食品生物技術(shù)復(fù)習(xí)資料

/第一章緒論生物技術(shù)—定義為“紅色生物技術(shù)"、“綠色生物技術(shù)"和“灰色生物技術(shù)”三類?！凹t色生物技術(shù)”是指生物制藥技術(shù)，“綠色生物技術(shù)”是指農(nóng)業(yè)和食品生物技術(shù)，而“灰色生物技術(shù)"是指工業(yè)、環(huán)保生物技術(shù)。食品生物技術(shù)——-現(xiàn)代食品生物技術(shù)的作用一食品原料和食品微生物的改良，提高食品的營養(yǎng)價(jià)值及加工性能;二生產(chǎn)各種功能食品有效成份、新型食品添加劑;三可直接應(yīng)用于食品生產(chǎn)過程的物質(zhì)轉(zhuǎn)化；四工業(yè)化生產(chǎn)預(yù)定食品或食品功能成分。第二章基因工程4個(gè)問題：什么是基因工程——基因工程的概念在體外通過人工剪、接,將不同來源的ＤNＡ分子組成一個(gè)雜合DNA分子（ＤNＡ分子重組體),然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞去復(fù)制擴(kuò)增或表達(dá)。因?yàn)橥ㄟ^人工設(shè)計(jì)，得到一定的設(shè)計(jì)方案，故稱為基因工程。由于整個(gè)操作在分子水平上進(jìn)行，所以也稱分子克隆。基因工程的基本特點(diǎn)是，分子水平操作，細(xì)胞水平表達(dá).2．為什么能進(jìn)行基因工程-—基因工程的原理和技術(shù)（涵蓋3大理論和３大技術(shù)準(zhǔn)備）四．基因工程3大理論，3大技術(shù)準(zhǔn)備：（一）理論上的3大發(fā)現(xiàn):1.20世紀(jì)4０年代，Avery發(fā)現(xiàn)了生物遺傳物質(zhì)的化學(xué)本質(zhì)是ＤNA。超越時(shí)代的科學(xué)成就往往不易被人們接受，Aveｒy當(dāng)時(shí)并未贏得陣陣掌聲，他的論文事隔10年以后才公開發(fā)表。2。2０世紀(jì)50年代,Wａt(yī)son-ｃｒｉck提出了DＮA結(jié)構(gòu)的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型,搞清楚了生物遺傳物質(zhì)的分子機(jī)制。３.2０世紀(jì)6０年代，確定了遺傳信息的傳遞方式：DNA→RＮA→Ｐr，破譯了全部遺傳密碼，43。1?！盎蚣舻丁保拗菩詢?nèi)切酶的發(fā)明２。載體（“交通工具車子"）－將質(zhì)粒作為基因工程載體使用3.逆轉(zhuǎn)錄酶３.怎樣進(jìn)行基因工程-—３大步驟（ＤNＡ體外重組，重組DNA如何進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)，基因工程后處理）４．基因工程的應(yīng)用和前景（一)基因(ｇenｅ)基因——-—--從化學(xué)上來說,指的是一段DNA或RＮA順序，該順序可以產(chǎn)生或影響某種表型（genotｙpe，pｈｅnotype);從遺傳學(xué)上來說，基因代表一個(gè)遺傳單位，一個(gè)功能單位,一個(gè)突變單位。（二）基因工程（geｎｅticenｇinｅe(cuò)rｉｎg）基因工程—－-－－--－在體外通過人工剪、接,將不同來源的DNA分子組成一個(gè)雜合DNA分子（DＮA分子重組體），然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞去復(fù)制擴(kuò)增或表達(dá)。因?yàn)橥ㄟ^人工設(shè)計(jì)，得到一定的設(shè)計(jì)方案，故稱為基因工程。由于整個(gè)操作在分子水平上進(jìn)行，所以也稱分子克隆?；蚬こ痰幕咎攸c(diǎn)是,分子水平操作,細(xì)胞水平表達(dá)。在這個(gè)過程中：1.“基因剪刀”剪取DNA的酶就像一把“基因剪刀”２.“縫紉針”連接不同來源DNA分子的酶就像一根“縫紉針”，使二者連在一起3。“交通工具”使用載體好比一輛車子４?！俺丝汀庇杏没颍ǘ┘夹g(shù)上的3大發(fā)明：1.“基因剪刀”－限制性內(nèi)切酶的發(fā)明（1）20世紀(jì)40-６0年代,科學(xué)家們就為基因工程設(shè)計(jì)了美好的藍(lán)圖，但是面對龐大的dsDNA（104，2．2＊１011（2）當(dāng)時(shí)的酶學(xué)知識已有相當(dāng)?shù)陌l(fā)展，但是沒有一個(gè)已發(fā)現(xiàn)的酶能完成這樣的使命.（3)19７0年，Smith和Wilｃox在流感嗜血桿菌(Haｅmoｐｈilusiｎfｆuｅｎzae）分離純化了HindⅡ，取得了突破，打破了基因工程的禁錮，迎來了改造生物的春天,為基因工程奠定了最為重要的技術(shù)基礎(chǔ)。2.載體（“交通工具車子")－基因工程技術(shù)誕生的第二個(gè)技術(shù)準(zhǔn)備（1)

有了切割與縫合(ｌigａsｅ)基因ＤNA的工具，還得有一個(gè)車子—-—--將重組DNA送到宿主細(xì)胞中去。（2）1946年起，Ｌedｅrberg就研究細(xì)菌性因子（F因子）。50-６0年代相繼發(fā)現(xiàn)了R因子（抗藥因子），CoE（大腸桿菌因子)等質(zhì)粒。（３）然而，直到197３年Cohen才能將質(zhì)粒作為基因工程載體使用（至今一直是基因工程最重要最廣泛使用的載體）。這是基因工程的第二個(gè)技術(shù)準(zhǔn)備.3.逆轉(zhuǎn)錄酶－１970年Bａlｔimoｖe和Temin等同時(shí)各自發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶，打破了遺傳學(xué)(生物學(xué)）中心法則，使真核基因的制備成為可能。(為什么）(1）真核基因組龐大而復(fù)雜,不易制得基因圖譜.ＨＧP２005年完成,２。8萬個(gè)基因,1—3kb／基因,104，2。２*1０１１（2)即使有了基因圖譜，因?yàn)檎婧嘶蛴袃?nèi)含子，不能在原核表達(dá)系統(tǒng)剪接出mRＮA，沒有成熟的mＲNA就不能得到相應(yīng)得產(chǎn)物。（３)經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄mRNA→ｃDNA（cｏmpｌeｍentoｒｙＤNA)文庫要比基因組文庫小得多,所以篩選陽性克隆就方便得多。有了這些理論核技術(shù)的武裝,基因工程的臨盆降生指日可待，Bｅｒg和Cohｅn兩位科學(xué)的“助產(chǎn)士”,把基因工程接到了人間。第二節(jié)基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)

常用的工具酶（toolｅｎzｙmeｓ)有：１.限制性核酸內(nèi)切酶(resriｃtionｅnzyｍeｓ，resｔrictｉonｅｎdoｎaｄease）-—--定義，分類，命名１。定義一類專門切割DNA的酶，它們能特異結(jié)合一段被稱為限制酶識別順序的特殊DNＡ序列。并切割dsDNA。２.分類限制酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)的（4０0多種E/３50M）。所有的限制酶可分成3類.(1）Ⅰ、Ⅲ型,兼具限制與修飾活性，它們識別與切割順序不在一個(gè)地方，不產(chǎn)生特異性的DＮＡ片段,與基因工程意義不大（有說Ⅲ型識別核苷酸切割的位點(diǎn)一致，但罕見）。（2)Ⅱ型基因工程說到的限制酶是Ⅱ型酶，具有此類酶的微生物限制－修飾系統(tǒng)分別由限制酶核甲基化酶來完成。Ⅱ型酶分子量小，僅需Mg2＋作為催化反應(yīng)的輔因子，識別與切割位點(diǎn)相同,產(chǎn)生特異的DＮA片段。3．

