第七章工業(yè)微生物原生質體育種和原生質體融合

第七章工業(yè)微生物原生質體育種和原生質體融合第1頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一第一節(jié)原生質體育種一、原生質體再生育種出發(fā)菌株的選擇→菌種活化和與培養(yǎng)→原生質體制備→原生質體再生→高產菌株分離→復篩→遺傳性狀鑒定→菌種特性和發(fā)酵特性研究第2頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一二、原生質體誘變育種菌種活化和與培養(yǎng)→原生質體制備→原生質體懸浮液稀釋至一定濃度，取一定放入無菌平皿中→紫外燈下誘變處理→置暗處后處理→再生培養(yǎng)→高產菌株分離→復篩→遺傳性狀鑒定→菌種特性和發(fā)酵特性研究第3頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一三、原生質體轉化育種菌種活化和與培養(yǎng)→原生質體制備→離心洗滌，取原生質體懸浮液1ml，2倍SMM濃縮液和質粒DNA各0.1ml，然后加入40%聚乙二醇4000ml，混勻后靜置2min,離心，懸浮于1mlHCP培養(yǎng)幾種，適當稀釋后分離在選擇培養(yǎng)基上，雙層平板培養(yǎng)，篩選轉化子。第4頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一第二節(jié)微生物原生質體融合育種一、定義與意義

細胞融合（Cellfusion）也叫細胞雜交是指使用人工方法使兩個或兩個以上的細胞合并形成一個細胞的技術。由于它不僅能產生同種細胞融合，也能產生種間細胞的融合，因此細胞融合技術在創(chuàng)造新細胞、培育新品種方面意義重大，也被廣泛應用于細胞生物學和醫(yī)學研究的相關領域。第5頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一基因型相同的細胞融合成的融合細胞稱為同核體，來自不同基因型的融合細胞則稱為異核體。從融合效果上，細胞融合包括：對稱融合：即兩個完整的細胞間的融合。不對稱融合：利用物理或化學方法使某親本的核或細胞質失活后再與另外一個完整的細胞進行融合。第6頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一二、發(fā)展歷史細胞融合現(xiàn)象最初是在動物細胞中表現(xiàn)的。1858年發(fā)現(xiàn)正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細胞情況。1875年觀察到脊椎動物（蛙類）的血液細胞發(fā)生的合并現(xiàn)象。第7頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一1962年日本學者發(fā)現(xiàn)一種叫日本血凝性病毒(HVJ)能引起艾氏腹水瘤細胞融合成多核細胞的現(xiàn)象。20世紀七十年代初，華裔加籍科學家高國楠發(fā)現(xiàn)聚乙二醇(PEG)能促使植物原生質體融合，開拓了植物細胞融合的研究。細胞融合技術逐步擴展到植物細胞和微生物細胞伴隨者細胞融合技術的成熟。20世紀80年代，真正意義上的細胞工程誕生了，細胞融合現(xiàn)已成為細胞工程的核心技術之一。

第8頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一三、原生質體融合育種的特點1)雜交頻率較高：細胞壁去除后在高滲條件下形成類似于球形的原生質體。2)受接合型或致育型的限制較?。憾H株中任何一株都可能起受體或供體的作用，因此有利于不同種屬間微生物的雜交。3)遺傳物質傳遞更為完整：原生質體融合是二親株的細胞質和細胞核進行類似的合二為一的過程。第9頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一4)存在著兩株以上親株同時參與融合形成融合子的可能性。5)有可能采用產量性狀較高的菌株作融合親株。6)提高菌株產量的潛力較大。7)有助于建立工業(yè)微生物轉化體系。第10頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一四、細胞融合過程顯微鏡下的原生質體融合第11頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一融合過程中細胞膜變化類脂質分子發(fā)生擾動和重排導致細胞橋的形成細胞質、核相互融合第12頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一五、原生質體融合技術原生質體制備原生質體純化原生質體融合融合子檢出融合子鑒定第13頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一（一）微生物原生質體制備1、定義及特點定義：去除細胞壁后裸露的細胞稱之為原生質體。特點：無細胞壁，可以方便地進行遺傳操作、人工誘變、細胞器轉移、細胞融合等操作。具有全能性，能再生細胞壁。第14頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一2、微生物細胞壁組成微生物種類不同其細胞壁結構和化學組成不同，酶解處理的有效酶也不一樣，因此要求根據(jù)微生物種類特性選擇合適的酶。G+:糖肽、低聚糖、多糖、蛋白質、磷壁酸、糖醛酸磷壁酸G-：糖肽、磷壁酸、蛋白質、類脂、脂多糖、脂蛋白、二氨基庚二酸、甘氨酸、阿拉伯糖、半乳糖第15頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一真核細胞壁組成種類纖維素幾丁質其他多糖疫霉屬25065毛霉屬0944酵母屬0160鐮刀霉屬03929裂褶菌數(shù)0581鬼傘屬03350第16頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一3、制備原生質體的酶類自然界中多種生物都能合成破壞降解菌體細胞壁的酶，如蛋清中的溶菌酶，蝸牛消化酶，寄生性微生物合成酶。包括：纖維素酶酵母裂解酶幾丁質酶商品酶：Novozyme234來自TrichodermaharzianumLywallzyme廣東微生物研究所溶壁酶Gglucuronidase葡聚糖甘酸酶第17頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一

