檢驗(yàn)基因治療總結(jié)

檢驗(yàn)基因治療總結(jié)第1頁/共93頁2傳統(tǒng)療法與基因治療傳統(tǒng)治療方法藥物治療手術(shù)治療放射治療理療新的生物治療：基因治療(genetherapy)第2頁/共93頁3GeneTherapy什么是基因治療？怎樣進(jìn)行基因治療?基因治療存在哪些問題?第3頁/共93頁4基因治療的概念：經(jīng)典概念：將具有正常功能的基因置換或增補(bǔ)患者體內(nèi)缺陷的基因，從而達(dá)到治療疾病的目的。廣義概念：將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移至患者體內(nèi)，使其在體內(nèi)表達(dá)，最終達(dá)到治療疾病的目的，均稱之為基因治療。第4頁/共93頁51、遺傳病（Inheriteddisorders）：ADA缺陷的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷癥（SCID）,血友病，家族性高膽固醇血癥，囊性纖維變性，Gaucher癥等2、惡性腫瘤：惡性黑色素瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，白血病，腎癌，卵巢癌等3、感染性疾?。↖nfectiousdiseases）：艾滋病4、其它：血管病,etcWhatcangenetherapybeappliedto?第5頁/共93頁Statisticofgenetherapyprotocolsandpatients第6頁/共93頁7基因治療的必要條件發(fā)病機(jī)制在DNA水平上已經(jīng)清楚要轉(zhuǎn)移的基因已經(jīng)克隆分離，其表達(dá)產(chǎn)物有詳盡的了解該基因正常表達(dá)的組織可在體外進(jìn)行遺傳操作第7頁/共93頁8治療什么病？增強(qiáng)而非治療將被否定目前還有什么其它療法？治療的安全性如何？個(gè)人、家人、環(huán)境對(duì)該患者的療效如何？公正的選擇受治療的患者？知情同意原則保護(hù)患者的隱私權(quán)采取基因治療前應(yīng)考慮的問題第8頁/共93頁9MartinCline事件M.Cline是加州大學(xué)洛杉磯分校的血液學(xué)科主任1980年企圖用基因療法來治療兩名重型地中海型貧血的歐洲病人。試圖將正常珠蛋白基因插入患者骨髓的祖細(xì)胞中，以改善貧血和反復(fù)輸血導(dǎo)致的鐵超負(fù)荷因?yàn)槭褂弥亟M的珠蛋白基因，沒有按照規(guī)定的天然的珠蛋白基因，被加州大學(xué)的（humansubjectsprotectioncommittee)終止該項(xiàng)工作，并被NIH終止其獲得的兩項(xiàng)科研基金。第9頁/共93頁10基因治療的幾種策略原位修復(fù)有缺陷的基因，使其在質(zhì)和量上均能得到正常表達(dá)基因替代療法，即傳統(tǒng)上的基因治療重新開放已關(guān)閉的基因，目的在于促使有類似功能的基因表達(dá)基因抑制，導(dǎo)入外源基因以抑制原有的基因，目的在于阻斷有害基因的表達(dá)基因封閉，主要是指反義RNA，并被譽(yù)為“基因封條”引入特定基因以提高免疫力，向TIL細(xì)胞導(dǎo)入TNF、IL-2、干擾素等第10頁/共93頁11基因治療的內(nèi)容治療基因的選擇：缺陷對(duì)應(yīng)基因；治療意義基因靶細(xì)胞的選擇：生殖細(xì)胞；體細(xì)胞（淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞等）治療基因?qū)氚屑?xì)胞的載體：病毒載體；非病毒載體導(dǎo)入基因的方式：exvivo；invivo基因治療的方案：基因矯正或置換；基因增補(bǔ)；基因滅活；導(dǎo)入非特異性基因第11頁/共93頁12基本步驟治療性基因的選擇基因載體的選擇靶細(xì)胞的選擇基因轉(zhuǎn)移治療基因在靶細(xì)胞中的正確表達(dá)回輸體內(nèi)第12頁/共93頁13第13頁/共93頁14（一）.治療性基因的選擇在體內(nèi)僅有少量的表達(dá)就可顯著改善癥狀；該基因的過高表達(dá)不會(huì)對(duì)機(jī)體造成危害；在抗病毒和病原體的基因治療中，選擇的靶基因應(yīng)在病毒和病原體的生活史中起重要的作用，并且該序列是特異的.腫瘤病人多有免疫缺陷，可選用免疫因子基因轉(zhuǎn)入人體；可采用反義技術(shù)封閉細(xì)胞內(nèi)活化的癌基因或向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入野生型抑癌基因，抑制腫瘤生長，所針對(duì)的癌基因或抑癌基因應(yīng)與該腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有明確的相關(guān)性。第14頁/共93頁15特異正常基因的分離與克隆應(yīng)用重組DNA和分子克隆技術(shù)，許多人類基因被分離和克隆，這是基因治療的前提。在當(dāng)代分子生物技術(shù)條件下，一般來說，只要有基因探針和準(zhǔn)確的基因定位，任何基因都可被克隆。第15頁/共93頁16此外，現(xiàn)在既可人工合成DNA探針，還可用DNA合成儀在體外人工合成基因，這些都是在基因治療前，分離克隆特異基因的有利條件。第16頁/共93頁17（二）.載體的選擇理想的基因轉(zhuǎn)移載體條件： ①高轉(zhuǎn)移頻率； ②容量大； ③高滴度； ④外源基因穩(wěn)定表達(dá)； ⑤靶向性； ⑥安全性高第17頁/共93頁18載體的種類病毒載體：逆轉(zhuǎn)錄病毒（RV）、腺病毒（AV)、腺相關(guān)的病毒(AAV)、皰疹病毒和肝炎病毒等。非病毒載體：這類載體的發(fā)展較快，目前主要是脂質(zhì)體(liposome)。第18頁/共93頁19幾種常用的病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 8.5 kb腺病毒載體 36 kb腺相關(guān)病毒載體 5 kb第19頁/共93頁20第20頁/共93頁21逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活史將病毒RNA包裝成病毒顆粒逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合細(xì)胞表面將RNA注入細(xì)胞質(zhì)逆轉(zhuǎn)錄合成前病毒整合到靶細(xì)胞染色體上合成病毒RNA合成病毒蛋白質(zhì)病毒外殼蛋白質(zhì)以出芽的方式從宿主細(xì)胞中分泌出來第21頁/共93頁22第22頁/共93頁逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因結(jié)構(gòu)與病毒復(fù)制相關(guān)的基因位點(diǎn)