命名(１9７3年Smｉｔh原則、Ⅱ型酶)根據(jù)分離此酶微生物的學(xué)名，一般取3個(gè)字母。第一個(gè)字母大寫該微生物屬名前的第一個(gè)字母第二、三個(gè)字母小寫該微生物種名前的2個(gè)字母第四個(gè)字母大寫有變種或品系的第一個(gè)字母羅馬字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ從一種微生物中發(fā)現(xiàn)了幾種限制酶,按發(fā)現(xiàn)順序排列2．DNA連接酶（DＮAligasｅ,ligaｓｅ）—功能、影響連接酶作用的因素、連接方法（一）功能：催化有互補(bǔ)順序的兩個(gè)dsDNＡ分子的粘性末端或平頭末端3′－OＨ、５′－P連接作用。只能連接缺口(nick)，不能連接裂口（ｇａp).而且被連接的DＮＡ鏈必須是雙螺旋ＤNＡ分子的一部分。(二)來源-噬菌體T4感染E．ｃoli分離的一種單鏈多肽酶、ＭＷ。６8KＤ。(三)催化反應(yīng)：(1)需要ATＰ、Mｇ2+作輔助因子；（2）對粘性末端催化活性大于平頭末端（酶量1:１00）體外連接的幾種方式:１．用ＤＮA連接酶連接具有互補(bǔ)粘性末端的ＤNA片斷2．用Ｔ4ＤNＡ連接酶將平末端的DNA片斷連接；3.用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶給具平末端的DNA片斷加上poly(Ａ)-poly(T）尾巴之后，再用ＤＮＡ連接酶連接。4。先在ＤNA片斷末端加上化學(xué)合成的銜接物或接頭,形成粘性末端后，再用ＤＮＡ連接酶連接影響連接酶作用的因素1.反應(yīng)溫度:連接缺口的溫度：３7度連接粘性末端的最佳溫度:４~15度2。T４ＤNA連接酶的用量：平末端DＮA分子的連接反應(yīng)中，最適1~2個(gè)單位。粘性末端DNA片斷之間的連接,酶濃度0．1個(gè)單位ATP的用量1０μmｏl－１mmｏｌ／Ｌ之間3.提高外源片斷與載體的濃度的比值（1０～２0倍）粘性末端ＤAN片斷的連接由于具粘性末端的載體易發(fā)生自連。對載體的５’而外源片斷的5’－P能與載體的3’-OH進(jìn)行共價(jià)鍵的連接。這樣形成的雜種分子中，每一個(gè)連接位點(diǎn)中載體DNＡ只有一條鏈與外源片斷相連,失去5’-P的鏈不能進(jìn)行連接，形成3’平末端DNA片斷的連接1)。T4DNＡ連接酶２）。用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶給平末端加上同聚物尾巴之后，再用DＮＡ連接酶連接。銜接物連接法平末端的另一種處理方式是利用銜接物（linｋer）進(jìn)行處理,人工加上粘性末端.銜接物是一種人工合成的小分子DNA，約10～20個(gè)核苷酸,其結(jié)構(gòu)特征是含有多種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的回文結(jié)構(gòu)。將銜接物分子與平末端DNA分子連接，再用限制性核酸內(nèi)切酶酶切,便可產(chǎn)生粘性末端。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是克隆位點(diǎn)具有限制酶的酶切位點(diǎn)。DNA接頭(ａｄaptｅr)連接法：?它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片斷.粘性末端容易通過堿基配對形成如同銜接物一樣的二聚體分子。對DNＡ接頭分子末端,進(jìn)行必要的修飾.移走粘性末端５'—P,暴露出5’—3．DNＡ聚合酶（ＤNApｏlymeraｓe，DNApｏl）–定義把脫氧核糖核苷酸連續(xù)的加到雙鏈ＤNA分子引物鏈的3'—OH末端,催化核苷酸的聚合作用，而不發(fā)生從引物模板上解離的情況.７。堿性磷酸酶(ＢAＰ或ＣIＰ)--－該酶用于脫去ＤＮA（RNＡ)5’末端的磷酸根，使5’-P成為5’以1.和2。最為常用，最為重要。工具酶現(xiàn)已商品化。第三節(jié)載體載體的概念:1。要把一個(gè)有用的基因(目的基因——研究或應(yīng)用基因)通過基因工程手段送到生物細(xì)胞（受體細(xì)胞）,需要運(yùn)載工具（交通工具）攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞,這種運(yùn)載工具就叫做載體(vｅｃtoｒ）.２.凡來源于質(zhì)粒或噬菌體的DNA分子，可以插入或克隆DNA片段統(tǒng)稱為vector.3?；蚬こ趟玫膙ecｔoｒ?qū)嶋H上是DＮA分子,是用來攜帶目的基因片段進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA基因工程載體的3個(gè)特點(diǎn)（一）能獨(dú)立自主的復(fù)制載體DＮA分子中有一段不影響它們擴(kuò)增的非必需區(qū)域，如MCS，插在其中的外源DNA片段,能被動的跟著載體一起復(fù)制／擴(kuò)增，就像載體的正常成分一樣.(二）能便利的加以檢測如載體的藥物抗性基因,多是抗生素抗性基因,將受體細(xì)胞放在含有該抗生素培養(yǎng)板上培養(yǎng)生長時(shí)，只有攜帶這些抗性基因的載體分子的受體細(xì)胞才能存活。(三）都能容易進(jìn)入宿主細(xì)胞中去，也易從宿主細(xì)胞中分離純化出來。噬菌體載體λ-噬菌體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1、野生型為48.5kb，兩端帶有12堿基的單鏈粘性末端，進(jìn)入大腸桿菌后環(huán)化，既可溶菌又可溶原生長。２、基因組分為三個(gè)區(qū)域：左側(cè)區(qū)包括使噬菌體成熟的全部基因；中間區(qū)不是病毒生活必需的，外源DNA片段往往插入此區(qū)；右側(cè)區(qū)包括所有的主要調(diào)控成分。3、λ-噬菌體基因組中只有60％是溶菌生長必需的，作為克隆載體時(shí),可插入９~23ｋb的外源DNA片段質(zhì)粒載體(１）染色體外的雙鏈環(huán)狀DNＡ分子（2)大小為1~200kb；（3）能獨(dú)立于染色體外進(jìn)行自我復(fù)制，每個(gè)細(xì)胞中可含１0～200個(gè)拷貝。（4)分高拷貝數(shù)和低拷貝數(shù)質(zhì)?；蛘拗鞣秶蛷V宿主范圍(5)質(zhì)粒包含:復(fù)制起始區(qū)、選擇標(biāo)記基因和限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)常用質(zhì)粒有:pBR32２、pUC１9質(zhì)粒的不相容性：同種的或親緣關(guān)系相近的兩種質(zhì)粒不能同時(shí)穩(wěn)定地保持在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的現(xiàn)象３?？率腺|(zhì)粒／粘尾質(zhì)粒（cosｍid)柯氏質(zhì)粒定義:含有入噬菌體粘性末端的復(fù)合質(zhì)粒。由入-ＤNＡｃoｓ區(qū)與質(zhì)粒重組建造而成。在宿主細(xì)胞中可以作為正常噬菌體進(jìn)行復(fù)制，但不表達(dá)噬菌體的任何功能。含有質(zhì)粒的抗藥性標(biāo)記如Amｐｒ基因或Tetr基因及自主復(fù)制成分，所以這種粘性質(zhì)?？梢栽诩?xì)菌中大量復(fù)制擴(kuò)增。當(dāng)體外重組的粘性質(zhì)粒分子包裝成噬菌體顆粒并感染大腸桿菌后，可按質(zhì)粒的方式進(jìn)行復(fù)制。②帶有噬菌體的粘性末端（cos區(qū)）.這一粘性末端是體外包裝系統(tǒng)必不可少的成分，所以它可以像噬菌體一樣進(jìn)行體外包裝。③具有一個(gè)或多個(gè)限制酶的酶切位點(diǎn)。④其本身分子量小，如pＨC79僅6。5kb，可容納40ｋb左右的DNA片段。⑤由于非重組體粘性質(zhì)粒很小，不能在體外包裝,因而體外包裝的主要是重組體,有利于以后的篩選。第四節(jié)基因工程技術(shù)與方法基因工程包括３個(gè)步驟:1．

DNA重組DＮA分子內(nèi)或分子間發(fā)生的遺傳信息的重新共價(jià)組合過程。包括同源重組、特異位點(diǎn)重組和轉(zhuǎn)座重組等類型，廣泛存在于各類生物。體外通過人工DNＡ重組可獲得重組體DNA,是基因工程中的關(guān)鍵步驟2．

重組ＤNＡ導(dǎo)入宿主細(xì)胞-克隆擴(kuò)增或表達(dá)３．

基因工程的后處理(ｄowｎ－sｔｒeaｍtｅchniquesofGE)重組DNＡ技術(shù)的基本過程：1。

載體的選擇和制備-—分；2。

制備目的基因片段——切；3.

