生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)deae纖維素離子交換

綜合實(shí)驗(yàn)（第二次）

DEAE-纖維素離子交換層析與活力測(cè)定及蛋白定量生化教研室蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)的分離純化是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行研究的一項(xiàng)必需的和基礎(chǔ)的工作。目前常使用的分離純化的方法或技術(shù)都是在了解蛋白質(zhì)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的基礎(chǔ)上建立的。

目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離純化程序主要包括⑴材料的選擇；⑵組織勻漿和破碎細(xì)胞獲取粗提取液；⑶蛋白質(zhì)初步提純；⑷選擇一種或幾種合適的方法除去雜蛋白,直至完全純化；⑸目標(biāo)蛋白的鑒定。用于研究目的蛋白質(zhì)通常應(yīng)保持它的生物活性較低溫度下(0－4℃)操作，注意使用蛋白酶(使蛋白質(zhì)降解的酶)的抑制劑，避免使用劇烈條件，以免蛋白質(zhì)特定的折疊結(jié)構(gòu)受到破壞。綜合實(shí)驗(yàn)內(nèi)容第一部分：（上周）經(jīng)G-25層析除鹽得到α1-AT粗提樣品第二部分：（本周）采用DEAE-纖維素離子交換層析純化粗提α1-AT

第三部分：（下周）采用SDS電泳鑒定純化得到的粗提和精提蛋白質(zhì)第二部分DEAE-纖維素離子交換層析（IonExchangeChromatography,IEC）及活力測(cè)定、蛋白定量DEAE:二乙基氨基乙基本次實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、提純上次實(shí)驗(yàn)得到的粗提液，以獲得高純度蛋白2、掌握DEAE-纖維素離子交換層析原理與實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)3、通過(guò)檢測(cè)α1-AT對(duì)胰蛋白酶的抑制力來(lái)測(cè)定α1-AT的活力根據(jù)待分離物質(zhì)帶電性質(zhì)不同的分離純化方法。

以離子交換劑為固定相，特定的離子溶液為流動(dòng)相，依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的結(jié)合力不同進(jìn)行分離純化的層析方式。離子交換層析（IonExchangeChromatography,IEC）的基本原理原理DEAE-cellulose是應(yīng)用最廣的陰離子交換劑，本身帶有正電荷，能吸附溶液中的陰離子。當(dāng)使用含有“-”的溶液洗柱時(shí)，含“-”少的首先被洗脫下來(lái)（球蛋白表面帶的“-”少）當(dāng)增加“-”濃度時(shí)，含“-”多的后被洗脫本實(shí)驗(yàn)用DEAE-纖維素，以除去樣品中的大部分球蛋白親和力大的先被交換上去,后被洗脫下來(lái).A+BABAB柱層析離子交換層析法將交換上去的離子，用適當(dāng)?shù)南疵搫┮来蜗疵摱蛛x.樹脂－O—N+(CH3)2

—OH-離子交換劑離子交換劑由基質(zhì)、電荷基團(tuán)（或稱功能基團(tuán)）和反離子組成?；|(zhì)一般是不溶性聚合物，如纖維素，交聯(lián)葡聚糖，交聯(lián)瓊脂糖等；