gag：編碼病毒核心蛋白

pol：編碼逆轉(zhuǎn)錄酶

env：編碼外殼蛋白LTRLTRGagpolenv與病毒整合包裝相關(guān)的基因位點(diǎn)

LTR：啟動(dòng)子與增強(qiáng)子等

PB＋，PB－：引物結(jié)合位點(diǎn)位點(diǎn)：病毒RNA包裝成病毒顆粒所必須（區(qū)）選擇基因靶基因第23頁/共93頁24在反轉(zhuǎn)錄病毒載體中，最常用于人類的是莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒(moloneyleukemiavirus；MoMLV)

U3RU5

U3RU5gagpolenv

LTRLTRLTR：長末端順序，內(nèi)含啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及有關(guān)調(diào)節(jié)順序gag：病毒核心抗原基因；env:病毒外殼蛋白基因pol：反轉(zhuǎn)錄酶基因第24頁/共93頁25逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的優(yōu)點(diǎn)1.插入的片段可長達(dá)7kb2.基因轉(zhuǎn)移效率高，近100％，但必須是正在分裂的細(xì)胞3.可整合宿主染色體，外源基因可以穩(wěn)定表達(dá)，并隨細(xì)胞分裂而傳代4.宿主范圍廣5.比較安全第25頁/共93頁26逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的缺點(diǎn)要求靶細(xì)胞DNA合成很活躍，因?yàn)椴《镜母腥竞筒迦胱饔镁蕾囉诎屑?xì)胞DNA的復(fù)制靶細(xì)胞表面需要有特殊的受體必須應(yīng)用帶有缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的細(xì)胞（包裝細(xì)胞）滴度低整合入宿主為隨機(jī)性，有致突變可能第26頁/共93頁腺病毒載體（AV）腺病毒最早是從腺樣組織分離出來。其對(duì)淋巴腺有親和力，可以在淋巴腺中潛伏很久。可以侵入呼吸道、腸道、結(jié)膜，在呼吸道中可以引起呼吸道的各種發(fā)炎腺病毒載體為無包膜的雙鏈DNA病毒，基因組為36kb，了解清楚。4型與7型應(yīng)用多年，證實(shí)對(duì)人體無害AV有較大的宿主范圍，可以感染非分裂細(xì)胞，在invivo的基因轉(zhuǎn)移上優(yōu)勢較大AV感染細(xì)胞時(shí)其DNA不整合到宿主的染色體上，無潛在的致癌危險(xiǎn)第27頁/共93頁28腺病毒賴氨酸DNA復(fù)合體第28頁/共93頁29病毒載體病毒DNA病毒DNA有功能的人類基因病人病人細(xì)胞培養(yǎng)人的外源基因包裝在缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒中感染細(xì)胞，經(jīng)過培養(yǎng)后再輸入病人體內(nèi)進(jìn)行治療模式圖第29頁/共93頁30腺病毒載體的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：滴度高可插入8kb的源DNA片段可用于體內(nèi)基因直接轉(zhuǎn)移缺點(diǎn)：不能整合，只能瞬時(shí)表達(dá)，遺傳病不能應(yīng)用在體內(nèi)存在復(fù)制的可能性，安全性值得注意第30頁/共93頁31腺相關(guān)病毒（AAV）是目前已知的動(dòng)物病毒中最簡單的一類單鏈線狀DNA病毒基因組僅5kb，包含3個(gè)啟動(dòng)子和2個(gè)基因本身是缺陷型基因，需要輔助病毒如腺病毒或痘苗病毒的存在才能進(jìn)行有效的復(fù)制和感染

第31頁/共93頁32腺相關(guān)病毒優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：原病毒對(duì)人沒有致病性能整合到染色體上的特殊位點(diǎn)，減少插入突變的可能性能整合非分裂細(xì)胞外源基因表達(dá)穩(wěn)定缺點(diǎn)：不能插入大于3.5kb的外源片段包裝時(shí)需要輔助病毒滴度低第32頁/共93頁33非病毒法轉(zhuǎn)移目的基因顯微注射法磷酸鈣共沉淀法微粒轟擊法脂質(zhì)體法細(xì)胞受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)第33頁/共93頁34第34頁/共93頁35（三）靶細(xì)胞的選擇方便從體內(nèi)取出，且方便植回體內(nèi)。在體外能用常規(guī)方法大量繁殖?，F(xiàn)有的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)能高效地將外源基因植入。植入體內(nèi)后，能高效持久的表達(dá)外源基因。第35頁/共93頁36生殖細(xì)胞（germ-linecell）體細(xì)胞（somaticcell）體細(xì)胞基因治療的發(fā)展較生殖細(xì)胞的基因治療的發(fā)展更為成熟生殖細(xì)胞基因治療對(duì)絕大多數(shù)隱性遺傳性疾病的根治具有重要意義，關(guān)鍵在于基因生殖細(xì)胞的識(shí)別和鑒定。常用的靶細(xì)胞第36頁/共93頁37常用的靶細(xì)胞淋巴細(xì)胞： 回輸后體內(nèi)壽命不長造血干細(xì)胞： 轉(zhuǎn)移效率與體內(nèi)表達(dá)不高成纖維細(xì)胞： 治療血友病B肌肉細(xì)胞： 直接的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移肝細(xì)胞： 內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞等第37頁/共93頁38（四）基因轉(zhuǎn)移非病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移：---顯微注射、電穿孔、DNA直接注射、基因槍---磷酸鈣沉淀法、DEAE-葡聚糖法、脂質(zhì)體法病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移：---轉(zhuǎn)染第38頁/共93頁39

