第九章植物的基因工程

第九章植物的基因工程第1頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一1.提高植物的農業(yè)價值和園藝價值。2.生物反應器3.研究基因的作用二、轉基因植物的主要目的充當某些重要蛋白質或次生代謝產(chǎn)物的廉價反應器。研究基因在發(fā)育及其他生理過程和代謝途徑中的作用。第2頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一三、植物基因工程的緊迫性1.糧食短缺（1）人口增加（2）耕地減少①土壤沙化②工業(yè)污染（3）氣候改變饑荒第3頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一第4頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一第5頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一第6頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一2.傳統(tǒng)育種方法的缺點（1）雜交性狀難選擇（2）遠緣親本難雜交（3）雜交過程耗時（4）不同物種不能雜交第7頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一到2030年，我國人口的持續(xù)增長將要達到高峰期，預計達到16億人口，解決這個龐大人口的口糧是一個新的挑戰(zhàn)。一個農業(yè)勞動力養(yǎng)活的人口數(shù)：美國：70人；日本：約25人；中國：4-5人。

第8頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一四、植物基因工程的優(yōu)勢1.植物細胞的全能性（totipotency）幾乎任何部位的單細胞都可以再生出完整的植株。2.植物容易大面積栽培葉片，莖尖分生組織,種子,幼胚,胚性懸浮細胞,胚性愈傷組織。大麥，燕麥，小麥，水稻，玉米，甘蔗，向日葵，香蕉，黃瓜，大豆，菜豆，煙草，棉花，楊樹，云杉，蘭花，苜蓿等。第9頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一可以把人的基因、植物的基因、動物的基因，任何一個基因都可以組合到植物里去。4.快速育種1997年，中國也發(fā)表了第五號國情報告，預測了中國21世紀的糧食問題，報告認為："中國農業(yè)的出路最終要由生物工程來解決。"3.能接受任何基因拿一個抗病基因轉進去，短時間內就得到一個抗病品種。第10頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一真正能夠被中國老百姓吃到嘴里的國產(chǎn)轉基因食品只有甜椒（一種柿子椒）和延熟西紅柿兩個品種。從1996年美國允許第一例轉基因食品在超市出售以來，西方人已經(jīng)吃了大約14年的轉基因食品！第11頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一●轉基因技術能對農作物的質量、數(shù)量進行精確的改良和提高，大大降低了生產(chǎn)成本，緩解了環(huán)境不斷惡化的情況

●今天我們種植的絕大部分作物已經(jīng)不是自然進化而生的野生種，人類現(xiàn)在食用的食物其本質也是轉基因食物第12頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一轉基因植物安全性等的釋疑

(一)食品安全性問題1、外源基因DNA作為食品成分的安全性問題：不存在

所有生物的DNA分子具有相同的化學屬性，我們每天都隨食物吃進各種基因的DNA。外源DNA在人的唾液中只能存活20分鐘，在人的胃里只能存活8秒鐘，在進入人體消化道后DNA就被降解成無遺傳活性的單個堿基、磷酸和戊糖，它們是人的營養(yǎng)素而無害。第13頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一2、目標基因表達蛋白本身的安全性問題：視具體基因而論研究表明，目前已商業(yè)化的Bt等基因編碼的蛋白本身對人和動物都是安全的，生食、熟食都無害。有些轉基因產(chǎn)品要正確食用，比如轉蛋白酶抑制劑基因、淀粉酶抑制劑基因的食品熟食無害，但不宜大量生食。如果一個基因編碼的蛋白的確對人有害，則不會通過安全性評價，也不會走向市場。第14頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一3、外源基因是否會干擾轉基因植物的代謝：具體分析如果外源基因使植物本身的成分含量上升或下降，可能表現(xiàn)為內在品質的變好或變差。如果由于外源基因的引入而新產(chǎn)生對人體有益的成分，則是好事。如果由于外源基因的引入而新產(chǎn)生對人體有害的成分，則不安全。如果由于外源基因的引入而新產(chǎn)生對人體中性的成分，不存在食品安全性問題，但要考慮是否會降低產(chǎn)量或其它品質成分。目前已商業(yè)化的轉基因尚未發(fā)現(xiàn)因干擾植物代謝而產(chǎn)生安全性問題。第15頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一4、標記基因和報告基因的食品安全性問題：放心食用，未來更放心研究表明，目前商業(yè)化的標記基因(如NptⅡ)和報告基因(如gus)等編碼的蛋白及其在轉基因植株體內的代謝產(chǎn)物對人是無害的。還沒有被充分研究肯定的標記基因和報告基因沒有機會走向市場。目前世界上及我國已經(jīng)成功開發(fā)了多種確定無害的標記基因和報告基因，以及標記基因和報告基因在植物體內自動刪除的技術系統(tǒng)，為新一代轉基因產(chǎn)品的安全性提供了保障。