4、影響原生質體制備的因素1)菌體的前處理為了將菌作一些前處理使酶作用的效果好一些，如細菌加入亞抑制劑量的青霉素。2)菌體的培養(yǎng)時間選擇增殖期的菌體，使細胞易于原生質體化。第18頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一3)酶濃度對于不同種屬的微生物，不僅對酶的種類要求不同，對酶的濃度也有差異。最佳酶濃度還隨不同的生長期的菌體而變化。酶濃度合適，濃度太高對原生質體有破壞作用，影響原生質體的再生4)酶處理溫度:根據(jù)具體情況,細菌高,酵母及霉菌稍低。過高的溫度使酶失活，原生質體失活；過低的溫度酶活性不高，影響原生質體細胞膜穩(wěn)定性第19頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一5)破壁時的pH值:對離子強度影響較大6)滲透壓穩(wěn)定劑等滲透壓在原生質體制備中起到保護原生質體免于膨裂，有助于酶和底物的結合，滲透壓穩(wěn)定劑多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有機物和KCl和NaCl等無機物。第20頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一5、原生質體制備程序菌體培養(yǎng)：液體培養(yǎng)固體培養(yǎng)收集菌體：過濾收集、離心收集無菌水沖洗洗滌菌體：等滲液沖洗等滲液與酶液相同酶解處理：保溫酶解稀釋終止酶解，離心去酶過濾分離：過濾去掉為分界菌絲體查速離心：收集大小密度均一的原生質體，低速離心其沉淀物，高速離心棄上清液，的純化原生質體。第21頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一原生質體的保存較低的溫度可以有效保持原生質體的活性；細菌：48小時放線菌：24小時真菌0-4℃保存2天第22頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一影響原生質體存活的遺傳因素細菌易再生可達90%以上，有些種類也很低；小單孢菌只有10%；放線菌可達50%；絲狀真菌“產黃青霉”40-60%。第23頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一（二）原生質體融合1、融合親本選育選擇遺傳性狀穩(wěn)定且具有優(yōu)勢互補的兩個親株原生質體融合是一隨機過程，原生質體間無親和選擇性，當兩種原生質體A和B混合到一起時，發(fā)生融合的可能性有A-A/A-B/BB其中只有A-B的融合是有效的融合，概率為33.33%，當然還有多個原生質體融合到一起的可能。為了能明確檢測到融合子，參與融合的親株一般都需要帶有可以識別的遺傳標記，如營養(yǎng)缺陷型或抗藥性等第24頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一2、原生質體融合的方法物理法、化學法及生物法。原理增加細胞間的粘附、改變膜的通透性——隨機結合、融合第25頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一(1)物理法——電融合誘導法在直流電脈沖的誘導下，極化產生偶極子，彼此靠近，定向排列成串球狀。在直流電脈沖的誘導下，原生質體膜兩側產生電勢，正負電荷相吸，細胞膜變薄，觸發(fā)膜的穿孔（質膜瞬間破裂）。膜之間形成通道，細胞質等得以交換、融合。第26頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一具體步驟第27頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一第28頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一DAPI：4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚是一種常用的熒光染料，它們與DNA雙螺旋的凹槽部分發(fā)生相互作用，從而與DNA的雙鏈緊密結合。結合后產生的熒光基團的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好UV（紫外光）的激發(fā)波長正好是356nm，使得DAPI成為了一種常用的熒光檢測信號。染色標記細胞核的位置。第29頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一第30頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一第31頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一第32頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一第33頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一特點融合率高、重復性與可控制性強。裝置精巧、方便簡單?？稍陲@微鏡下觀察或錄像融合過程?？赡軙斐刹豢苫謴偷募毎麚p傷。第34頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一(2)生物法各種病毒都具有凝集細胞的能力，它一邊粘接在一個細胞表面，另外一邊粘接在另一個細胞表面，從而使兩個細胞在病毒的作用下靠近發(fā)生凝結。仙臺病毒（HAJ）是兩層磷脂組成的外膜包裹著RNA與蛋白質的復合體。因HAJ病毒毒力弱，易被滅活而常采用。仙臺病毒有若干附著點，可以同時吸附在兩個細胞表面。由于病毒體積很小，由一個病毒吸附的兩個細胞靠得極近，使細胞膜融合在一起，成為一個雜種細胞。第35頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一