①顯微注射法用特殊的顯微注射器將表達(dá)質(zhì)粒直接注射入細(xì)胞中而使之得以表達(dá)，轉(zhuǎn)化效率低，約為1～10%,,為暫時(shí)性表達(dá)。溶液類型對(duì)基因表達(dá)有影響：重組DNA可貯存于5%～30%的蔗糖溶液中也可用生理鹽水或PBS第39頁/共93頁40將目的基因在Cacl2和Na2HPO4存在的條件下，形成DNA-Ca3(PO4)2沉淀混合物，通過細(xì)胞的吞飲作用進(jìn)入細(xì)胞，本法只能用于體外基因轉(zhuǎn)移。②磷酸鈣共沉淀法第40頁/共93頁41③脂質(zhì)體(liposomes)第41頁/共93頁42脂質(zhì)體是由脂類形成的一種可以高效包裝DNA的人造單層膜，是一種脂質(zhì)雙層包圍水溶液的脂質(zhì)微球。其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與細(xì)胞膜極為相似，二者易于融合，DNA由于細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。第42頁/共93頁43人工脂質(zhì)體膜具有如下特點(diǎn)：

與體細(xì)胞相容，無毒性和免疫原性可生物降解，不會(huì)在體內(nèi)堆積可制成球狀(0.03~50m)，包容大小不同的生物活性分子可帶有不同的電荷具有不同的膜脂流動(dòng)性、穩(wěn)定性、及溫度敏感性，能適應(yīng)不同的生理要求第43頁/共93頁44外源基因的篩檢抗性篩選方法：同源重組

------重組載體上插入有標(biāo)記基因NeoR（新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因），導(dǎo)入受體細(xì)胞后可使其產(chǎn)生對(duì)G418（Geneticin，氨基糖苷類抗生素）藥物的抗性。在加入G418的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇性培養(yǎng)時(shí)，轉(zhuǎn)染NeoR基因的細(xì)胞能夠存活，而未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞則死亡；應(yīng)用標(biāo)記基因作為探針進(jìn)行分子雜交法篩選。

第44頁/共93頁45（五）外源基因表達(dá)的鑒定：---采用Northern印跡雜交：檢測mRNA的表達(dá)-----測定其表達(dá)產(chǎn)物即蛋白質(zhì)的含量等方法。第45頁/共93頁46靜脈注射、肌注、皮下注射、滴鼻等基因修飾的淋巴細(xì)胞以靜脈注射的方式回輸?shù)窖褐?；將皮膚成纖維細(xì)胞以細(xì)胞膠原懸液注射至患者皮下組織；采用自體骨髓移植的方法輸入造血細(xì)胞；或以導(dǎo)管技術(shù)將血管內(nèi)皮細(xì)胞定位輸入血管等。（六）回輸體內(nèi)的方式第46頁/共93頁47基因治療的基本步驟選擇治療性基因選擇基因載體選擇靶細(xì)胞轉(zhuǎn)移基因在靶細(xì)胞中正確表達(dá)治療基因回輸體內(nèi)第47頁/共93頁48基因治療的應(yīng)用遺傳?。夯蛟鲅a(bǔ)，導(dǎo)入正常基因腫瘤：基因的補(bǔ)充和修復(fù)（基因增補(bǔ)、基因矯正），免疫療法，細(xì)胞毒基因療法（自殺基因）等病毒性疾病：阻斷病毒基因在體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯（基因失活）第48頁/共93頁49遺傳性疾病的基因治療第49頁/共93頁50例：苯丙酮尿癥的基因治療苯丙氨酸苯丙氨酸羥化酶酪氨酸苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨基作用對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有毒性癡呆第50頁/共93頁51苯丙酮酸尿癥I型病因：體內(nèi)的苯丙氨酸羥化酶缺乏。主征：智力低下，尿有霉味或鼠尿味診斷：血中苯丙氨酸增高(>20mg/ml)，尿中苯丙氨酸、苯丙酮酸增高治療：新生兒診斷明確后，即用低苯丙氨酸飲食控制血中苯丙氨酸濃度在3-10mg/ml，持續(xù)時(shí)間至少至6-8歲第51頁/共93頁52