第16頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一(二)其它健康安全性問題抗生素抗性基因是否會形成人體的抗藥性：風險基本不存在一是轉基因食物在消化時，這些基因的核酸鏈會被消化分解。二是即使有完整基因進入吸收道，人體也沒有吸收DNA分子的機理，因此不可能進入人體細胞，更不可能整合到我們的染色體中。三是轉到植物中的抗生素抗性基因是受植物啟動子驅動的，即使它們完整地進入腸道細菌中也不會表達，就不會使人產(chǎn)生抗藥性。第17頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一唯一的可能性是進入腸道的完整基因與腸道細菌體內的相似基因發(fā)生同源交換，交換后要保證抗生素抗性基因仍然具有完整編碼蛋白的能力，同時又要將它的植物啟動子交換掉，而在距離上恰到好處地接上一個完整的細菌啟動子，這幾乎不可能，迄今未見報道。第18頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一(三)環(huán)境安全性問題1、是否會形成抗除草劑雜草：有可能，需嚴格管理轉基因植物1)轉基因作物有性繁殖，且附近存在可有性雜交的近緣作物和近緣雜草：則抗除草劑基因可能會通過花粉傳播途徑從目標作物→(近緣作物)→近緣雜草，因為基因漂移而產(chǎn)生抗除草劑雜草，用該除草劑就不能殺死該雜草。第19頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一2)轉基因作物有性繁殖，但本地沒有可雜交的近緣物種：不存在基因漂移，如種植轉基因棉花。3)轉基因作物為純營養(yǎng)繁殖且基本不開花。4)美國等國完全依賴于化學除草，大規(guī)模種植轉基因抗除草劑作物，則可能會產(chǎn)生抗除草劑雜草，但換一種其它原理的除草劑就可以輕松將其殺死。第20頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一2、是否會形成超級細菌：幾乎不可能，但取決于科學家的道德除非科學家喪失道德，故意通過DNA重組技術制造超級細菌，否則在自然界不太可能產(chǎn)生對人威脅極大的超級細菌?；蚬こ趟玫募毦洼d體都是人工改造了的，已經(jīng)把它們可能的風險降到了最低。比如，基因工程所用的大腸桿菌是限制修飾缺陷型和重組缺陷型，并且在非實驗環(huán)境下很快死亡。第21頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一3、是否會打破生態(tài)鏈的自然平衡：有可能改變一些小食物鏈，應認真研究，但也不必過于擔心種植轉基因抗蟲、抗病作物，可能會導致相關的病蟲害種群密度改變，無法估計是好還是壞、對生態(tài)平衡的影響是大還是小，所以要認真研究。自然界本來就是動態(tài)演化的，從來都不是靜止的，每年要滅絕上千種生物，也有新的物種產(chǎn)生，古之淪海，今之桑田，所以食物鏈變化不一定就必然帶來災難，需要實事求是地評價。第22頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一大斑蝶事件Bt基因可以針對性地殺死害蟲，而不會影響其他昆蟲和哺乳動物，但有人擔心轉基因花粉飄落到周圍的雜草上后，會不會殺死其他昆蟲，如大斑蝶。從1999年起連續(xù)3年，美國環(huán)境保護局(EPA)組織昆蟲專家在美國和加拿大對大斑蝶進行了跟蹤研究，結論是轉基因植物的花粉在田間對大斑蝶沒有威脅。第23頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一第24頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一中國農業(yè)大學食品與營養(yǎng)工程學院院長羅云波教授說：“轉基因技術與常規(guī)雜交育種技術雖然方法不同，但本質是一樣的，都是在原有物種的基礎上對遺傳基因進行改造，只不過基因工程改造更為精確、更有預見性、效率更高，在嚴格控制下，好的、有用的基因被植入，壞的、無用的基因被刪除，來源清楚、結構明確、數(shù)量有限，可以監(jiān)控，比常規(guī)雜交育種更能保證安全性?！钡?5頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一(四)倫理道德問題跨越物種的基因交換與倫理道德問題：不是問題的問題1）自然界本來就廣泛發(fā)生著跨越物種的基因交換，比如馬與驢雜交，白菜與甘藍雜交等?，F(xiàn)在的常規(guī)育種經(jīng)常采用種間甚至屬間雜交來交換遺傳物質和有用基因，達到育成新品種的目的，如海島棉與陸地棉的雜交、水稻與野生稻的雜交等。第26頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一2)基因工程與雜交育種一樣，只是實現(xiàn)了跨越物種間的遺傳物質交換，只不過傳統(tǒng)育種是同時交換整個基因組，一次交換的是成千上萬的基因，而基因工程一次交換的只是一個或少數(shù)幾個特定基因而已，但它們遵循的生物學法則是一樣的。3)在植物中表達微生物或動物的單個基因，并沒有改變種性，只是改良了單個性狀，并沒有人們大塊吃動物的肉這樣殘忍。第27頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一(五)生物技術的國際競爭問題