原理與過程滅活后的病毒顆粒結合到原生質體表面。兩受體細胞開始凝聚。兩細胞的膜緊密結合。病毒被膜與受體細胞的漿膜融合。病毒顆粒周圍的膜脫離整個膜，產生破口，在兩細胞間形成細胞質通道（37℃下1-2min），通道繼續(xù)擴大，病毒顆粒流入細胞質內，細胞質互相融合。融合細胞變圓，融合結束。第36頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一特點研究最早的促融劑。毒性大而使應用受到限制。第37頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一(3)化學法包括PEG誘導、高Ca2+和pH誘導PEG結合誘導等。聚乙二醇(PEG)是一種多聚化合物，分子式為H(OHCH2-CH2)nOH)。PEG誘導：PEG與溶液中自由水結合，高度脫水后引起原生質體凝聚、扭曲變形、細胞膜連接處發(fā)生融合，形成很小的細胞橋，之后擴大，最終徹底融合。第38頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一高Ca2+和pH誘導PEG結合誘導高Ca2+機制：帶負電荷間的原生質體在鈣離子的連接下形成靜電鍵——鈣橋，促使異源的原生質體間粘著和結合。高pH：增加Ca2+在細胞表面的黏附，從而促進兩原生質體的接觸。進一步提高了PEG法的效率。第39頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一第40頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一(4)方法選擇具體應用時要根據(jù)不同對象選擇不同的細胞融合方法和條件。誘導動物細胞融合，仙臺病毒HVJ誘導、PEG法、電融合法都適用；植物細胞融合常用PEG法和電融合法；微生物細胞融合多采用PEG法。第41頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一（三）融合體的再生1、再生培養(yǎng)基：應具備維系、保護、支持和營養(yǎng)的功能1）用硫酸鎂、甘露醇、山梨糖、蔗糖為滲透劑，不同的微生物種類應選擇不同的再生培養(yǎng)基；2）營養(yǎng)因子：酵母膏、酪蛋白、氨基酸、糖類；3）原生質體保護劑擴張劑的作用牛血清白蛋白、人血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、明膠等對原生質體具有保護作用，同時起到原生質體擴張劑作用，次級原生質體再生作用；第42頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一4）加入再生細胞壁誘導物及前體物質在培養(yǎng)基中加入明膠、細胞壁殘片甚至席位蘇濾膜都有刺激原生質體再生的功能。2、再生培養(yǎng)溫度過高溫度對原生質體再生有一只作用，當再生溫度略低于菌株培養(yǎng)溫度時，有利于原生質體的再生3、操作方式涂布培養(yǎng)法對原生質體有損壞第43頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一4、固體培養(yǎng)一般認為固體培養(yǎng)優(yōu)于液體培養(yǎng)。液體培養(yǎng)時細胞壁可溶性物質很容易擴散（如酵母在液體再生液中很難再生）；固體培養(yǎng)基限制有效分子的擴散，但先在液體培養(yǎng)基中預培養(yǎng)2-3小時有利于提高再生率。第44頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一（四）融合細胞篩選第45頁，共52頁，2023年，2月20日，星期一1、篩選的原因與必要性細胞融合是一個隨機的物理過程，經(jīng)融合后細胞將以多種形式出現(xiàn)，需要通過培養(yǎng)和篩選，除去不需要的細胞，分離出需要的雜種細胞，從而解決融合細胞的選擇問題。問題：A與B融合過程中，你能預見有