ＤNA片段的重組連接--接;4．

重組ＤNA導(dǎo)入受體細(xì)胞——轉(zhuǎn)；5．

轉(zhuǎn)化子的篩選—-篩;6．

重組子的篩選——篩；1．利用表型特征進(jìn)行篩選２．物理篩選3．酶切鑒定４.核酸雜交5．PCR鑒定6．免疫學(xué)方法７.利用wｅｓterｎ雜交8利用序列測定９．轉(zhuǎn)譯篩選基因組文庫法-定義、如何構(gòu)建將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲存,各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因基因文庫如何構(gòu)建?將某種生物體內(nèi)的DＮA全部提取出來，選用適當(dāng)?shù)南拗泼?，將DNA切成一定范圍大小的DNＡ片段,然后，將這些ＤNA片段分別與載體連接起來，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，每個(gè)受體菌都含有了一段不同的ＤＮA片段.也就是說，這個(gè)群體包含了這種生物的所有基因，叫做這種生物的基因組文庫。２。CDNＡ文庫法—定義、如何構(gòu)建如果用某種生物發(fā)育的某個(gè)時(shí)期的mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的多種互補(bǔ)DNA（也叫ｃDＮA）片段，與載體連接后儲存在一個(gè)受體菌群中，那么，這個(gè)受體菌群體就叫做這種生物的cDNA文庫.cDNＡ:指體外用逆轉(zhuǎn)錄酶催化，以mRNA為模板合成的互補(bǔ)ＤＮA。cＤNA：匯集某生物成熟mRNＡ為模板逆轉(zhuǎn)錄而成cDNA序列的的重組DＮA群體．Λ噬菌體和質(zhì)粒為載體構(gòu)建。在什么情況下我們選用cDNA文庫法來制備目的基因?操作程序１)總RNA的提取；注意抑制ＲＮＡ酶的活性，鹽酸胍,二乙基焦碳酸２)mＲNＡ的分離：選用高度分化的組織,末端帶有polyＡ.３）ｃDＮA雙鏈的合成:ｐoｌｙＡRNA為模板．４)cDNA與載體的連接5）噬菌體的包裝以及轉(zhuǎn)染或質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化1。表型特征進(jìn)行篩選a．根據(jù)載體表型特征的篩選抗藥性標(biāo)記插入失活法Β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選法b。根據(jù)外源ＤNA提供的遺傳性狀的篩選ｃ.利用噬菌斑的形成d.利用遺傳互補(bǔ)作用第六節(jié)克隆基因與表達(dá)系統(tǒng)一、基因工程的目的和主要工作（一）基因工程的目的有:1．生產(chǎn)基因工程的產(chǎn)品。2．改良生物的性狀,對人來說是開展基因治療.（二）根據(jù)克隆基因和宿主細(xì)胞的不同，基因工程的工作可以分成：1?？寺≌婧嘶蛟谡婧讼到y(tǒng)表達(dá)，如開展基因治療２。

克隆真核基因在原核系統(tǒng)表達(dá)，如生產(chǎn)基因工程的產(chǎn)品。３.

克隆原核基因在原核系統(tǒng)表達(dá)。4.

克隆原核基因在真核系統(tǒng)表達(dá).由于人類賴以生存的生物類群與真核關(guān)系密切，而原核生物的繁殖優(yōu)勢是任何真核生物都無法比擬的,所以除了開展基因治療外,基因工程的主要工作是克隆真核基因在原核系統(tǒng)表達(dá)。外源基因在原核生物中正確表達(dá)的基本條件

啟動子—概念啟動子—－--DNA鏈上一段能與RＮA聚合酶結(jié)合并起始RNA合成的序列,它是基因表達(dá)不可缺少的重要調(diào)控序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄.由于細(xì)菌RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動子，因此原核表達(dá)載體所用的啟動子必須是原核啟動子.TATAＡT（ｐriｂｎoｗbox）為ＲＮA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，TTGＡCA是識別位點(diǎn).這兩個(gè)區(qū)域是決定啟動子強(qiáng)度的重要因素。S-Ｄ序列—概念在mＲNA上有核糖體的結(jié)合位點(diǎn)，它們是起始密碼子ＡUＧ和一段位于AUＧ上游３~10bp處的由３～９bp組成的序列。這段序列富含嘌呤核苷酸,剛好與16SrRNＡ3￠末端的富含嘧啶的序列互補(bǔ),是核糖體RNA的識別與結(jié)合位點(diǎn)。以后將此序列命名為Sｈinｅ—Dalgarno序列，簡稱SＤ序列。它與起始密碼子AUG之間的距離是影響ｍRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯成蛋白的重要因素之一，某些蛋白質(zhì)與SD序列結(jié)合也會影響mRNA與核糖體的結(jié)合，從而影響蛋白質(zhì)的翻譯。另外,真核基因的第二個(gè)密碼子必須緊接在AＴG之后,才能產(chǎn)生一個(gè)完整的蛋白質(zhì)。起始密碼子-概念A(yù)UG（甲硫氨酸)GＵG（纈氨酸）,也就是翻譯過程中,所合成多肽的第一氨基酸應(yīng)是甲硫氨酸或纈氨酸終止子－概念在一個(gè)基因的末端往往有一段特定順序,它具有轉(zhuǎn)錄終止的功能,這段終止信號的順序轉(zhuǎn)譯后的修飾和加工－概念1.細(xì)菌ＲNAｐol不能識別真核的ｐromｏtor，故真核基因不能被該酶轉(zhuǎn)錄.２．從真核轉(zhuǎn)錄的mRNＡ缺乏SD序列,不能結(jié)合到細(xì)菌核糖體rＲＮＡ，因此不能被翻譯成蛋白．３。真核基因有內(nèi)含子，而原核細(xì)胞缺乏真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng),成熟的mRNＡ不能形成，不能表達(dá)真核蛋白；４.表達(dá)的真核蛋白在原核細(xì)胞中不穩(wěn)定,易被細(xì)菌蛋白酶降解．將真核基因克隆到1個(gè)強(qiáng)大的原核pｒomoｔｏr和ＳDs的下游,使真核基因處于原核啟動子的控制之下，轉(zhuǎn)錄物由于原核SDs能與核糖體rＲNA結(jié)合,可在原核表達(dá)。這是克服1，2困難的好辦法.克服3，4從真核分離出ｍRNA并逆轉(zhuǎn)錄成ｃＤNA,cDNA有完整的編碼順序,但無內(nèi)含子,這是解決第三個(gè)困難的方法，第四個(gè)困難解決的方法是采用偽裝辦法→將真核基因插到原核基因某密碼之后，其翻譯產(chǎn)物N端有原核多肽，這樣表達(dá)的融合蛋白,可躲避細(xì)菌蛋白酶降解作用。第八節(jié)基因工程在食品工業(yè)應(yīng)用現(xiàn)狀一基因工程與動物\植物\微生物產(chǎn)品品質(zhì)的改良二基因工程與植物產(chǎn)品儲藏保鮮三基因工程與食品新資源的開發(fā)基因工程與植物產(chǎn)品儲藏保鮮-原理PＧ基因工程ＡCＣ合成酶基因工程乙烯形成酶基因工程ＡＣC脫氨酶基因工程1。PＧ基因工程?