基因專利：基因工程的核心知識產(chǎn)權在于基因本身，有用的基因和DNA元件是有限的，美國等發(fā)達國家率先將重要的功能基因和基因操作技術研發(fā)并專利化，后來者將十分不利。進口轉基因農產(chǎn)品的反思：我國每年進口大量的轉基因油菜、大豆、玉米、棉花，國人在不知不覺中消費大量轉基因產(chǎn)品的同時，卻對轉基因不能正確地理解，甚至對國產(chǎn)轉基因的產(chǎn)業(yè)化采取過嚴的限制。這種諷刺性現(xiàn)象不利于我國轉基因產(chǎn)業(yè)的成長。第28頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一轉基因工程技術主要用于提高濃作物的抗逆能力,以及改良農作物的品質和利用植物生產(chǎn)藥物等方面.第29頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一五、植物的基因導入方法1.Ti質粒轉化（詳見第八章中“外源基因在植物中表達”）單子葉植物如小麥等幾種重要的農作物和一些重要的花卉（百合、郁金香），難以用農桿菌轉化。2.基因槍法（biolistics）通過基因槍把基因轉化到植物組織的一部分細胞中，從這些細胞再生出完整的植株。是最有前途的植物DNA轉移系統(tǒng)之一。第30頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一（1）用基因槍轉化過程①沉淀外源DNACaCl2、亞精胺或聚乙二醇沉淀DNA。②外源DNA子彈DNA包裹在直徑約1-4m的球狀金粉或鎢粉顆粒，稱為“子彈”。③射擊受體植物基因槍用火藥或壓縮氦氣為動力射擊（300-600m/s）。把包裹DNA的子彈射入植物細胞。第31頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一子彈進入細胞后，DNA會以一種目前人們不知道的方式整合到植物的染色體上。3.基因槍技術的缺點（1）整合的基因是多拷貝的。④外源基因整合轉化（2）整合的基因位點不確定。有可能干擾植物的正常基因表達。第32頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一基因槍法獲得轉基因植物成功的實例植物種轉化受體外源基因基因槍類型煙草葉片胚性懸浮細胞GUS,HptGUS,Npt-II火藥式氣動式大豆莖尖分生組織未成熟種子胚性懸浮細胞成熟種子GUS,Npt-IIGUS,Npt-IIGUS,HptGUS,bar放電式放電式火藥式火藥式棉花胚性懸浮細胞莖尖分生細胞GUS,HptGUS,Npt-II氣動式放電式菜豆分生組織GUS,bar放電式黃瓜胚性愈傷組織Npt-II火藥式番木瓜胚性懸浮細胞幼胚GUS,Npt-IIGUS,Npt-II,cp火藥式火藥式第33頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一植物種轉化受體外源基因基因槍類甘蔗胚性懸浮細胞GUS,Npt-II火藥式香蕉胚性懸浮細胞GUS,Hpt氣動式楊樹胚性懸浮細胞GUS,Bt放電式云杉胚性懸浮細胞GUS,Npt-II放電式向日葵受精胚珠GUS放電式苜蓿胚性愈傷組織Npt-II氣動式燕麥胚性懸浮細胞GUS,bar火藥式大麥胚性懸浮細胞GUS,bar氣動式蘭花球莖Npt-II,cp火藥式第34頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一玉米成熟胚GUS火藥式胚性懸浮細胞GUS火藥式胚性愈傷組織Hpt火藥式幼胚Bt氣動式胚性懸浮細胞GUS氣動式胚性愈傷組織Bar氣動式水稻成熟胚GUS火藥式幼胚GUS,bar,Hpt放電式胚性懸浮細胞bar氣動式胚性愈傷組織GUS,bar火藥式小麥胚性愈傷組織GUS,bar火藥式盾片愈傷組織GUS火藥式幼胚GUS,bar氣動式、火藥式第35頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一①優(yōu)點體積小、容易操作、感染率高。②缺點3.病毒衍生載體至今沒有證據(jù)表明植物病毒是否會整合到植物基因組中。目前常用煙草花葉病毒（TMV）。利用病毒外殼基因的啟動子來表達外源基因。③載體病毒第36頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一外源基因轉入植物細胞的方法及其評價方法評價Ti質粒介導一種有效的基因轉移系統(tǒng)基因槍適用范圍廣，經(jīng)濟實用，穩(wěn)定整合效率低。病毒載體效率很低直接將DNA導入原生質體僅限于能由原生質體再生出植株的植物顯微注射法技術要求高，費時費力，一次只能操作一個細胞電擊法僅限于能由原生質體再生出植株的植物脂質體融合法僅限于能由原生質體再生出植株的植物第37頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一植物轉基因技術在植物品種改良中的應用控制果實成熟的轉基因植物抗病蟲害的轉基因植物抗除草劑的轉基因植物改變花卉形狀和顏色的轉基因植物抗環(huán)境壓力的轉基因植物產(chǎn)高品質產(chǎn)物的轉基因植物第38頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一1.第一類機制（1）非寄主抗性（non-hostresistance）：一種病原只能侵染某一種植物，而不能侵染其它植物。一、植物抵御病原菌侵染的機制（2）特點①沒有病原小種專一性。②可長期保持。③有應用價值。第二節(jié)植物抗病基因工程第39頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一防衛(wèi)反應：通過識別入侵的病原而誘導產(chǎn)生的一系列防衛(wèi)反應。（3）第三類機制（2）第二類機制植物自身的結構屏障（細胞壁的結構、小分子的抗病物質）。第40頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一1.基因對基因（geneforgene）假說二、植物抗病的分子機理1941年Flor提出是克隆病原無毒性基因和植物抗病基因的理論基礎。對應于寄主方面的每一個決定抗病性的基因，病原物方面也存在一個決定致病性的基因。