項目4-10層析技術課件

食品分析

Foodanalysis

層析技術層析技術層析法也稱色譜法，是1906年俄國植物學家發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開，由此得名為“色譜法”。引言后來無色物質也可利用吸附柱層析分離。1944年出現(xiàn)紙層析。以后層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)氣相層析、高壓液相層析、薄層層析、親和層析、凝膠層析等。層析法的分類按兩相所處的狀態(tài)分類：

流動相有兩種狀態(tài)：

*液體作為流動相*氣體作為流動相固定相也有兩種狀態(tài)：

*固體吸附劑作為固定相*以吸附在固體上的液體作為固定相按兩相所處的狀態(tài)分為：液相層析液-固層析液-液層析氣相層析氣-固層析氣-液層析按層析過程的機理分類

吸附層析：利用吸附劑對不同組分吸附性能的差異，從而達到分離鑒定的目的。

分配層析：利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù)不同，使之分離。

離子交換層析：利用不同組分對離子交換劑親和力的不同，使之分離。

凝膠層析：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同，使之分離。按操作形式不同分類

柱層析：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個方向移動從而達到分離。

紙層析：用濾紙做液體的載體，點樣后，用流動相展開，以達到分離鑒定的目的。

薄層層析：將適當粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進行物質的分離和鑒定。柱層析把吸附劑裝在一支玻璃管中,做成色譜柱。然后將試液加在柱內(nèi)，若試液中含有A、B兩種組分，則A和B便被吸附劑（固定相）吸附在柱的上端。再用一種洗脫劑（流動相）進行沖脫，這時在管內(nèi)就連續(xù)不斷發(fā)生溶解、吸附、再溶解、再吸附的現(xiàn)象。如果對A的吸附能力較弱，則A就較易溶解而較難吸附，在柱中移動就較快。當沖洗到一定程度時，兩者即可以完全分開，形成兩個帶。在繼續(xù)沖洗，A物質便從柱中流出來，將流出液承接于一個容器中。然后B物質被洗脫下來，用另一個容器承接。這樣便可將A、B兩種物質分離。如下圖所示紙層析這是一種微量分離方法。用濾紙做載體，利用紙上吸著的水分作為固定相，將濾紙條點試液的一端浸在有機溶劑中（注意不要把原點浸入有機溶劑中）該有機溶劑為流動相（展開劑）。由于濾紙條毛細管的作用。流動相將不斷上升，當流動相上升的時候，與點在濾紙條上的試樣相遇，這時試樣中欲分離的組分就溶解在流動相中并隨之上升。當欲分離的組分遇到上面的固定相時，又溶解在固定相中而停下來，接著又被不斷上升的流動相所溶解。于是就在兩相之間一次又一次地發(fā)生分配過程（相當于一次又一次的萃取），從而將各組分逐個分開。特點：薄層層析法分離迅速，一般15~60min內(nèi)可以完成，操作簡便，靈敏度高。近年廣泛應該在制藥、農(nóng)藥、染料、抗生素等工業(yè)中。薄層層析操作方法1、硅膠CMC—Na薄層板的制備：稱取CMC—Na(羧甲基纖維素鈉)0.15g→溶于30mL蒸餾水中→攪拌(如不溶可加熱)至全部溶解→加入層析用硅膠10g→充分攪拌均勻，研磨成糊狀→倒入玻璃板，用食指和拇指拿住玻片，作前后左右輕輕搖動，至流動的硅膠均勻地鋪在玻璃片上,→水平放置，室溫陰干至無水氣存在→于105℃烘箱中活化2h→干燥器中冷卻備用2、點樣選取制備好的薄板一塊，在距底邊2cm的水平直線上選幾個點，各點間距1.5或2cm，離板邊約有l(wèi)cm的距離。用毛細管分別點上不同的樣品于各個點，樣品量控制在5~10μg，斑點直徑一般為2—3mm，干后再點一次。3、展層點樣完畢，待薄層上樣品自然干燥后，將薄板置于盛有層析溶劑的層折缸中，薄板與液面成15℃左右的夾角，點有樣品的一端浸入溶劑中，深達0.5cm左右、擴展劑液面應低于點樣線，蓋好層析槽蓋，自下向上展層，當展層溶劑到達離薄板頂端約1cm處時取出薄板，標出溶劑前沿位置，用熱風吹干。4、顯色：除盡溶劑后用噴霧器均勻地噴上顯色劑，烘干使其顯色，計算Rf值。