要點(diǎn):PG基因-－－—多聚半乳糖醛縮酶是果實(shí)成熟過程中新合成的一種蛋白質(zhì)．具有降解細(xì)胞間果膠質(zhì)量的作用,對果實(shí)軟化有很大影響．兩條7５bp的長引物進(jìn)行PCＲ反應(yīng)，擴(kuò)增出甜瓜ＰＧl基因的１28ｂp的片段,將其克隆到ｐＭD18-T載體中,篩選反向克隆,然后將其反向構(gòu)建到植物表達(dá)載體pUC38—AＣC的CaＭV35S啟動手和TMV增強(qiáng)子“Ω"的下游,構(gòu)建成反義表達(dá)載體pＵC3８－ＰＧｏ用PＣR鑒定重組子。重組子PG活性降低,抗裂，抗機(jī)械損傷，不易感染。２.AＣＣ合成酶基因工程ＡＣＣ合成酶是一種以磷酸吡哆醛為輔酶的酶，在乙烯生物合成中起到關(guān)鍵作用。用基因工程的方法將AＣC還原酶和ACＣ氧化酶的反義基因和外源的AＣC脫氨酶基因?qū)胝Ｖ仓曛?，獲得乙烯缺陷型植株,達(dá)到控制果實(shí)成熟的目的，已在番茄中實(shí)現(xiàn)。乙烯在果實(shí)成熟中的作用：能使果實(shí)呼吸性強(qiáng)度大大提高，并能提高果實(shí)組織原生質(zhì)對氧的滲透性，促進(jìn)果實(shí)呼吸作用和有氧參與的其它生化過程使果實(shí)中酶的活動性增強(qiáng)并改變酶的活動方向，從而大大縮短了果實(shí)成熟的時(shí)間。而１-氨基環(huán)丙烷—羧酸(ACC）是乙烯生物合成的直接前體。３.乙烯形成酶（ACC氧化酶，ＥFE）基因工程－是乙烯生物合成途徑中最后一個(gè)酶。構(gòu)建EＦE的反義RNA抑制ＥFＥ的活性。4。ＡCC脫氨酶基因工程-—-ACC脫氨酶能把ＡＣC降解為α－酮基丁酸和氨,其中，α—酮基丁酸是植物體內(nèi)正常代謝產(chǎn)物，也是乙酰乳酸合成酶的底物。AＣＣ脫氨酶基因可使任何一種植物體內(nèi)的乙烯合成能力降低第三章發(fā)酵工程原理及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用第一節(jié)發(fā)酵工程概況一發(fā)酵工程的定義1.發(fā)酵的定義:借助微生物在有氧或無氧條件下的生命活動來制備微生物菌體本身,或其初級代謝產(chǎn)物或次級代謝產(chǎn)物的過程2．發(fā)酵工程:利用微生物的生長和代謝活動來生產(chǎn)各種有用物質(zhì)的工程技術(shù)，又稱微生物工程．生物技術(shù)走向產(chǎn)業(yè)化的必經(jīng)之路.不同碳源的利用速度不同菌能利用的碳源不同，同一菌種對不同碳源利用速度不同。如：青霉素產(chǎn)生菌利用葡萄糖快(3０-40小時(shí))，利用乳糖速度慢(６天)。一般情況：單糖比雙糖快;雙糖比多糖快；純多糖比雜多糖快（淀粉最好)。快者為速效碳源,迅速參與菌體生長代謝和產(chǎn)生能量適于長菌慢者為遲效碳源。利于延長代謝產(chǎn)物的合成發(fā)酵工業(yè)中常用的原料消耗每克底物將產(chǎn)生最大的菌體得率或產(chǎn)物得率能產(chǎn)生最高的產(chǎn)品或菌體的濃度能以最大的速率產(chǎn)生產(chǎn)物副產(chǎn)品的得率最小價(jià)廉并具有穩(wěn)定的質(zhì)量來源豐富且供應(yīng)充足易于通氣和攪拌提取、純化、廢物處理等生產(chǎn)工藝過程都比較容易生長因子從廣義來說，凡是微生物不可缺少的微量有機(jī)物質(zhì),如氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等均稱為生長因子。其功能是構(gòu)成細(xì)胞的組成分，促進(jìn)生命活動的進(jìn)行。生長因子不是所有微生物都必需的,它只是對于某些自己不能合成這些成分的微生物才是必不可少的營養(yǎng)物。目前以糖質(zhì)原料為碳源的谷氨酸產(chǎn)生菌均為生物素缺陷型,以生物素為生長因子。提供生長因子的農(nóng)副產(chǎn)品原料玉米漿麩皮水解液糖蜜酵母：可用酵母膏、酵母浸出液或直接用酵母粉.前體物質(zhì)某些化合物加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過程結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，而其自身結(jié)構(gòu)并沒有多大變化，但產(chǎn)物的量卻因加入而有較大的提高。有些氨基酸、核苷酸和抗生素發(fā)酵必須添加前體物質(zhì)才能獲得較高的產(chǎn)率。氨基酸發(fā)酵的前體物質(zhì)氨基酸菌體前體物質(zhì)產(chǎn)量/%絲氨酸嗜甘油棒狀桿菌甘氨酸１。6色氨酸異常漢遜酵母氨茴酸0.8色氨酸麥角菌吲哚1．3蛋氨酸脫氫極毛桿菌2—羥基4－甲基硫代丁醇1.1異亮氨酸粘質(zhì)賽桿菌α—氨基丁酸0.8異亮氨酸阿氏棒狀桿菌D－蘇氨酸１．5蘇氨酸谷氨酸小球菌高絲氨酸2．0第三節(jié)培養(yǎng)基的滅菌滅菌：利用物理和化學(xué)的方法殺滅或除去物料及設(shè)備中一切生命物質(zhì)的過程。消毒：用物理或化學(xué)的方法殺死物料、容器、器具內(nèi)外的病原微生物,一般只能殺死營養(yǎng)細(xì)胞而不能殺死芽胞。消毒不一定能達(dá)到滅菌的要求，而滅菌則可達(dá)到消毒的目的.在發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中，為了保證純種培養(yǎng),在生產(chǎn)菌種接種培養(yǎng)前，要對培養(yǎng)基、空氣系統(tǒng)、消泡劑、流加物料、設(shè)備、管道等進(jìn)行滅菌，還要對生產(chǎn)環(huán)境進(jìn)行消毒，防止雜菌和噬菌體的大量繁殖。只有不受雜菌污染，發(fā)酵過程才能正常進(jìn)行。干熱滅菌法進(jìn)行干熱滅菌時(shí)，微生物細(xì)胞發(fā)生氧化，微生物體內(nèi)蛋白質(zhì)變性和電解質(zhì)濃縮引起中毒等作用，氧化作用導(dǎo)致微生物死亡是主要依據(jù).由于微生物對于熱的耐受力比對濕熱強(qiáng)得多，故干熱滅菌所需的溫度要高,時(shí)間要長，一般160～170℃、１~1。５h.實(shí)際應(yīng)用時(shí)，對一些要求保持干燥的實(shí)驗(yàn)器具和材料可以采用干熱滅菌法。火焰滅菌法利用火焰直接殺死微生物的滅菌法稱為火焰滅菌法。該法方法簡單,滅菌徹底，但使用范圍有限,僅適用于接種針、玻璃棒、三角瓶口等的滅菌。電磁波、射線滅菌法利用電磁波、紫外線、X射線、γ射線或放射性物質(zhì)產(chǎn)生的高能粒子進(jìn)行滅菌,以紫外線最常用。紫外線對芽胞和營養(yǎng)細(xì)胞都能起作用,但細(xì)菌芽胞和霉菌孢子對紫外線的抵抗力強(qiáng)。紫外線的穿透力低，僅適用于表面滅菌和無菌室、培養(yǎng)室等空間的滅菌，對固體物料滅菌不徹底，也不能用于液體物料的滅菌。２50~270nm之間殺菌效率高，以波長在２６0nm左右滅菌效率最高.除紫外線外，X射線和γ射線也可進(jìn)行滅菌。濕熱滅菌法（主要是高壓蒸汽滅菌）利用飽和蒸汽進(jìn)行滅菌原理:水的沸點(diǎn)隨水蒸氣壓力的增加而上升，高壓情況下可獲得高溫的水蒸汽.借助蒸汽的高溫和蒸汽釋放的潛熱使微生物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、酶和核酸分子內(nèi)部的化學(xué)鍵,特別是氫鍵受到破壞，引起不可逆的變性，使微生物死亡從滅菌效果來看，由于蒸汽有很強(qiáng)的穿透能力,濕熱滅菌對耐熱芽胞桿菌來說，溫度升高１0℃蒸汽來源方便，價(jià)格低廉,滅菌效果可靠濕熱滅菌法是目前最常用的滅菌方法，一般的濕熱滅菌條件為1２1℃化學(xué)藥劑滅菌法某些化學(xué)藥劑能與微生物發(fā)生反應(yīng)而具有殺菌的作用?；瘜W(xué)藥劑適用于生產(chǎn)車間環(huán)境的滅菌，接種操作前小型器具的滅菌等。化學(xué)藥品的滅菌使用方法，根據(jù)滅菌對象的不同有浸泡、添加、擦拭、噴灑、氣態(tài)熏蒸等。濕熱滅菌的原理1。微生物的熱阻每一種微生物都有一定的最適生長溫度范圍，當(dāng)微生物處于最低限溫度以下時(shí),代謝作用幾乎停止而處于休眠狀態(tài)。當(dāng)溫度超過最高限度時(shí)，微生物細(xì)胞中的原生質(zhì)體和酶的基本成分——蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的變化，即凝固變性,使微生物在很短時(shí)間內(nèi)死亡。濕熱滅菌就是根據(jù)微生物的這種特性進(jìn)行的一般無芽胞細(xì)菌,在６０℃芽胞細(xì)菌的芽胞在10０℃某些嗜熱菌能在120℃一般講，滅菌的徹底與否以能否殺死芽胞細(xì)菌為標(biāo)準(zhǔn)。高溫瞬時(shí)滅菌法原理由于滅菌時(shí)的活化能E大于培養(yǎng)基營養(yǎng)成分破壞的活化能E’,因此，隨著溫度升高,滅菌速率常數(shù)增加的倍數(shù)〉培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分分解的速率常數(shù)的增加倍數(shù).即當(dāng)滅菌溫度升高時(shí)，微生物殺滅速度提高,超過了培養(yǎng)基營養(yǎng)成分破壞的速度。據(jù)測定，每升高10℃一般化學(xué)反應(yīng)Q10為1.５~２。0；殺滅芽胞的反應(yīng)Q10為5~1０；殺滅微生物細(xì)胞的反應(yīng)Q10為３5左右。在熱滅菌的過程中,同時(shí)發(fā)生微生物死亡和培養(yǎng)基成分破壞兩個(gè)過程。溫度能加速其過程進(jìn)行的速度，當(dāng)溫度升高時(shí),微生物死亡的速度更快，因此可以采用較高的溫度，較短的滅菌時(shí)間，以減少培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的破壞，這就是通常所說的“高溫瞬時(shí)滅菌法”。過濾除菌法第四節(jié)菌種的活化與擴(kuò)大培養(yǎng)活化與擴(kuò)大培養(yǎng):將保存的處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入到試管斜面活化后,再經(jīng)過茄子瓶或搖瓶以及種子罐逐步擴(kuò)大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程.生產(chǎn)車間種子制備1。種子罐種子制備種子罐種子制備的工藝過程，因菌種不同而異,一般可分為一級種子、二級種子和三級種子的制備。１)孢子(或搖瓶菌絲)被接入到體積較小的種子罐中,經(jīng)培養(yǎng)后形成大量的菌絲,這樣的種子稱為一級種子.把一級種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵,稱為二級發(fā)酵。２）如果將一級種子接入體積較大的種子罐內(nèi)，經(jīng)過培養(yǎng)形成更多的菌絲，這樣制備的種子稱為二級種子。將二級種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵，稱為三級發(fā)酵。同樣道理，使用三級種子的發(fā)酵，稱為四級發(fā)酵。