反之，對應于病原物方面的每一個決定致病性的基因，寄主方面也存在一個決定抗病性的基因。第41頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一2.植物的抗病物質植物的抗性基因產(chǎn)生受體，與誘導物結合激發(fā)一系列的信號傳遞途徑，最后誘導植物產(chǎn)生防衛(wèi)反應。植物的防衛(wèi)反應涉及到多種防衛(wèi)基因的表達，產(chǎn)生多種抗病物質：（1）小分子抗病物質豆科植物的異黃酮類、茄科植物的萜類、植物抗毒素、毒性苷元、毒性不飽和脂肪酸、毒性小分子酚類化合物等。第42頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一（2）病原相關蛋白（PR）殼多糖酶、-1，3-葡聚糖酶等。能降解病原真菌細胞壁。（3）阻止病原擴散的細胞壁成份傷口部位胞壁栓質化、病原入侵部位胞壁的胼底質生成、富含羥脯氨酸和富含甘氨酸的糖蛋白、木質素、富含硫的毒素的小肽（thionin）、導管中侵填體（tylose）的生成。第43頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一三、植物抗病基因的克隆字母縮寫：NBS（核苷酸結合位點）；LZ（亮氨酸拉鏈）；LRR（富含亮氨酸的重復區(qū)）；R基因植物病原Avr基因基因產(chǎn)物Hml玉米Cochlioboluscarbonum無HC-毒素還原酶Pto番茄Pseudomonassyringaepv.tomatoavrPto絲/蘇氨酸蛋白激酶Cf-2,4,9番茄CladosporiumfulvumAvr2,4,9LRRPrf番茄p.syringaepv.tomatoavrPtoLZ,NBS,LRRI2番茄Fusarivmaxysp[orum未知NBS,LRRRps擬南芥PseudomonassyringaeavrRpt2LZ,NBS,LRR第44頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一Rpm1擬南芥p.syringaepv.maculicolaavrRpm1,avrBLZ,NBS,LRRRpp5擬南芥PeronosporaparasiticaavrPp5NBS,LRRN煙草TMV未知Toll,NBS,LRRL6亞麻Melampsoralini未知Toll,NBS,LRRM亞麻m.lini未知NBS,LRRXa21水稻Xanthomanasoryzaepv.oryzae未知LRR,蛋白激酶Xa1水稻Xanthomanasoryzaepv.oryzae未知NBS,LRRsHslpro-1甜菜Hteroderaschachtil未知LRR第45頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一四、植物殺菌肽基因工程很多昆蟲中存在一些能殺菌的蛋白和多肽。1.結構和功能特點①由30多個氨基酸殘基組成②N端由堿性氨基酸殘基組成③C端均酰胺化④絕大多數(shù)多肽的第二位都是Trp（對殺菌活性至關重要）⑤都有較廣的殺菌譜。尤其是對很多植物病原菌有較強的殺傷作用第46頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一還不徹底清楚。作用于細菌的細胞膜，破壞膜的通透性，造成離子通道，最終導致細胞內含物泄漏。人工合成殺菌肽基因（分子量小）。用35S啟動子或植物特異性啟動子。中國成功地把人工合成的cercropinB基因導入馬鈴薯，獲得抗馬鈴薯清枯病的轉基因馬鈴薯。3.殺菌肽基因轉入植物2.殺菌機理第47頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一第三節(jié)農作物抗蟲基因工程早期：培育產(chǎn)量更高的新品種?，F(xiàn)在：培育有抗性的品種?？估ハx、病毒、除草劑、環(huán)境脅迫、衰老?？瓜x植物第48頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一（1）害蟲產(chǎn)生抗藥性。（2）益蟲也受害。（3）藥物殘留，破壞環(huán)境。一、基因工程抗蟲的必要性2.基因工程抗蟲的優(yōu)點（1）連續(xù)使用，成本低。（2）保護作用遍及全株。（3）不擴散，安全。（4）只殺害蟲，特異性強。1.化學殺蟲的缺點第49頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一第50頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一

昆蟲對農作物的危害極大，全世界每年因此損失數(shù)千億美元。目前對付昆蟲的主要武器仍是化學殺蟲劑，它不但嚴重污染環(huán)境，而且還誘使害蟲產(chǎn)生相應的抗性。將抗蟲基因導入農作物是植物基因工程的得意之筆，能避免化學殺蟲劑所造成的許多負面影響。目前，抗蟲作物已占全球轉基因作物的22％。用于構建抗蟲害轉基因植物常見的外源基因有蘇云金芽孢桿菌的毒晶蛋白基因、蛋白酶抑制劑基因、淀粉酶抑制劑基因、凝集素基因、脂肪氧化酶基因、幾丁質酶基因、蝎毒素、蜘蛛毒素基因等40多個，其中毒晶蛋白基因、蛋白酶抑制劑基因和凝集素基因應用最為廣泛。第51頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一1.蘇云金桿菌的Bt毒蛋白2.蛋白酶抑制劑的基因3.淀粉酶抑制劑4.外源凝集素基因二、抗蟲基因的種類三、蘇云金桿菌蘇云金桿菌（bacillusthuringiensis,Bt）感染鱗翅目、膜翅目昆蟲，殺蟲譜較窄。1901年發(fā)現(xiàn)。已發(fā)現(xiàn)4萬多個Bt菌種。