纖維素－O—CH2—COO-—Na＋基質(zhì)電荷基團(tuán)反離子陽(yáng)離子交換劑陰離子交換劑離子交換劑的選擇考慮因素：

1.被分離物質(zhì)帶何種電荷2.被分離物質(zhì)分子的大小大分子物質(zhì)選用凝膠，其次選用纖維素3.被分離物質(zhì)所處的環(huán)境4.被分離物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)5.被分離物質(zhì)的大概數(shù)量對(duì)于兩性蛋白而言，結(jié)合力取決于其等電點(diǎn)以及溶液的pH值。（蛋白質(zhì)由氨基酸組成，是一種兩性電解質(zhì)，在一定pH條件下可帶電荷）cationzwitterionanion+H++H+R—CH—COOH|NH3+R—CH—COO-|NH3+R—CH—COO-|NH2-H+-H+A+A0A-pH<pIpH=pIpH>pI起始緩沖液的選擇原則：不能與樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，避免使樣品變性。其pH值和離子強(qiáng)度等能使樣品中有效成分與離子交換劑結(jié)合，而不能使樣品中雜質(zhì)與離子交換劑結(jié)合。洗脫液指一定離子強(qiáng)度與一定pH值的緩沖溶液洗脫方法：改變洗脫液的離子強(qiáng)度增強(qiáng)洗脫液與離子交換劑的結(jié)合力改變洗脫液的pH降低待分離物與離子交換劑的結(jié)合力洗脫方式：階段洗脫法梯度洗脫法人血漿蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)及分子量蛋白質(zhì)等電點(diǎn)分子量清蛋白4.8869000α1-球蛋白5.06200000α2-球蛋白5.06300000β-球蛋白5.129000-150000γ-球蛋白6.85-7.50156000-3000000.05mol/LPBS緩沖液（pH6.4）血清蛋白質(zhì)中α1-球蛋白α2-球蛋白β-球蛋白在pH高于它們pI的緩沖液中則帶“-”實(shí)驗(yàn)原理采用DEAE-纖維素離子交換層析純化蛋白。洗脫液為0.05mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.4）。在此pH與離子強(qiáng)度時(shí)，DEAE-纖維素帶有正電荷，能吸附帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)如白蛋白（pI4.9）帶正電荷蛋白質(zhì)如γ-球蛋白（pI約7.3），不被吸附故直接流出。用0.03mol/L磷酸鹽緩沖液洗脫吸附在離子交換柱上的少量β-球蛋白及α-球蛋白。將磷酸鹽濃度提高至0.12mol/L，白蛋白被洗脫下來(lái)（作為精制提取蛋白）。材料與試劑1、主要材料層析柱（1.6×20cm）、固定架、離心管（不同規(guī)格）2、主要試劑

0.05mol/LPBS（pH6.4）0.12mol/LPBS（pH6.4）DEAE-cellulose3、樣品：經(jīng)G-25凝膠層析除鹽的α1-AT粗提液實(shí)驗(yàn)步驟DEAE—纖維素層析柱的準(zhǔn)備

（1）酸堿處理：DEAE-纖維素可按0.5mol/LNaOH→0.5mol/LHCl→0.5mol/LNaOH（堿→酸→堿）程序處理。（2）裝柱：DEAE纖維素用0.05mol/LPBS（pH6.4）浸泡后裝柱，柱床體積約1.6cm×6cm裝柱時(shí)應(yīng)注意裝柱均勻，柱床內(nèi)不得有界面、氣泡，表面要平整。（3）平衡：裝柱后接上恒壓貯液瓶，用0.06mol/LPBS（pH6.4）洗滌平衡，流速15d/min。

2、DEAE—纖維素層析純化白蛋白1）上樣：將剩余（留取2ml用作下次實(shí)驗(yàn)）樣品貼壁旋轉(zhuǎn)加入上述已平衡好的層析柱表面，使樣品進(jìn)入柱床內(nèi)。小心用PBS洗滌沾在管壁上的蛋白質(zhì)樣品，使其進(jìn)入床內(nèi)。2）洗脫：首先用0.05mol/LPBS洗脫，用雙縮脲試劑檢查洗脫液，出現(xiàn)紫紅，為第一峰蛋白，直至無(wú)紫色（即無(wú)蛋白）則停止收集。第二3）白蛋白的純化：改用0.12mol/LPBS緩沖液（pH6.4）洗脫。每管1ml分部收集(調(diào)節(jié)部分收集器時(shí)間為1min/tube)。合并蛋白質(zhì)濃度高的2-3管，用于后續(xù)蛋白質(zhì)純度鑒定。由于純化的白蛋白仍然結(jié)合有少量膽色素等物質(zhì)，收集的蛋白質(zhì)為肉眼可見的淺黃色液體。4）再生平衡：改用