?種子罐級數(shù)的確定依據(jù):菌種的性質(zhì)和菌體生長速度及發(fā)酵設(shè)備的合理應(yīng)用種子制備目的:形成一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體。發(fā)酵的目的：獲得大量的發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)物是在菌體大量形成并達(dá)到一定生長階段后形成的，需要在大型發(fā)酵罐內(nèi)才能進(jìn)行。同時(shí)若干發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)生菌其不同生長階段對營養(yǎng)和培養(yǎng)條件的要求有差異。因此,將兩個(gè)目的不同、工藝要求有差異的生物學(xué)過程放在一個(gè)大罐內(nèi)進(jìn)行,既影響發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量，又會造成動力和設(shè)備的浪費(fèi)。種子罐級數(shù)減少,有利于生產(chǎn)過程的簡化及發(fā)酵過程的控制，可以減少因種子生長異常而造成發(fā)酵的波動。種齡種齡：種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐的培養(yǎng)時(shí)間接種量定義：移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例發(fā)酵罐的接種量大小與菌種特性、種子質(zhì)量和發(fā)酵條件等有關(guān)。制霉菌素發(fā)酵的接種量為0.１%~1%肌苷酸發(fā)酵接種量1．5％～2％霉菌的發(fā)酵接種量一般為10%，多數(shù)抗生素發(fā)酵的接種量為7％~1５%，有時(shí)可加大到20%～25％。例如，生產(chǎn)制霉菌素時(shí)用1%的接種量，其效果較用１0％的為好，而0．１％接種量的生產(chǎn)效果與１％的生產(chǎn)效果相似。?種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)上常用的種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)⑴細(xì)胞或菌體菌體形態(tài)、菌體濃度以及培養(yǎng)液的外觀.菌體形態(tài)可通過顯微鏡觀察來確定,以單細(xì)胞菌體為種子的質(zhì)量要求是菌體健壯、菌形一致、均勻整齊,有的還要求有一定的排列或形態(tài)。以霉菌、放線菌為種子的質(zhì)量要求是菌絲粗壯，對某些染料著色力強(qiáng)、生長旺盛、菌絲分枝情況和內(nèi)含物情況良好。?菌體的生長量也是種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，生產(chǎn)上常用離心沉淀法、光密度法和細(xì)胞計(jì)數(shù)法等進(jìn)行測定。種子液外觀如顏色、黏度等也可作為種子質(zhì)量的粗略指標(biāo)。

⑵生化指標(biāo)種子液的糖、氮、磷含量的變化和pH值變化是菌體生長繁殖、物質(zhì)代謝的反映，不少產(chǎn)品的種子液質(zhì)量是以這些物質(zhì)的利用情況及變化為指標(biāo)⑶產(chǎn)物生成量種子液中產(chǎn)物的生成量是多種發(fā)酵產(chǎn)品發(fā)酵中考察種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，因?yàn)榉N子液中產(chǎn)物生成量的多少是種子生產(chǎn)能力和成熟程度的反映.?⑷酶活力測定種子液中某種酶的活力,作為種子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)，是一種較新的方法。如土霉素生產(chǎn)的種子液中的淀粉酶活力與土霉素發(fā)酵單位有一定的關(guān)系，因此種子液淀粉酶活力可作為判斷該種子質(zhì)量的依據(jù)。?此外，種子應(yīng)確保無任何雜菌污染。

種子異常的分析在生產(chǎn)過程中，種子質(zhì)量受各種各樣因素的影響，種子異常的情況時(shí)有發(fā)生，會給發(fā)酵帶來很大的困難。種子異常往往表現(xiàn)為菌種生長發(fā)育緩慢或過快、菌絲結(jié)團(tuán)、菌絲粘壁三個(gè)方面。⑴菌種生長發(fā)育緩慢或過快菌種在種子罐生長發(fā)育緩慢或過快和孢子質(zhì)量以及種子罐的培養(yǎng)條件有關(guān)。生產(chǎn)中,通入種子罐的無菌空氣的溫度較低或者培養(yǎng)基的滅菌質(zhì)量較差是種子生長、代謝緩慢的主要原因。生產(chǎn)中，培養(yǎng)基滅菌后需取樣測定其pＨ值,以判斷培養(yǎng)基的滅菌質(zhì)量。⑵菌絲結(jié)團(tuán)在液體培養(yǎng)條件下，繁殖的菌絲并不分散舒展而聚成團(tuán)狀稱為菌絲團(tuán).這時(shí)從培養(yǎng)液的外觀就能看見白色的小顆粒，菌絲聚集成團(tuán)會影響菌的呼吸和對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。如果種子液中的菌絲團(tuán)較少，進(jìn)入發(fā)酵罐后，在良好的條件下,可以逐漸消失，不會對發(fā)酵產(chǎn)生顯著影響。如果菌絲團(tuán)較多,種子液移入發(fā)酵罐后往往形成更多的菌絲團(tuán),影響發(fā)酵的正常進(jìn)行。菌絲結(jié)團(tuán)和攪拌效果差、接種量小有關(guān)，一個(gè)菌絲團(tuán)可由一個(gè)孢子生長發(fā)育而來,也可由多個(gè)菌絲體聚集一起逐漸形成.

⑶菌絲粘壁菌絲粘壁是指在種子培養(yǎng)過程中,由于攪拌效果不好，泡沫過多以及種子罐裝料系數(shù)過小等原因,使菌絲逐步粘在罐壁上.其結(jié)果使培養(yǎng)液中菌絲濃度減少，最后就可能形成菌絲團(tuán)。以真菌為生產(chǎn)菌的種子培養(yǎng)過程中,發(fā)生菌絲粘壁的機(jī)會較多。?第五節(jié)發(fā)酵工藝過程控制發(fā)酵過程中的代謝變化與控制參數(shù)分批發(fā)酵、補(bǔ)料分批發(fā)酵、半連續(xù)發(fā)酵及連續(xù)發(fā)酵的定義溫度對發(fā)酵的影響及其控制pH值對發(fā)酵的影響及其控制溶解氧對發(fā)酵的影響及其控制菌體濃度和基質(zhì)對發(fā)酵的影響及其控制補(bǔ)料的控制-—料分批培養(yǎng)(FＢC)的優(yōu)點(diǎn)、補(bǔ)料的方式泡沫對發(fā)酵的影響及其控制發(fā)酵終點(diǎn)的判斷發(fā)酵過程檢測與自控應(yīng)用微生物生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白一、發(fā)酵法生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白概念：利用各種基質(zhì)大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)菌、酵母菌、霉菌、微藻、光合細(xì)菌等而獲得的微生物蛋白應(yīng)用:作為現(xiàn)代飼料工業(yè)和食品工業(yè)中重要的蛋白來源。SＣＰ營養(yǎng)豐富：1）蛋白質(zhì)40％－８0％2)多種維生素3）碳水化合物4）脂類５)酶類和生物活性物質(zhì)：輔酶A、輔酶Q、谷胱苷肽、麥角固醇6）礦物質(zhì)7）氨基酸組成齊全，人體必需8種氨基酸高活性干酵母的生產(chǎn)活性干酵母有兩個(gè)基本特征:一常溫下長期貯存而不失去活性.二將活性干酵母在一定條件下復(fù)水活化后。即恢復(fù)成自然狀態(tài)并具有正常酵母活性的細(xì)胞?；钚愿山湍干a(chǎn)過程