第52頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一Bt芽孢伴胞晶體昆蟲吞食腸道內萌發(fā)進入血液引起敗血癥釋放腸道堿性特定蛋白酶活性毒性蛋白分子小腸上皮細胞離子通道ATP,Na+流出昆蟲脫水死亡原毒素1.殺蟲機理第53頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一2.原毒素基因蘇云金桿菌有7個質粒，大小分別是：殺蟲原毒素基因位于其中一個質粒上（71kb）。2.0kb、7.4kb、7.8kb、8.2kb、14.4kb、45kb、71kb3.原毒素基因的分離和克隆1-646aa保守高變區(qū)變化NC毒性區(qū)域估計為受體接合部位，決定毒素的特異性殺蟲第54頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一Bt總DNA染色體DNACsCl密度梯度離心質粒DNA質粒DNARNA取出大質粒中質粒小質粒蔗糖梯度離心棄掉Sau3A1部分酶切DNA片段pBR322BamHI轉化E.coli產(chǎn)物殺蟲素抗體放射自顯影I125蛋白A第55頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一4.Bt蛋白基因分類已克隆出60多個毒素基因。不同基因型殺蟲譜不同，根據(jù)殺蟲譜的不同，將殺蟲基因分成六大類，統(tǒng)稱為cry基因：（1）CryI基因編碼對鱗翅目昆蟲有毒殺作用的菱形伴孢晶體蛋白。（2）CryII基因通常編碼對鱗翅目和雙翅目昆蟲有毒殺作用的立方體伴孢晶體蛋白。第56頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一（3）cryIII基因編碼對鞘翅目昆蟲有特異毒殺作用的長方形伴孢晶體。（4）CryIV基因編碼對雙翅目昆蟲有特異毒性的橢圓形伴孢晶體。由于一個特定的轉錄因子只在蘇云金桿菌芽孢形成階段啟動原毒素基因轉錄，Bt只在此階段合成原毒素。5.Bt毒蛋白的形成第57頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一四、重組蘇云金桿菌從蠟狀芽孢桿菌的質粒中找到一個組成型表達的抗四環(huán)素基因和其啟動子。把抗四環(huán)素的啟動子與原毒素基因重組，形成結構性表達原毒素的重組質粒。轉化蘇云金桿菌，使該菌在整個生活史中一直表達原毒素。可以把不同來源重組，提高效率和殺蟲譜。1.啟動子2.啟動子和原毒素基因重組3.重組質粒轉化Bt第58頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一野生型和重組蘇云金桿菌的毒性比較毒素來源對白菜粉蝶的毒性（吃掉菜葉）對蚊子的毒性（死亡率）對甲蟲的毒性（吃掉蘿卜葉）內源毒素（亞種）轉入的外源毒素（亞種Aizawai無0-5%24h,50-100%>50%Israelensis無>5%1h,100%IsraelensisAizawai0-5%1h,100%IsraelensisTenebrionis5-50%0-5%Kurstaki無0-5%24h,50-100%>50%KurstakiTenebrionis0-5%0-5%Tenebrionis無>50%24h,0%0-5%TenebrionisAizawai0-5%24h,50-100%5-50%第59頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一（1）載體：Ti質粒。共整合載體。（2）啟動子：35S強啟動子，增加表達量。（3）Bt基因：N端1-646氨基酸。（4）轉化菌：農桿菌。五、轉Bt基因抗蟲植物1.Bt殺蟲毒素基因載體的構建2.轉化農桿菌介導。第60頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一SperNPTr:kanamycin,neomycin,G418Nos:nopalinesynthase第61頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一Bt基因含有較多的AT堿基和ATTTA重復序列。AT富含區(qū)在高等植物中被認為是不能表達的內含子。ATTTA重復序列的mRNA的穩(wěn)定性差，二者都不能在高等植物中編碼。3.轉Bt植物基因工程的改進（1）野生型Bt毒素基因的缺點第62頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一主要目的是設法提高Bt毒素的表達量①應用強啟動子，如CaMV啟動子。②改掉可能降低其在植物宿主中轉錄和翻譯效率的部分序列（3.5%）。③人工設計，采用植物偏愛密碼子。④刪除可能形成mRNA二級結構的序列。⑤去掉所有ATTTA序列。⑥降低AT含量。經(jīng)過改進，表達量提高了5-100倍。（2）采取的改進方法第63頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一4.轉Bt基因植物工程植物目的基因轉化方法煙草CryIA(a)（抗煙草天蛾）CryIA(b)（抗煙草天蛾）CryIA(c)（抗煙草青蟲）Bt(獲純合體株系Ｄ8-14，Ｄ19-8)CryIA(b)（切去3’端，留640序列）農桿菌介導農桿菌介導農桿菌介導農桿菌介導農桿菌介導番茄CryIA(b)(抗口科鱗翅目)Bt（抗番茄果蟲，番茄蠹蛾）CryIa(b)（減少Ａ＋Ｔ含量）Bt+CMV-CP農桿菌介導農桿菌介導農桿菌介導農桿菌介導馬鈴薯CryIIIACryIIIACryIA(c)農桿菌介導農桿菌介導農桿菌介導第64頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一棉花Bt(轉原生質體)Bt（下胚軸NPT

II

Kan’）Bt農桿菌介導農桿菌介導農桿菌介導粳稻CryIA(抗稻縱葉卷螟)電擊法（原生質體）水稻BtCryIA(b)（未見抗蟲性報道）CryIA(b)CryIA(b)