或使之出現(xiàn)各種有色的斑點，與標準進行對照比較，可確定其成分。Rf=起始線到樣品斑點中心距離

/起始線到溶劑前沿的距離

1、吸附層析技術吸附層析法（液-固色譜法，LSC）原理

利用固定相的固體吸附劑表面對不同組分吸附力的大小及洗脫液對它的溶解作用（解吸作用）的差異進行分離。特點

適合分離不同種類的化合物(醇類和芳香烴）二、吸附劑吸附劑是具有大表面積的活性多孔固體，活性多孔固體與待分離物質的極性官能團作用。常用的吸附劑有活性炭、硅石、氧化鋁、羥基磷灰石等。羥基磷灰石（HA）[Ca10(PO4)6.(OH)2],可用于分離蛋白質與核酸。其表面有Ca2+和PO43-兩種帶電基團；酸性和中性蛋白質可與Ca2+結合；堿性蛋白質可與PO43-結合。HA柱層析最重要的用途之一是分離單鏈DNA和雙鏈DNA，因為它對雙鏈DNA的親和力大于單鏈DNA。AABCDE3216168168441212228128層析柱分離物質的示意圖固定相為固體顆粒，裝在層析柱內(nèi)，高5cm，固定相周圍充滿液體流動相，每厘米柱中液相體積為1cm3。若在柱頂加入1cm3溶劑,其中含32mg樣品，同時應有相同體積的溶劑從柱底流出，此時樣品處于柱中A位置。若樣品的分配系數(shù)是1，則它在固相與液相間等量分配。若再有1cm3的溶劑加到柱上，A部分中的溶劑帶著16mg的物質向下移動到B，A和B中的物質都將發(fā)生再分配.3、凝膠過濾層析技術基本原理概念

（排阻層析，分子篩層析）：當生物大分子通過裝有凝膠顆粒的層析柱時，根據(jù)它們分子大小不同而進行分離的技術。原理

凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀結構，被分離的混合物流過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過的路程較長移動速度較慢，最后被洗脫出來。凝膠顆粒LogMABCLogM測V測LogM=k1-k2Ve蛋白質通過凝膠柱的速度即洗脫體積與其分子量有關，（Ve為洗脫體積）先測得幾種標準蛋白質的Ve，并以其分子量對數(shù)對Ve作圖得一直線，再測出待測樣品的Ve，查標準曲線即可確定分子量。原理

根據(jù)離子交換樹脂對需要分離的各種離子的親和力不同而達到分離的目的。將離子交換樹脂裝入層析柱。離子交換樹脂通常是不溶于水的高分子物質，分子中含有可解離的基團.含有酸性可解離基團的稱為陽離子交換樹脂，可解離出H+，含有堿性可解離基團的稱為陰離子交換樹脂，可解離出OH-4、離子交換層析法+CCC配基蛋白質1.配基固相化2.親和吸附固體載體3.解吸附6、免疫親和層析柱（IAC）近年來免疫親和層析柱（IAC）開始被用于有選擇性地從復雜基體樣本中提?。▋艋┬》肿哟郎y物，如藥物、激素、農(nóng)藥和真菌毒素等。IAC技術簡化了小分子待測物樣品凈化程序，避免了大量有毒、有異味的有機溶劑的使用。吸附原理待測物被柱子中免疫吸附劑上的抗體所吸附，通過淋洗除去柱上吸附的雜質，最后待測樣品被一種易蒸發(fā)的溶劑洗脫下來。用IAC技術，樣品通常只經(jīng)過一次萃取就