治療性基因：苯丙氨酸羥化酶（PAH）載體：逆轉(zhuǎn)錄病毒；腺病毒（FangB,1994）靶細(xì)胞：肝細(xì)胞（FangB,1994）；T淋巴細(xì)胞（LinCM,1997）-----自體細(xì)胞；同種異體細(xì)胞動(dòng)物模型：鼠、兔、狗（PAH缺陷）臨床實(shí)驗(yàn)效果評(píng)價(jià)：以鼠（PAH-）為模型的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，只要鼠肝中PAH的活性達(dá)到正常水平的10%-20%，就足以使血清中苯丙氨酸的水平恢復(fù)正常。苯丙酮尿癥的基因治療第52頁/共93頁53哪些遺傳病是基因治療的對(duì)象？對(duì)致病基因有詳細(xì)地了解，并已獲得該基因主要以單基因缺損為主只要表達(dá)較少量原來缺乏的基因產(chǎn)物就能矯正疾病導(dǎo)入的基因過量表達(dá)，對(duì)機(jī)體無不良作用第53頁/共93頁54基因治療在遺傳病中的實(shí)際應(yīng)用腺苷酸脫氨酶缺陷的嚴(yán)重聯(lián)合型免疫缺陷癥（SCID） （T淋巴細(xì)胞）家族性高膽固醇血癥 （肝細(xì)胞）囊性纖維變性 （腺病毒載體）Gaucher癥血友病 （成纖維細(xì)胞）第54頁/共93頁55血友病的基因治療血友病是X染色體連鎖遺傳性出血性遺傳病，甲型、乙型血友病分別由凝血因子Ⅷ與Ⅳ的缺陷引起。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：復(fù)旦大學(xué)，反轉(zhuǎn)錄病毒攜帶Ⅳ因子兔子皮膚成纖維細(xì)胞，篩選后，包埋回兔子體內(nèi)，可檢測到血漿中的Ⅳ因子蛋白，持續(xù)1年以上。1991年12月3日，復(fù)旦大學(xué)遺傳所與二軍大長海醫(yī)院，對(duì)兩例血友病乙型進(jìn)行基因治療。臨床出血癥狀明顯改善。第55頁/共93頁56腫瘤的基因治療第56頁/共93頁57城市居民死因排序：1.惡性腫瘤139.28/10萬；2.腦血管病137.72/10萬；3.心臟病106.58/10萬；4.呼吸系統(tǒng)疾病86.84/10萬；5.損傷和中毒38.73/10萬；6.消化系統(tǒng)疾病18.65/10萬。農(nóng)村居民死因排序：1.呼吸系統(tǒng)疾病142.06/10萬；2.腦血疾病113.05/10萬；3.惡性腫瘤105.57/10萬；4.心臟病80.07/10萬；5.損傷和中毒69.22/10萬；6.消化系統(tǒng)疾病24.80/10萬.1998年我國居民十大死因排序第57頁/共93頁58癌癥治本之療法傳統(tǒng)的癌癥治療方法，不外乎外科手術(shù)、放射線治療、化學(xué)治療等，都只能治標(biāo)，不能治本?；旧?，一個(gè)人要________與________這兩種基因同時(shí)發(fā)生損害時(shí)，才會(huì)產(chǎn)生癌癥。腫瘤細(xì)胞多是由基因突變、失落、轉(zhuǎn)移或擴(kuò)增引起的。基因改變是腫瘤產(chǎn)生的根本原因，所以基因治療是治療腫瘤的根本療法。原癌基因抑癌基因第58頁/共93頁59癌基因的了解癌基因(oncogene)又名轉(zhuǎn)化基因，是人類或其它動(dòng)物細(xì)胞以及致癌病毒基因組中固有的一類基因，一旦激活能促使人和動(dòng)物的正常細(xì)胞發(fā)生癌變在致癌病毒基因組中存在的癌基因稱為病毒癌基因（viraloncogene或v-onc）在人類或其它動(dòng)物基因組中存在的癌基因稱為細(xì)胞癌基因（cellularoncogene或c-onc）或原癌基因(proto-oncogene)。