CryIA(c)ＰＥＧ法（ＰＢＩ121）花粉管通道法基因槍法（胚性愈傷）農桿菌介導秈稻CryIA(b)基因槍法秈稻和粳稻CryIA(b)（三化螟）基因槍法第65頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一玉米CryIA(b)Bt、barBtBt基因槍法子房注射超聲波基因槍法大豆Bt（未見殺蟲效果報道）Bt農桿菌介導（LBA4404）侵染子葉節(jié)蘋果Bt農桿菌介導甘蔗CryIA(c)（抗非洲蔗螟）農桿菌介導第66頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一第67頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一害蟲種類野生型番茄轉Bt基因番茄不加殺蟲劑加殺蟲劑不加殺蟲劑加殺蟲劑煙草天蛾中等程度損傷幾乎未損傷幾乎未損傷完全未損傷番茄谷實夜蛾中等程度損傷幾乎未損傷番茄莖麥蛾嚴重損傷嚴重損傷嚴重損傷中等程度損傷野生型和轉Bt毒蛋白基因番茄的抗蟲能力比較第68頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一5.Bt毒素轉基因植物存在的問題和措施Bt毒蛋白是目前使用范圍最廣，最有潛力的一個抗蟲基因。①抗蟲譜窄隨著Bt轉基因植物大面積種植，給昆蟲造成高選擇壓力，很快會產(chǎn)生抗性。每一種毒素只針對一類害蟲。②有可能是害蟲產(chǎn)生抗性（1）存在的問題第69頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一（2）采取的措施：①分離新的Bt毒蛋白基因。②對Bt毒蛋白基因進行人工改造，提高其表達量。③同時使用兩個以上的Bt毒蛋白基因，或與其他抗蟲基因聯(lián)合轉基因。④降壓法：使Bt毒蛋白基因只在容易被害蟲侵染的組織器官中表達，或只在發(fā)育的某個階段表達，降低對昆蟲的選擇壓力。⑤大田種植時輪換、混種、及時淘汰有可能使昆蟲產(chǎn)生抗性的轉基因抗蟲作物。第70頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一六、轉蛋白酶抑制劑基因抗蟲植物蛋白酶抑制劑（proteinaseinhibitor,PI）分子大?。阂话闶?0-120氨基酸的多肽。存在于豆科、茄科植物的塊莖和種子中。1.抗蟲機理PI同昆蟲消化道內的蛋白消化酶形成復合物，阻斷或削弱蛋白酶的水解作用，使昆蟲厭食或消化不良致死。該復合物還能刺激昆蟲消化酶的過量分泌，通過神經(jīng)系統(tǒng)的反饋，使昆蟲產(chǎn)生厭食反應。第71頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一蛋白消化酶PI復合物第72頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一2.PI的種類現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)近10個PI家族，研究的最清楚的是絲氨酸蛋白酶抑制劑，其中最主要的是胰蛋白酶抑制劑（而植物細胞基本沒有這種酶，或含量甚微）。3.抗蟲基因工程中應用的幾種PI（1）CpTI基因豇豆胰蛋白酶抑制劑基因。（Cowpeatrypsininhibitor，CpTI）由80個氨基酸組成，富含二硫鍵。只在發(fā)育的種子中表達。第73頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一（2）PTI基因馬鈴薯胰蛋白酶抑制劑基因。（potatoproteininhibitor，PTI）分為兩類：PTI-I,PTI-IIPTI-II基因的啟動子是損傷誘導性調控啟動子，在抗蟲基因工程中有應用潛力。CpTI抗蟲效果較為理想：其抗蟲范圍廣，對鱗翅目、鞘翅目、直翅目等幾乎所有昆蟲都有殺傷作用。作用位點在酶的活性中心，突變的可能性小，昆蟲產(chǎn)生抗性突變的可能性幾乎沒有。第74頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一玉米半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因。（3）CPI基因（4）SKTI基因大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制劑基因。第75頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一轉蛋白酶抑制劑基因植物工程植物目的基因轉化方法煙草CpTIPTI農桿菌介導農桿菌介導水稻CpTISKTI（抗棉鈴蟲）CpTI（抗二化螟、三化螟）CPI（抗線蟲）CPI（抗玉米象）農桿菌介導農桿菌介導直接轉化基因槍法基因槍法第76頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一七、轉淀粉酶抑制劑抗蟲植物-amylaseinhibitor普遍存在于植物中，尤其在禾谷類作物和豆科作物的種子中含量更高。1.抗蟲機理普遍抑制哺乳動物及昆蟲體內的淀粉酶，阻斷昆蟲對食物中淀粉的消化，但對植物本身和細菌的淀粉酶不起作用。2.缺點：不適宜在農作物中應用（抑制哺乳動物體內的淀粉酶）。只在煙草等經(jīng)濟作物中應用。第77頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一八、轉外源凝集素基因抗蟲植物lectin能特異地識別并可逆地結合糖類復合體的糖基部分，而不改變被識別的糖基的共價結構的一類非免疫性球蛋白。1.抗蟲機理主要儲存在植物細胞的蛋白粒中，一旦被害蟲攝食，就會在昆蟲的消化道里釋放出來，與腸道圍食膜上的糖蛋白結合，影響營養(yǎng)物質的正常吸收。對人和家畜有無副作用在豆科植物的種子中含量最豐富。