?菌種配制→發(fā)酵→分離→過濾→干燥→真空包裝→貯存發(fā)酵主要原材料為糖蜜。1、高活性干面包酵母2、酒精生產(chǎn)、釀酒用的高活性干酵母3、制造酵母抽提物的高活性干酵母酵母抽提物即酵母精,由于其細(xì)胞內(nèi)含有核糖核酸及其加工后的水解產(chǎn)物（腺嘌呤核苷酸、鳥嘌呤核苷酸，胞嘧啶核苷酸，尿嘧啶核苷酸),其中腺嘌呤核苷酸的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物次黃嘌呤核苷酸和鳥嘌呤核苷酸有著強(qiáng)力鮮味，另外,酵母細(xì)胞含有豐富的蛋白質(zhì)，其水解產(chǎn)物中的谷氨酸等也呈鮮味，還有各種營養(yǎng)成分的配合,使酵母抽提物呈現(xiàn)出強(qiáng)力的鮮味。生產(chǎn)酵母抽提物的酵母菌種:啤酒酵母、面包酵母、產(chǎn)朊假絲酵母螺旋藻的培養(yǎng)生產(chǎn)及其應(yīng)用螺旋藻的生態(tài)螺旋藻可以在土壤、沼澤、淡水、鹽水、海水及溫泉中生長，甚至可在一些不適宜其它生物生長的環(huán)境下生長，如在含堿量很高的湖泊中它也能良好地生長。目前，工業(yè)化生產(chǎn)的螺旋藻大部分利用淡水養(yǎng)殖，但也有利用海水養(yǎng)殖。螺旋藻的生產(chǎn)按培養(yǎng)規(guī)?？煞譃閷?shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和工業(yè)化的大規(guī)模培養(yǎng)；按培養(yǎng)基類型可分為淡水培養(yǎng)和海水培養(yǎng)；按營養(yǎng)類型可分為光合自養(yǎng)型生長培養(yǎng)和混合營養(yǎng)型生長培養(yǎng)。培養(yǎng)方法（1)封閉式池(2）封閉式光合生物反應(yīng)器步驟（１)種子培養(yǎng)：（2）分批搖瓶培養(yǎng):（3）光合自養(yǎng)培養(yǎng)：3、培養(yǎng)條件(1)pH:光合自養(yǎng)生長時(shí),螺旋藻的最佳生長pＨ范圍為8．3~１１。０，最適pH為9。0±0．5。當(dāng)pH大于1１時(shí)，不利于生長。(2）溫度:螺旋藻的最適生長溫度為３5～37℃（3）氮源：螺旋藻除能利用無機(jī)氮外,還能利用尿素。（4）光照：當(dāng)營養(yǎng)和溫度正常的情況下,光照就成為影響螺旋藻生長的一個(gè)重要因素。發(fā)酵法生產(chǎn)新型食品膠—黃原膠黃單孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的細(xì)胞外雜多糖.由葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸，鼠李糖醋酸纖維素和丙酮酸等組成的陰離子雜多糖，其基本骨架為β—1,4葡萄糖連接而成直鏈纖維素分子，并且每隔一個(gè)葡萄糖單位都在葡萄糖的３位上連接一個(gè)三糖側(cè)鏈,側(cè)鏈由葡萄糖醛酸、甘露糖、鼠李糖等組成，而且甘露糖、鼠李糖分別帶有乙酰基和丙酮酸基,其相對分子質(zhì)量為２×106～50×１06培養(yǎng)基

黃單孢桿菌產(chǎn)生黃原膠常用的培養(yǎng)基是：以葡萄糖、蔗糖或淀粉等為碳源，以蛋白質(zhì)、魚粉、豆粉或硝酸鹽為氮源,加KＨ２PO4、MgSO４、ＣａCO3等無機(jī)鹽和Fｅ2+、Mn２+、Ｚn２+等微量元素，以及生成促進(jìn)劑谷氨酸、檸檬酸等。發(fā)酵工藝黃原膠的生產(chǎn)包括發(fā)酵和提取兩部分。發(fā)酵工藝是半連續(xù)發(fā)酵.實(shí)際過程是:種子培養(yǎng)種子擴(kuò)大發(fā)酵。黃單孢桿菌在生長過程中吸收氧氣，放出二氧化碳。其生長溫度為2０-35℃,40提取工藝(1）發(fā)酵液處理。經(jīng)離心法、過濾法、酶處理法、次氯酸鹽氧化法、過濾及超濾濃縮法預(yù)處理除去菌體細(xì)胞和各種不溶性雜質(zhì),使黃原膠中不再含活性的菌體細(xì)胞、影響產(chǎn)品質(zhì)量的不溶性雜質(zhì)和色素等，并對發(fā)酵液進(jìn)行濃縮。

（2）沉淀反應(yīng):用鈣鹽、鋁鹽、季銨鹽或酸沉淀法制取工業(yè)級精制品;用有機(jī)溶劑沉淀法制取食品級精制品。

（３)過濾沉淀物并進(jìn)行洗滌.

（4）干燥、粉碎、篩分、成品包裝。１單細(xì)胞蛋白的概念,簡述利用微生物生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的優(yōu)點(diǎn)及主要的原料。概念：利用各種基質(zhì)大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)菌、酵母菌、霉菌、微藻、光合細(xì)菌等而獲得的微生物蛋白單細(xì)胞蛋白的特點(diǎn)原料來源廣，微生物繁殖快,成本低,效益高。豬和牛的體重倍增時(shí)間分別為４～6周、1-2個(gè)月，植物體重倍增時(shí)間為l一2周,而細(xì)菌、酵母等微生物僅需2０~120min。1頭5０0kg的母牛每天能產(chǎn)蛋白質(zhì)約０。４kg。5００ｋg酵母每天至少生產(chǎn)5000kg蛋白質(zhì)。在實(shí)際的工業(yè)發(fā)酵罐中，酵母能夠生產(chǎn)出數(shù)噸蛋白質(zhì),生產(chǎn)率高達(dá)2—4kg／（h.m3培養(yǎng)液）。適合單細(xì)胞生產(chǎn)菌種和原料１）細(xì)胞和酵母利用甲醇、乙醇、甲烷和多鏈烷烴生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白(SCＰ)；2)利用廢物中的許多物質(zhì)轉(zhuǎn)化為SCＰ，如稻秸、蔗渣、檸蒙酸廢料、果核、糖漿、動物糞便和污物等；３）利用藻類（如小球藻、柵藻）生產(chǎn)ＳCP.４）生產(chǎn)SＣP的微生物有酵母、非病原性細(xì)菌、放線菌和真菌及藻類等，其中飼用酵母和藻類蛋白發(fā)展最快。１．人造肉:供人們直接食用,干酵母濃縮抽出液2。食品添加劑:烘烤食品蛋白質(zhì)添加物酵母濃縮蛋白:食品增鮮劑干酵母：含熱量低,減肥食品的添加劑3．防止食物變質(zhì):嬰兒粉、湯料、作料4．提高食品性能:與其它成分混合，食品更適于加工活性酵母:提高意大利烘餅的延薄性能5．飼料蛋白：家禽、豬、牛及魚等動物?是否有形成腎結(jié)石及痛風(fēng)的危險(xiǎn)酵母、細(xì)菌:核酸含量較高，易引起腎結(jié)石、痛風(fēng)藻類、霉類菌體:核酸含量較低，危險(xiǎn)性?。渴欠駮鹞改c的不良反應(yīng)乙醇培養(yǎng)的酵母，某些細(xì)菌、藻類：惡心、嘔吐？是否會引起皮膚的不良反應(yīng)亞硫酸紙漿廢液培養(yǎng)的酵母可能會引起皮膚機(jī)能的損害?是否存有致癌的化合物致癌物，多核碳?xì)浠衔?、簡述螺旋藻的化學(xué)組成及保健作用蛋白質(zhì)干藻粉蛋白質(zhì)含量達(dá)50％～７0％，是大豆的2倍，比牛肉、雞蛋白高3。５倍，更加重要的是其蛋白質(zhì)中８種必需氨基酸配比合理且全面。碳水化合物螺旋藻干粉中含碳水化合物１5％～20％,其中含有７%一8％為螺旋藻活性多糖（SP－1），其相對分子質(zhì)量為125９０,其組分含D－甘露糖30．938％、Ｄ－葡萄糖2９.779%、Ｄ-半乳糖22．755％、葡萄糖醛酸１6．526％,經(jīng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和藥理學(xué)評價(jià)，具有消除各種炎癥、抑癌等功能脂肪螺旋藻具有低脂肪、低膽固醇的特點(diǎn),其脂類含量僅為4%左右，其中γ—亞麻酸占1%，這種高度不飽和脂肪酸對降低膽固醇和作為前列腺素合成的前體，并對降壓、止痛、消炎等具有重要的藥理作用。維生素螺旋藻中含有多種維生素，其中維生素Ｂ12含量豐富,維生素E的含量也比麥芽的含量高。植物色素螺旋藻的植物色素含量豐富，其類胡蘿卜素在干粉中的含量為0．2％～０。4%，為其它植物的10倍以上，主要由葉黃素和β—胡蘿卜素組成。其中β—胡蘿卜素在所有已知的食品中含量最高，是一類很有應(yīng)用價(jià)值的色素源。它可在某些觀賞動物或蝦、魚類體內(nèi)合成蝦青素及斑螯黃質(zhì),能有效地起到著色效果，從而使對蝦、珍貴海產(chǎn)魚類、觀賞魚、寵物、雞及雞蛋等具有美麗的色彩.礦物質(zhì)ｌOOg螺旋藻干粉中含鉀高達(dá)1500-2000mｇ，含鎂200～3０0mg,含鐵50-１00ｍg,而鈉的含量甚微。鉀能促進(jìn)人體內(nèi)鈉的排泄,可預(yù)防高血壓；鎂具有保護(hù)人體循環(huán)器官、預(yù)防心臟病等功能;鐵具有造血功能.另外，螺旋藻還含有微量元素硒、鋅、錳等螺旋藻在地球上出現(xiàn)已有３0億年之久,是一種利用光合作用的水生低等植物,在分類學(xué)上屬于藍(lán)藻門,顫藻科，已發(fā)現(xiàn)有３0多種，因其藻體呈絲狀螺旋形而得名。至目前為止,有利用價(jià)值的藻種主要有兩種：鈍頂螺旋藻和極大螺旋藻。認(rèn)為螺旋藻對糖尿病、貧血癥、肝臟疾病、潰瘍病、胰腺炎、視力障礙、白血癥、過敏癥、癌癥等均有治療和預(yù)防功效3、簡述黃原膠的性能及其在食品工業(yè)上的應(yīng)用。(１）強(qiáng)親水性:溶于冷水、熱水、多種鹽溶液及酸、堿水溶液中，其溶解性為熱水優(yōu)于冷水，堿性水優(yōu)于酸性水溶液,鹽濃度增加溶解性降低，溶解時(shí)間延長。（2）增稠性：黃原膠在低濃度時(shí)即可獲得高粘度，在相同濃度下其水溶液的粘度是海藻膠的3~５倍。(3）穩(wěn)定性:黃原膠溶液對熱、酸堿、鹽、水解酶等穩(wěn)定。如在0－10０℃范圍內(nèi)加熱處理其粘度基本無變化，ｐH５—（4）懸浮性與乳化性:(５)黃原膠與其他食品膠的協(xié)同增效性黃原膠與大多數(shù)合成或天然食品膠具有良好的同增效性,例如與刺槐豆膠、瓜爾豆膠、羧甲基纖維素、變性淀粉、糊精、海藻膠等都能互溶，混溶后其粘度顯著提高.在食品工業(yè)中的應(yīng)用增稠劑懸浮劑乳化劑穩(wěn)定劑．在食品工業(yè)中把它應(yīng)用于奶制品，如奶酪、果奶飲料、冰淇淋、酸奶等中,可起到改善品質(zhì)、增加穩(wěn)定性、易于香味釋放、口感細(xì)膩清爽的作用；用于果汁飲料時(shí)能保持液體均勻、不分層;加入啤酒,產(chǎn)泡豐富;在沙拉調(diào)汁中加入黃原膠,乳化穩(wěn)定可達(dá)一年以上；點(diǎn)心餡中加入黃原膠,使產(chǎn)品不發(fā)生膠體脫水收縮現(xiàn)象，保持松軟潤口。黃原膠耐高溫．用黃原膠水溶液預(yù)處理后對成品的失水起著特殊的保護(hù)作用，能達(dá)到保濕保鮮效果.?第四章細(xì)胞工程與食品工業(yè)植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)①從健康植株的特定部位或組織,如根、莖、葉、花、果實(shí)、胚珠、花藥和花粉等，選擇用于組織培養(yǎng)的起始材料,稱之為外植體。②用一定的化學(xué)藥劑,最常用的有次氯酸鈉,升汞和酒精等對外植體表面消毒，建立無菌培養(yǎng)體系。嚴(yán)格控制無菌條件，這是獲得培養(yǎng)成功的重要一步。②外植體塊在培養(yǎng)基上形成疏松的愈傷組織,由愈傷組織分化出芽并可誘導(dǎo)形成根的小植株。第二節(jié)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動物細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞融合技術(shù)（體細(xì)胞雜交技術(shù)）細(xì)胞培養(yǎng)的甚本概念傳代培養(yǎng)（觀看視頻）:細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時(shí)間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。原代培養(yǎng)(觀看視頻）從體內(nèi)取出組織細(xì)胞開始培養(yǎng)到第一次進(jìn)行傳代之前的時(shí)期。原代培養(yǎng)作用:一個(gè)特征性的必然的生長階段，組織細(xì)胞完成從體內(nèi)環(huán)境到體外環(huán)境的過渡和適應(yīng)過程，恢復(fù)了分裂增殖與生長發(fā)育的能力細(xì)胞培養(yǎng)：使用單個(gè)細(xì)胞懸液組織培養(yǎng):使用組織塊(0。5~１立方毫米）或薄片(厚０．2毫米器官培養(yǎng)：使用器官原基或器官的一部分或整個(gè)器宮原代培養(yǎng)細(xì)胞的生命歸宿1）原代培養(yǎng)期2)傳代期:將原代培養(yǎng)物經(jīng)過分割，重新接種到兩個(gè)或兩個(gè)以上的器皿內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)入傳代培養(yǎng)期。整個(gè)培養(yǎng)過程的主要時(shí)期?特點(diǎn)：原代培養(yǎng)物－—-－-—－——要經(jīng)過反復(fù)傳代

