題在哺乳動物胚胎發(fā)育過程中，細(xì)胞發(fā)生了分化，但是在適宜環(huán)境下，已分化的細(xì)胞能否重新恢復(fù)到發(fā)育的起始狀態(tài)，再重新發(fā)育成其它類型細(xì)胞組織的多能性，甚至發(fā)育成完整個體的全能性呢？細(xì)胞的分化是不是發(fā)生了不可逆的變化？第57頁/共100頁對傳統(tǒng)理論的挑戰(zhàn)

對于動物來說，隨著分化的演進，細(xì)胞逐漸喪失其分化能力全能性 多能性 單能性 分化成熟的體細(xì)胞

第58頁/共100頁

一條科學(xué)成就的宣布，在全世界范圍內(nèi)，短短幾十天左右時間，從學(xué)術(shù)界到經(jīng)濟界、政界引起巨大而深刻的反響，是空前的

“克隆”一詞也頓時變得婦孺皆知第59頁/共100頁多莉在全世界引起的巨大反響一方面學(xué)術(shù)界高度評價

1997.3.2美國華盛頓郵報 奧勒岡州沃爾小組：成功克隆兩只恒河猴（96.8出生）

1997.3.5臺灣地區(qū)吳明杰小組：5只克隆豬第60頁/共100頁沃爾小組成功克隆兩只恒河猴第61頁/共100頁吳明杰小組：5只克隆豬第62頁/共100頁在日本克隆成功的牛第63頁/共100頁多莉在全世界引起的巨大反響另一方面，人們馬上意識到克隆人的威脅

政界紛紛出來表態(tài)

1997.3.4（美）克林頓總統(tǒng)宣布：禁止聯(lián)邦政府資助人體克隆實驗

1997.3.5（意）衛(wèi)生部長在眾議院宣布：禁止人體和動物克隆第64頁/共100頁1998年１月，美國一位名叫理查德·錫德的科學(xué)家率先提出，他將進行克隆人試驗，目的是為患不育癥的夫婦繁衍后代。此言一出，舉世震驚。1998年1998年初提出要克隆人的美國醫(yī)生錫德（RichardSeed）折騰了幾年，也不知是手藝不到家還是沒錢，還是根本就只是舉起刀叉裝裝樣子，沒打算真把螃蟹吃下肚，又或者是被各路高人罵怕了，總之一直不見他動真格的。第65頁/共100頁2001年8月7日，美國科學(xué)院關(guān)于克隆人問題的討論會上，三位表示要克隆人的科學(xué)家。左：意大利國際聯(lián)合研究所（InternationalAssociatedResearchInstitute）所長SeverinoAntinori中：克隆援助（Clonaid）公司老板BrigitteBoisselier右：美國肯塔基大學(xué)教授PanayiotisMichaelZavos他們克隆人的目的都是為了給不孕的夫婦培育后代?！翱寺∪傋印?/p>

“科學(xué)三狂人”

第66頁/共100頁“雷爾”教派克隆嬰兒的婦女2001年第67頁/共100頁問題三：“多莉”克隆成功（即哺乳動物體細(xì)胞克隆成功）說明了什么？核的全能性？第68頁/共100頁A.理論意義證實分化成熟的動物細(xì)胞核仍具全能性證實細(xì)胞質(zhì)對胚胎發(fā)育分化的決定性第69頁/共100頁

看來，分化的關(guān)鍵在于細(xì)胞質(zhì)？細(xì)胞質(zhì)中有著決定細(xì)胞分化全能性的物質(zhì)，稱為分化決定子。第70頁/共100頁細(xì)胞質(zhì)中的分化決定子

后來實驗證明，細(xì)胞質(zhì)中的分化決定子，是RNA。它們對紫外線敏感，對RNase敏感

在卵子形成過程中，卵母細(xì)胞中含有2－5萬種mRNA，每種約600個拷貝。這些RNA構(gòu)成母體信息，決定受精卵的發(fā)育潛能第71頁/共100頁信息體

（informasome）

在卵子中，母體信息以核糖核酸蛋白（RNP）顆粒形式存在，其沉降系數(shù)比核糖體還大，稱為信息體第72頁/共100頁B.實踐意義為實驗室研究和動物的藥物實驗提供遺傳上完全一致的實驗動物控制動物的性別拯救瀕危動物提高轉(zhuǎn)基因動物的效率使經(jīng)遺傳改造的豬為人類提供移植器官生產(chǎn)基因工程藥物和基因疫苗如：蛋白質(zhì)－多肽類藥物(胰島素、凝血子、干擾素、生長因子)2000年產(chǎn)達到185億美元第73頁/共100頁第74頁/共100頁第75頁/共100頁2003年2月15日早晨的羅斯林研究所第76頁/共100頁第77頁/共100頁一、核移植核移植供體核移植受體核移植方法激活、培養(yǎng)與胚胎移植二、動物克隆基本方法克隆羊“多莉”的培育三、現(xiàn)狀與前景第八章核移植技術(shù)與動物克隆第78頁/共100頁應(yīng)用A

生產(chǎn)實踐（結(jié)合干細(xì)胞工程、胚胎工程）：◆制備轉(zhuǎn)基因動物，用于藥物生產(chǎn)◆優(yōu)良畜種的培育和擴大繁殖◆開展異種動物克隆，拯救瀕危動物◆治療性克隆研究B

理論研究——核質(zhì)關(guān)系問題第79頁/共100頁克隆人的技術(shù)路線與步驟第80頁/共100頁第81頁/共100頁目前已經(jīng)克隆出的動物第82頁/共100頁動物克隆技術(shù)存在的問題1、營養(yǎng)過多發(fā)育過快，克隆動物一般都有發(fā)育過快的問題，體外培養(yǎng)的時間過長或培養(yǎng)液的成分可能與克隆動物的流產(chǎn)以及出生后不久死亡有關(guān)第83頁/共100頁2、線粒體問題目前還不知道原本就存在于卵子里的線粒體到底在多大程度上與個體的性質(zhì)有關(guān)，細(xì)胞核的遺傳基因與線粒體的遺傳基因相互影響的問題必須引起重視第84頁/共100頁3、核的重新編程不完整，染色體倍數(shù)不正確、性