第78頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一第四節(jié)抗病毒作物基因工程第79頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一①單鏈DNA病毒②雙鏈DNA病毒一、植物病毒類型和侵染過程1.植物病毒類型①正鏈RNA病毒種類最多，占植物病毒75%。②負鏈RNA病毒③雙鏈RNA病毒（1）DNA病毒（2）RNA病毒第80頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一（1）交叉保護預先感染了溫和株系病毒的植物，可以在一定程度上對與溫和株系病毒親緣關系較近的的強病毒株系的侵染產(chǎn)生抗性。（1929年發(fā)現(xiàn)。）溫病毒A植物強病毒A親先后二、植物抗病毒的原理在轉基因抗病毒植物中，應用最廣的方法就是植物的交叉保護原理。第81頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一2.植物病毒的侵染過程脫殼（decapsidation）病毒編碼蛋白的翻譯（translation）病毒基因組的復制（replication）病毒顆粒的包裝（encapsidation）第82頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一3.病毒外殼蛋白的結構和功能①宿主細胞的識別。②保護病毒核酸。由蛋白亞基組成。在植物中表達外殼蛋白后能產(chǎn)生類似于交叉保護的效果。（機理不清楚）。（1）結構（2）功能第83頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一1.溫和病毒在野外有可能突變成強病毒。2.溫和病毒在被保護的植物中復制，不安全。三、直接使用溫和病毒的弊端四、基因工程技術構建抗病毒植物1.利用病毒外殼蛋白介導的抗性。（1）構建攜帶病毒外殼蛋白基因的載體Ti質粒共整合載體。第84頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一第85頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一（2）成功的轉基因抗病毒植物煙草、番茄、苜蓿、馬鈴薯等。煙草花葉病毒（TMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）、苜蓿花葉病毒（AlMV）、煙草條紋病毒（TSV）、煙草脆裂病毒（TRV）、馬鈴薯X病毒（PVX）、煙草蝕刻病毒（TEV）等20多種病毒。②涉及到的病毒（外殼）①抗病毒植物第86頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一2.反義RNA（AntisenseRNA）介導的抗性與轉錄所得的mRNA（正義RNA）序列互補的RNA。（1）反義RNA（2）反義RNA的作用機制①與mRNA互補配對，阻止mRNA翻譯。②配對后引起mRNA被降解第87頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一第88頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一利用病毒外殼蛋白的反義RNA序列。Ti質粒載體?？共⌒Ч焕硐?。（3）反義RNA的基因工程及其效果①載體構建②實際效果評價第89頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一3.利用缺損的病毒復制酶抗病毒（1）原理表達無功能的缺損復制酶可以與有功能的完整病毒復制酶競爭底物，干擾病毒的正常復制。競爭抑制。缺損復制酶完整病毒復制酶病毒核酸不復制復制結合第90頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一（2）缺損的病毒復制酶與轉基因抗性效果TMV復制酶的C端、豌豆早枯病毒（PEBV）復制酶的C端。②效果評價：大有前途。①轉入成功的缺損酶分別轉入煙草后，發(fā)現(xiàn)轉基因煙草對TMV、PEBV、胡椒環(huán)斑病毒（PRV）和TRV都表現(xiàn)出抗性。第91頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一在大田里，盡管每年花費上百億美元使用100多種化學除草劑，但雜草的生長仍使農作物減產(chǎn)10%。目前使用的除草劑特異性不強，或多或少會影響農作物的生長。利用轉基因技術構建抗除草劑的重組植物可望解決這一問題，其戰(zhàn)略包括：抑制農作物對除草劑的吸收高效表達農作物體內對除草劑敏感的靶蛋白降低敏感性靶蛋白對除草劑分子的親和性向農作物體內導入除草劑的代謝滅活能力第五節(jié)抗除草劑抗衰老抗早熟基因工程第92頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一草甘磷（glyphosate）。特點：可被土壤微生物降解的、對環(huán)境無害的除草劑。抑制5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enlopyruvylshikimate-3-phosphatesynthase，EPSPS）。一、抗除草劑基因工程1.常用的除草劑2.草甘磷的主要作用機理第93頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一EPSPS是植物和細菌的芳香類氨基酸合成途徑（莽草酸途徑）的一個重要的酶。從細菌中分離抗草甘磷的大腸桿菌EPSPS基因，轉入植物中表達。3.抗除草劑基因工程作物的策略（1）EPSPS抗性基因策略給農作物轉入EPSPS抗性基因，彌補植物中受草甘磷抑制的EPSPS，抵抗草甘磷。