1.5mol/LNaCl—0.3mol/LNH4Ac緩沖液洗脫，至記錄儀基線基本恢復(fù)到原始位置后，再用40ml0.06mol/LNH4Ac（pH6.5）洗脫平衡即可。Samplediagramofagelfiltrationsystemwithgravityfeed.Thesafetyloopisdesignedtokeepthecolumnfromrunningdryifleftunattended.SafetyloopBSZ-100自動(dòng)部份收集器結(jié)構(gòu)與使用方法按“復(fù)位”鍵，儀器自動(dòng)復(fù)位至起點(diǎn)后“報(bào)警”，再按“復(fù)位”鍵，儀器自動(dòng)復(fù)位。設(shè)置定時(shí)時(shí)間：（1）按下“手動(dòng)/自動(dòng)”鍵，使儀器處于“手動(dòng)”狀態(tài)。（2）按“選擇”鍵，設(shè)定時(shí)間為1min。自動(dòng)收集按“手動(dòng)／自動(dòng)”鍵，指示燈亮，儀器處于自動(dòng)收集狀態(tài)。HD-3紫外檢測(cè)儀使用方法將波長(zhǎng)旋鈕旋到280nm.按下“電源”開關(guān)。調(diào)節(jié)“靈敏度”旋鈕至“100％”檔，調(diào)節(jié)“光量”旋鈕，使檢測(cè)儀數(shù)字顯示50左右進(jìn)行儀器預(yù)熱。開啟高位槽，使層析柱緩沖液流過(guò)檢測(cè)儀。在“靈敏度”旋鈕處于“100％”檔時(shí)，調(diào)節(jié)“光量”旋鈕，使檢測(cè)儀數(shù)字顯示為100，即透光率為100％。把“靈敏度”旋到所需檔（1A），調(diào)節(jié)“調(diào)零”旋鈕，使檢測(cè)儀數(shù)字顯示為“0”。在樣品檢測(cè)過(guò)程中，不可再調(diào)節(jié)“調(diào)零”、“光量”旋鈕。如繪出的圖譜即出峰過(guò)小，可改變“靈敏度”選擇檔，每檔成兩倍放大關(guān)系。

LM17型記錄儀使用說(shuō)明1.打開電源開關(guān)。2.調(diào)節(jié)零位：按“量程/零位”切換按鍵，當(dāng)“零位”指示燈亮?xí)r，數(shù)碼管顯示為“Po”。在零位調(diào)節(jié)狀態(tài)下，按下“左移”或“右移”按鍵不放，使記錄筆移至所需的零位。3.選擇量程：按“量程/零位”切換按鍵，當(dāng)“量程”指示燈亮?xí)r，表示當(dāng)前操作為量程選擇，按[增加]或[減少]鍵，選取合適的量程（HD-3紫外檢測(cè)儀的量程為10mV）。4.取下記錄筆的塑料筆套，壓下“抬/落筆手柄”（不要強(qiáng)力按壓筆尖，以避免筆尖損壞或變粗）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將塑料筆套套上，以避免墨水蒸發(fā)。5.選擇走紙速度：按“啟/?！鼻袚Q按鍵，當(dāng)紙速顯示數(shù)碼管閃爍時(shí)，此時(shí)按“調(diào)速”鍵調(diào)節(jié)選擇走紙的速度。每按一下，數(shù)字依次在0.1mm/min至600mm/min之間變化。調(diào)節(jié)走紙速度為2mm/min，按“啟/?！辨I，數(shù)碼管不再閃爍時(shí)，儀器即開始記錄。不記錄時(shí)按“啟/停”鍵，數(shù)碼管閃爍，表示停止走紙。量程/零位切換鍵量程顯示減少/左移鍵增加/右移鍵狀態(tài)指示燈電源指示燈盒式纖維筆紙速顯示調(diào)速啟停抬落筆手柄電源開關(guān)走紙手輪記錄紫外檢測(cè)儀所顯示的峰值，在洗脫曲線上標(biāo)示出所更換的溶液、峰值