第59頁/共93頁60癌基因的分類生長因子類癌基因： sis癌基因生長因子受體類癌基因： KIT癌基因非受體蛋白質(zhì)酪氨酸激酶癌基因：RET癌基因細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)激酶類癌基因： PIM1癌基因G蛋白質(zhì)類癌基因： RAS家族核結(jié)合蛋白癌基因： EST家族、JUN家族第60頁/共93頁61癌基因的協(xié)同作用一個(gè)癌基因不能使細(xì)胞癌變多數(shù)細(xì)胞癌變需要2個(gè)癌基因先后表達(dá)一種腫瘤中有多個(gè)癌基因表達(dá)部位發(fā)生作用癌基因類別細(xì)胞外生長因子生長因子類細(xì)胞膜生長因子受體蛋白激酶類細(xì)胞漿GTP結(jié)合蛋白信息傳遞蛋白類細(xì)胞核核內(nèi)癌基因蛋白核內(nèi)蛋白類癌基因產(chǎn)物過量表達(dá)，細(xì)胞生長失控癌變第61頁/共93頁62腫瘤的基因治療策略1.腫瘤的細(xì)胞因子基因療法2.腫瘤的抑癌基因療法3.反義基因療法4.共刺激分子基因療法5.腫瘤的自殺基因療法6.多藥耐藥基因療法7.腫瘤的MHC基因治療第62頁/共93頁63腫瘤的細(xì)胞因子基因療法免疫效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞因子療法原理是將細(xì)胞因子基因?qū)肟鼓[瘤免疫效應(yīng)細(xì)胞中，使之抗腫瘤作用增強(qiáng)TIL、LAK、CTL等腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞因子療法將細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)染入腫瘤細(xì)胞中，制備出免疫原性更強(qiáng)的新型瘤苗，以激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生顯著的抗腫瘤功能幾乎所有的細(xì)胞因子：IL-1~IL-12、G-CSF、M-CSF、TNF細(xì)胞因子的直接體內(nèi)療法將包含細(xì)胞因子基因的表達(dá)載體，直接體內(nèi)注射，經(jīng)機(jī)體的細(xì)胞攝取后，可在體內(nèi)表達(dá)第63頁/共93頁64TIL細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞因子基因治療第一個(gè)被美國重組DNA顧問委員會(huì)和FDA批準(zhǔn)的腫瘤基因治療計(jì)劃NIH的Rosengerg教授以細(xì)胞因子（TNF或IL-2)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)TIL細(xì)胞治療晚期惡性黑色素瘤患者總結(jié)了50例轉(zhuǎn)移惡性黑色素瘤患者經(jīng)TIL細(xì)胞配合IL–2治療的效果，客觀消退率為38%。但實(shí)際臨床效果并不十分滿意，修飾過的TIL細(xì)胞很難定位到達(dá)腫瘤部位，大部分分布在肝脾。TNF的表達(dá)也達(dá)不到治療水平。第64頁/共93頁65抑癌基因療法應(yīng)用抑癌基因療法有二：利用抑癌基因療法治療已發(fā)生的腫瘤利用抑癌基因療法防止腫瘤的轉(zhuǎn)移Rb基因：視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、膀胱癌、乳腺癌、骨肉瘤等P53基因：人類腫瘤相關(guān)性最高的基因50%的人類腫瘤均可檢測到P53基因的突變結(jié)腸癌細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞白血病野生型P53基因的替代療法突變型P53基因的阻斷療法與P53基因有關(guān)的新型腫瘤疫苗的研究MTS基因：75%腫瘤與之有相關(guān)性；P16蛋白抑制腫瘤發(fā)生Nm23基因：抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的基因第65頁/共93頁66反義基因（核酸）療法多應(yīng)用于抗腫瘤和抗病毒感染治療抗腫瘤療法：應(yīng)用反義基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平阻斷某些異常基因的表達(dá)，以期阻斷瘤細(xì)胞內(nèi)異常信號(hào)的傳導(dǎo)，使瘤細(xì)胞進(jìn)入正常分化軌道或引起細(xì)胞凋亡抗病毒感染：用反義DNA或反義RNA來阻斷DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而達(dá)到抗病毒的目的第66頁/共93頁67反義基因的種類人工合成的寡脫氧核苷酸，進(jìn)入機(jī)體后以胞吞的方式進(jìn)入細(xì)胞，直接結(jié)合到DNA雙鏈的特定部位，形成三聚體，影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄不能啟動(dòng)反義基因連接到特定的表達(dá)載體上，導(dǎo)入靶細(xì)胞后，直接轉(zhuǎn)錄出反義RNA，與相應(yīng)的mRNA形成雙鏈，阻斷翻譯過程第三種是核酶（ribozyme)，具有催化活性的反義基因，其與相應(yīng)的mRNA結(jié)合后能發(fā)揮酶活性，將mRNA降解第67頁/共93頁68反義核酸在應(yīng)用中的問題 腫瘤是多基因改變導(dǎo)致的結(jié)果單一癌基因的阻斷并不能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長反義核酸在機(jī)體內(nèi)的特異性或靶向性擔(dān)心對(duì)靶基因周圍的細(xì)胞產(chǎn)生非特異性阻斷反義寡聚物的代謝體內(nèi)迅速失活成為亟待解決的問題第68頁/共93頁69腫瘤的自殺基因療法自殺基因，又稱為前體藥物轉(zhuǎn)換酶基因，轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞后，可將某些無毒性的前體藥物在腫瘤細(xì)胞中代謝成毒性產(chǎn)物，從而殺死腫瘤，而攜帶該基因的受體細(xì)胞也被殺死，故稱之為“自殺基因”。旁觀者效應(yīng)殺傷未導(dǎo)入基因的鄰近分裂的細(xì)胞，擴(kuò)大其殺傷效應(yīng)單純皰疹病毒的tk基因（HSV-tk）水痘-帶狀皰疹病毒的tk基因（VIV-tk）胞嘧啶脫氨酶基因（cytosinedeaminase,CD）第69頁/共93頁70自殺基因療法的策略以HSV-tk基因和CD基因應(yīng)用最多HSV-tk催化脫氧胸苷酸外，還能催化前藥物GCV(gancilovir)磷酸化，產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性，抑制細(xì)胞內(nèi)DNA聚合酶的作用。CD是某些細(xì)菌表達(dá)的脫氨酶，哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)無此基因。該酶可將無毒性的前體藥物5Fc代謝為常用的化療藥物5-Fu。體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)镕dUMP，是胸苷酸合成酶的抑制劑，抑制細(xì)胞DNA合成。第70頁/共93頁71轉(zhuǎn)基因腫瘤疫苗療法