注意:傳代培養(yǎng)期并不單指原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代后的“第一代”培養(yǎng)過程，而是指由首次傳代開始經(jīng)反復(fù)傳代一直到培養(yǎng)物開始衰退之前的全部時(shí)間3)衰退期:衰退期不同于每一代培養(yǎng)細(xì)胞的停滯期。處于衰退期的細(xì)胞以任何方法都不能阻止其向死亡方向發(fā)展。?特點(diǎn):可見細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)暗的顆粒樣結(jié)構(gòu)及空泡狀結(jié)構(gòu)、胞質(zhì)突起回縮，有時(shí)可脫落細(xì)胞系：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功即稱為細(xì)胞系細(xì)胞株:通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物連續(xù)細(xì)胞系／無限細(xì)胞系：能夠連續(xù)傳代的細(xì)胞有限細(xì)胞系：不能連續(xù)培養(yǎng)的2．２培養(yǎng)細(xì)胞的特性2。2。1培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式1）貼附生長：必須貼附于支持物表面才能生長.見于各種實(shí)體瘤細(xì)胞2）懸浮生長:于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支持物表面。見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞

培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件1）細(xì)胞的營養(yǎng)需要：能源物質(zhì)、碳源、氮源、水分、無機(jī)鹽和生長因子等2）細(xì)胞的生存環(huán)境溫度：３7O2CO２：５％CO2+H2Ｏ←→H2CO3←→H++ＨＣO3-pH：７.2-７。4滲透壓3）無污染4)無毒為什么要控制滲透壓？滲透壓通過什么辦法來調(diào)整？——維持細(xì)胞的正常形態(tài)和功能；控制培養(yǎng)液的物質(zhì)濃度培養(yǎng)細(xì)胞活力測定任何培養(yǎng)瓶內(nèi)生長的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。1)細(xì)胞克隆形成率實(shí)驗(yàn)?單個(gè)細(xì)胞在體外增殖６代以上,其后代所組成的細(xì)胞群體形成肉眼可見的克隆?？寺⌒纬陕视脕肀硎炯?xì)胞的增殖能力克隆形成率比＝克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)缺點(diǎn):操作繁瑣優(yōu)點(diǎn)：精確、可靠無菌操作中的注意事項(xiàng)在無菌操作中，一定要保持工作區(qū)的無菌清潔操作前無菌室及無菌操作臺以紫外燈照射３0-６0分鐘滅菌，以70%etｈanol擦拭無菌操作臺面，并開啟無菌操作臺風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘操作時(shí),小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染.勿碰觸吸管尖頭部或容器瓶口,亦不要在打開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用在整個(gè)無菌操作過程中都應(yīng)該在酒精燈的周圍進(jìn)行細(xì)胞凍存和復(fù)蘇細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。?１)游離期：細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)。也稱懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。時(shí)間:10分鐘一４小時(shí)2）貼壁期：細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細(xì)胞株平均在１0分鐘一4小時(shí)貼壁。底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等細(xì)胞如何實(shí)現(xiàn)貼壁生長血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質(zhì))，這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的底物附著。進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團(tuán)）３）潛伏期此時(shí)細(xì)胞有生長活動,而無細(xì)胞分裂.細(xì)胞株潛伏期一般為6~24小時(shí)4）對數(shù)生長期：細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長,活力最佳,最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。5)停止期（平臺期）:細(xì)胞長滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂為什么有活力但卻不再分裂？機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性接觸抑制、密度依賴性定義:細(xì)胞在生長過程中達(dá)到相互接觸時(shí)停止分裂的現(xiàn)象。將正常細(xì)胞因相互接觸而抑制分裂的現(xiàn)象改稱為密度依賴性的生長抑制。為什么惡性細(xì)胞能無限增生:在相同條件下培養(yǎng)的惡性細(xì)胞對密度依賴性生長抑制失去敏感性，因而不會在形成單層時(shí)停止生長,而是相互堆積形成多層生長的聚集體,這種現(xiàn)象也說明惡性細(xì)胞的生長和分裂已經(jīng)失去了控制，調(diào)節(jié)細(xì)胞正常生長和分裂的信號對于惡性細(xì)胞不再起作用。?為什么——--——細(xì)胞膜上有糖類和蛋白質(zhì)共同構(gòu)成的糖蛋白，也叫做糖被。作用：在細(xì)胞上起識別作用.當(dāng)細(xì)胞增殖到一定程度,也就是互相挨在一起的時(shí)候,糖蛋白識別了這種信息，就會使細(xì)胞停止繼續(xù)繁殖，思考:為什么對動物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)通常要添加血清?——在人們沒有完全清楚細(xì)胞所需營養(yǎng)物質(zhì)的條件下，通過向成分已知的合成培養(yǎng)基中添加血清模擬內(nèi)環(huán)境,能保證細(xì)胞得到生長增殖所必須的各類物質(zhì)因子。貼壁生長細(xì)胞傳代方法:?1.吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液2．加入1-２ml0．25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn))靜置2－10miｎ（顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測）.3．吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液.４.用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞,形成細(xì)胞懸液。5.吸?。?10-1／４0細(xì)胞懸液,接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi).6.加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶內(nèi).7。將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng).培養(yǎng)細(xì)胞活力測定?細(xì)胞生長各個(gè)時(shí)期的特點(diǎn):?