第94頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一Glyphosateresistance轉移第95頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一3，5-二溴-4-羥基苯腈（bromoxynil）是一種抑制植物光合作用的除草劑。細菌中的腈水解酶（nitrilase）。在植物中表達能使除草劑失活的酶。（2）除草劑失活的酶基因策略①作用的除草劑②降解酶3，5-二溴-4-羥基苯腈3，5-二溴-4-羥基苯甲酸腈水解酶第96頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一二、抗衰老基因工程細菌腈水解酶基因抗衰老氧離子基團一般以超氧化物陰離子形式出現(xiàn)。置于光調控啟動子轉入植物中，使植物對該除草劑產(chǎn)生抗性。超氧化物歧化酶超氧化物過氧化氫水過氧化氫酶把超氧化物歧化酶基因轉入植物體內過量表達，可以延遲植物衰老。尤其延緩花瓣變質凋謝。第97頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一

蔬菜和水果成熟后，其組織呼吸速度和乙烯合成速度普遍加快，并迅速導致果實皺縮和腐爛?？刂剖卟怂毎幸蚁┖铣傻乃俣?，能有效延長果實的成熟狀態(tài)及存放期，為長途運輸提供了有利條件，具有重要的經(jīng)濟價值。

植物細胞中的乙烯由S-腺苷甲硫氨酸經(jīng)氨基環(huán)丙烷羧酸合成酶ACC和乙烯合成酶EFE催化裂解而成。科學家采用反義RNA技術封閉番茄細胞中上述兩個酶編碼基因的表達，由此構建出的重組番茄的乙烯合成量分別僅為野生植物的3%和0.5%，明顯增長了番茄的保存期。三、抗早熟基因工程第98頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一（1）纖維素酶、多聚半乳糖醛酸酶等。1.與果實成熟有關的酶（2）乙烯合成途徑中的酶：ACC合成酶乙烯合成酶ACC脫氨酶乙烯能誘導與果實成熟和衰老有關的許多基因的表達。第99頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一乙烯合成途徑S-腺苷甲硫氨酸ACC合成酶1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）乙烯合成酶乙烯-酮丁酸ACC脫氨酶第100頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一2.抗早熟的基因工程策略在植物中轉入纖維素酶或多聚半乳糖醛酸酶基因的反義RNA基因，可以干擾這兩種酶的表達。（1）反義RNA技術番茄轉入多聚半乳糖醛酸酶反義RNA后，多聚半乳糖醛酸酶的活性下降了90%。達到了延緩番茄在運輸和儲藏過程中的早熟。效果評價：第101頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一（2）ACC脫氨酶轉入從細菌中篩選分離ACC脫氨酶基因，轉入番茄表達，減少番茄儲藏和運輸過程中腐爛變質?；蚬こ瘫ｕr番茄是美國批準的第一個大規(guī)模生產(chǎn)的轉基因食用作物（1993）。1986年在美國伊利諾思州成功地培育出了世界第一批轉基因植物，而陳章良那時不但參加了此項研究的全程跟蹤，與同伴們一起親手栽培了那批引人注目的轉基因抗病毒西紅柿.第102頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一第六節(jié)花卉的基因工程重要的花卉品種：玫瑰、康乃罄、蘭花、郁金香、菊花。主要用基因工程的方法改變花的顏色和影響開花期。增加觀賞價值。第103頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一

花卉的顏色是由花冠中的色素成分決定的。大多數(shù)花卉的色素為黃酮類物質，由苯丙氨酸通過一系列的酶促反應合成，而顏色主要取決于色素分子側鏈取代基團的性質和結構，如花青素衍生物呈紅色，翠雀素衍生物呈藍色等。在黃酮類色素的生物合成途徑中，苯基苯乙烯酮合成酶（CHS）是一個關鍵酶。利用反義RNA技術可有效抑制矮牽?；▽僦参锛毎麅鹊腃HS基因表達，使轉基因植物花冠的顏色由野生型的紫紅色變成了白色，并且對CHS基因表達抑制程度的差異還可產(chǎn)生一系列中間類型的花色。改變花卉的顏色第104頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一植物激素在控制花朵的形狀和大小方面起著重要的作用。例如，細胞分裂素與植物生長素的比值可以決定植株包括花的形狀。分子生物學和遺傳學的研究都表明，同源異形基因表達的加強或減弱都會改變花的大小和形狀，而這些基因的表達時間直接影響到植物的花期。同源異形基因控制花形的過程十分保守，在幾乎所有的觀賞花卉中都是一樣的，這就為人們用基因工程的方法改變花形和花期提供了有利條件。改變花卉的形狀第105頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一一、植物花色素合成途徑4-香豆酰輔酶A山梨酰輔酶A查爾酮查爾酮合成酶黃酮-3-羥化酶花青素（cyanidin）的衍生物翠雀素（delphinidin）的衍生物中間產(chǎn)物花色偏紅花色偏藍第106頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一二、轉基因花卉把玉米的二羥黃酮醇-4-還原酶（DFR）基因轉入矮牽牛，獲得了開橙色花的品種。藍色色素合成是由多種酶控制的。主要利用基因工程改變花的顏色。1.目的2.轉成功的花卉3.藍色控制較復雜第107頁，共119頁，2023年，2月20日，星期一翠雀素的合成要有3個條件：①3’，5’-羥化花色素苷（翠雀素）的合成。②