機(jī)體抗腫瘤的免疫必須依賴于腫瘤細(xì)胞的抗原被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別，方能激活。人類腫瘤免疫原性弱，且抗原呈遞中存在多個(gè)環(huán)節(jié)缺陷，使腫瘤逃避機(jī)體免疫識(shí)別。將細(xì)胞因子或免疫相關(guān)基因?qū)肽[瘤細(xì)胞制備腫瘤疫苗，可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞抗原性以及抗體對(duì)腫瘤抗原的識(shí)別和呈遞能力，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫能力。腫瘤細(xì)胞導(dǎo)入免疫相關(guān)MHC基因，提高抗原呈遞能力細(xì)胞因子基因（IL、TNF、GM-CSF）導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞第71頁/共93頁72感染性疾病的基因治療第72頁/共93頁73引入治療基因來抑制病原繁殖方法:Anti-senseRNARibozyme感染性疾病的基因治療第73頁/共93頁74抗病毒基因治療策略基因修飾和基因失活是常用的策略抗病毒感染的主要矛盾是機(jī)體對(duì)病毒的免疫力和病毒對(duì)機(jī)體的致病力相互之間的對(duì)抗?；蛐揎椉夹g(shù)將抗病毒基因?qū)肴梭w進(jìn)行表達(dá)基因失活技術(shù)則是根據(jù)：病毒感染性疾病，病毒本身對(duì)細(xì)胞的損傷作用一般情況下不是重要的原因，而是病毒復(fù)制和表達(dá)產(chǎn)物對(duì)機(jī)體來說是很強(qiáng)的抗原物質(zhì)，引發(fā)機(jī)體對(duì)感染細(xì)胞的免疫應(yīng)答效應(yīng)所致，因此從分子水平上抑制病毒基因的復(fù)制和表達(dá)是有效的治療第74頁/共93頁75抗病毒基因修飾策略將編碼細(xì)胞因子，特別是在免疫調(diào)節(jié)中起重要作用的淋巴因子的基因，導(dǎo)入機(jī)體進(jìn)行表達(dá)。常用的是干擾素、白細(xì)胞介素、集落刺激因子（GM－CSF，G－CSF，M－CSF）淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞（lymphokineactiveatedkiller,LAK）受到廣泛重視第75頁/共93頁76反義RNA療法反義RNA：指與mRNA互補(bǔ)的RNA分子，可與對(duì)應(yīng)的RNA分子特異性結(jié)合，從而抑制該RNA的加工和翻譯。AAA反義RNA核DNAAAA核DNAPro用途：抗腫瘤、抗病毒感染第76頁/共93頁77例：艾滋病的防治HIV----20世紀(jì)的瘟疫

-----由于人類免疫缺陷病毒（HIV）感染，特異性破壞CD4+細(xì)胞，使機(jī)體發(fā)生免疫缺陷，造成機(jī)體發(fā)生腫瘤、機(jī)會(huì)性感染的一種致死性疾病。HIV屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中HIV-I型是引起全球AIDS流行的主要病源。HIV的基因結(jié)構(gòu)和組合形式與其他的逆轉(zhuǎn)錄病毒相似，均是5‘LTR,gag,pro,pol,env和3’LTR，此外，尚有多個(gè)調(diào)節(jié)基因（tat,rev,nef,vif,vpu,vpr,vpx,tev）。第77頁/共93頁78HIV的反義核酸基因治療靶序列：tat,rev,nef,vpu,gag及5‘端的引物結(jié)合序列等。載體：逆轉(zhuǎn)錄病毒；腺相關(guān)病毒靶細(xì)胞：CD4+細(xì)胞（體外）直接體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)效果評(píng)價(jià)：Chatteriee等將與HIV-1LTR序列互補(bǔ)的長度為63bp的寡核苷酸序列與腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建重組體，將其導(dǎo)入T細(xì)胞系中，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化細(xì)胞在HIV-I感染后，其病毒滴度下降1000倍。第78頁/共93頁79基因治療現(xiàn)狀至2002年9月為止，在全世界范圍內(nèi)已開展基因治療636例，其中美國進(jìn)行的最多。第79頁/共93頁80基因治療存在的問題與倫理學(xué)隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因治療雖然前景光明，但是在研究與實(shí)踐中存在許多不容回避的重要問題。第80頁/共93頁81外源基因轉(zhuǎn)移入病人體內(nèi)細(xì)胞表達(dá)，首先與轉(zhuǎn)移方法有關(guān)?；瘜W(xué)和物理方法所導(dǎo)人的基因效率低；選擇適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞；反轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)基因?qū)?，只能?duì)分裂狀態(tài)時(shí)的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，因此采取如5-FU處理，使細(xì)胞分裂增強(qiáng)，再用含有目的基因病毒顆粒轉(zhuǎn)染可獲較好效果。1、導(dǎo)入基因的穩(wěn)定高效表達(dá)第81頁/共93頁822．導(dǎo)入基因的安全性基因治療的安全性應(yīng)確保不因?qū)说耐庠茨康幕蚨a(chǎn)生新的有害遺傳變異。因此，應(yīng)構(gòu)建相對(duì)安全的反轉(zhuǎn)錄病毒載體。至于引起插入突變可能失活一個(gè)重要基因，或更嚴(yán)重的是激活一個(gè)原癌基因，這個(gè)問題的危險(xiǎn)程度到底有多大目前仍下甚清楚。第82頁/共93頁83安全性的另一個(gè)主要方面就是生殖細(xì)胞基因治療。雖然在人類尚未實(shí)施，但在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已成功，這就是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的出現(xiàn)。這一事實(shí)既給人類生殖細(xì)胞基固治療帶來了希望，同時(shí)也使人們耽心這種遺傳特征的變化世代相傳，將給人類帶來的是福還是禍。因此，許多科學(xué)家不僅對(duì)此恃慎重態(tài)度，還有的持反對(duì)態(tài)度，也就是基因治療可能具有的潛在危險(xiǎn)性。第83頁/共93頁843．基因治療與社會(huì)倫理道德體細(xì)胞基因治療在倫理道德方面是不存在任何問題的的，但試圖糾正生殖細(xì)胞遺傳缺陷或通過遺傳