滯后期(延遲期）：細(xì)胞很少分裂,其長短與接種量、?大小和繼代時(shí)原種細(xì)胞所處的生長期有關(guān);

對數(shù)生長期：細(xì)胞分裂活躍，細(xì)胞數(shù)目增加，增長速

率保持不變；?直線生長期：細(xì)胞生長和發(fā)育最明顯的時(shí)期?緩慢期：生長逐漸緩慢，培養(yǎng)液消耗將盡,有毒代謝?物質(zhì)增多,氧氣減少;

靜止期:生長幾乎處于停止?fàn)顟B(tài)，細(xì)胞數(shù)目增加極

少，甚至開始死亡。細(xì)胞同步化是指同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細(xì)胞都同時(shí)通過細(xì)胞周期的某一特定時(shí)期。

一懸浮培養(yǎng)(cellsusｐensionculture）懸浮培養(yǎng)是細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法，是將單個(gè)游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。愈傷組織誘導(dǎo)愈傷組織源出于自然生長的植物受損傷時(shí)，在愈合傷口處長出的一團(tuán)瘤狀突起，瘤狀突起內(nèi)的細(xì)胞相對于植物體成熟細(xì)胞已發(fā)生脫分化的變化。這一概念后來被引入植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域.培養(yǎng)中的愈傷組織是指從外植體的內(nèi)部或切口表面形成的一團(tuán)沒有分化的組織，這種組織具有再分化的能力。要求:松散性好，增殖快，再生能力強(qiáng)。其外觀一般是鮮艷的乳白或淡黃色,呈細(xì)小顆粒狀,松散易碎。如何獲得符合要求的愈傷組織?1、選擇適宜的外植體:胚、胚軸、子葉是最常用的外植體，特別是幼胚。不同外植體的比較：一般雙子葉植物比單子葉和裸子植物誘導(dǎo)愈傷組織容易;幼年細(xì)胞和組織比成年細(xì)胞和組織容易;二倍體細(xì)胞比單倍體細(xì)胞容易。2、選擇適宜的培養(yǎng)基:生長素濃度很重要，配合一定濃度的細(xì)胞分裂素；添加附加物.外源激素是一種誘導(dǎo)劑,能誘導(dǎo)細(xì)胞開始分裂，外源生長物質(zhì)往往是通過調(diào)整它的種類和濃度來誘導(dǎo)細(xì)胞開始分裂的。最常用的有2，4－D、NAA、IＡＡ和細(xì)胞分裂素等。組織的機(jī)械損傷也作為一種刺激因素誘導(dǎo)細(xì)胞開始分裂，愈傷組織往往出現(xiàn)在傷口處。有些天然提取物對愈傷組織的誘導(dǎo)和維持十分有益,常用的有椰子汁（10%)，0．５%的酵母提取物，5%～10％的番茄汁。3、愈傷組織要進(jìn)行繼代選擇：選擇疏松性好、細(xì)胞狀態(tài)好的細(xì)胞不斷繼代培養(yǎng).成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系必須滿足3個(gè)條件：1、浮懸培養(yǎng)物分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般在３0～50個(gè)細(xì)胞以下，在實(shí)際培養(yǎng)中很少有完全由單細(xì)胞組成的植物細(xì)胞懸浮系。２、均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同，懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細(xì)胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色.３、細(xì)胞生長迅速，懸浮細(xì)胞的生長量一般2~3天甚至更短時(shí)間便可增加１倍?；镜膽腋∨囵B(yǎng)體系均是將細(xì)胞分散在一定容積的培養(yǎng)液中進(jìn)行，在一個(gè)培養(yǎng)周期不添加培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)體系基本是處于封閉狀態(tài)。當(dāng)一種營養(yǎng)物質(zhì)耗盡時(shí),細(xì)胞及停止生長.在這種懸浮培養(yǎng)體系中，細(xì)胞擴(kuò)增生長成Ｓ形曲線。②懸浮培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目的增殖變化細(xì)胞生長各個(gè)時(shí)期的特點(diǎn)：

?滯后期（延遲期）：細(xì)胞很少分裂，其長短與接種量、

大小和繼代時(shí)原種細(xì)胞所處的生長期有關(guān)；

對數(shù)生長期：細(xì)胞分裂活躍，細(xì)胞數(shù)目增加,增長速

率保持不變；?直線生長期:細(xì)胞生長和發(fā)育最明顯的時(shí)期

緩慢期:生長逐漸緩慢,培養(yǎng)液消耗將盡，有毒代謝

物質(zhì)增多,氧氣減少；

靜止期：生長幾乎處于停止?fàn)顟B(tài),細(xì)胞數(shù)目增加極?少，甚至開始死亡。培養(yǎng)周期的概念具有一定起始培養(yǎng)密度的單細(xì)胞，從開始培養(yǎng)到細(xì)胞數(shù)目和總重量增長停止這一過程,稱為一個(gè)培養(yǎng)周期.培養(yǎng)細(xì)胞的起始密度最低有效密度的概念

在懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中，使懸浮培養(yǎng)細(xì)胞能夠增殖的最少接種量稱為最低有效密度或者臨界的起始密度。

最低有效密度由于培養(yǎng)材料、原種培養(yǎng)條件，原種保存時(shí)間長短、培養(yǎng)基的成分不同而有差異，一般為-—10４——105細(xì)胞/ml。細(xì)胞同步化是指同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細(xì)胞都同時(shí)通過細(xì)胞周期的某一特定時(shí)期。

同一培養(yǎng)體系中，細(xì)胞不同步使懸浮細(xì)胞的分裂、代謝以及生理、生化狀態(tài)等更趨復(fù)雜化,所以人們一直希望通過一定的技術(shù)途徑，使同一培養(yǎng)體系中的細(xì)胞能保持相對一致的細(xì)胞學(xué)和生理學(xué)狀態(tài).工作中常用的處理方法:

①物理方法

A、分選法?通過細(xì)胞體積大小分級,直接將處于相同周期的細(xì)胞進(jìn)行分選，然后將同一狀態(tài)的細(xì)胞繼代培養(yǎng)于同一培養(yǎng)體系中。B、冷處理法。?低溫處理可以提高培養(yǎng)體系中細(xì)胞同步化的程度。

②化學(xué)方法?A、饑餓法?懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中，若斷絕供應(yīng)一種細(xì)胞分裂所必需的營養(yǎng)成分或激素，使細(xì)胞停滯在G１或G2期,經(jīng)過一段時(shí)間的饑餓之后,當(dāng)在培養(yǎng)基中重新加入這種限制因子時(shí)，靜止細(xì)胞就會同步進(jìn)入分裂。B、抑制劑法?通過一些DNA合成抑制劑處理細(xì)胞，使細(xì)胞停留在DNA合成前期,當(dāng)解除抑制后,即可獲得處于同一細(xì)胞周期的細(xì)胞。

常用的抑制劑有5—氟脫氧尿苷，5—氨基尿嘧啶、羥基尿等。

C、有絲分裂阻抑

用秋水仙素處理指數(shù)生長的懸浮培養(yǎng)物,濃度一般控制在0.2％，處理時(shí)間以４-６小時(shí)為宜。

懸浮細(xì)胞的同步化無論何種細(xì)胞同步化處理，對細(xì)胞本身或多或少都有一定的傷害。如果處理的細(xì)胞沒有足夠的生活力，不僅不能獲得理想的同步化效果，還可能造成細(xì)胞的大量死亡,因此在進(jìn)行同步化處理之前,細(xì)胞必須進(jìn)行充分的活化培養(yǎng)。用于處理的細(xì)胞系最好處于對數(shù)生長期二、單細(xì)胞培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)不能對某一細(xì)胞進(jìn)行定點(diǎn)觀察和分析,也就不能進(jìn)行定點(diǎn)選擇。因此,在進(jìn)行細(xì)胞株(種子細(xì)胞)選擇和需要對細(xì)胞活動跟蹤觀察的情況下,必須進(jìn)行真正意義上的單細(xì)胞培養(yǎng).由于植物細(xì)胞的團(tuán)聚性,單細(xì)胞培養(yǎng)還比較困難。、細(xì)胞平板培養(yǎng)平板培養(yǎng)(platecｕltｕre):將一定密度的懸浮細(xì)胞接種到一薄層固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)。1）單細(xì)胞的分離：用于平板培養(yǎng)的小細(xì)胞團(tuán)不能超過6個(gè)細(xì)胞，所以過濾時(shí)篩網(wǎng)的網(wǎng)孔大小要合適。２)單細(xì)胞懸浮液的制備:分離的單細(xì)胞經(jīng)低速離心，培養(yǎng)液洗滌2次后，調(diào)整密度為5×105／ｍl。3）植板：將1份已調(diào)整好密度的單細(xì)胞懸浮液與4份35℃基充分混合均勻，然后均勻地平鋪于培養(yǎng)皿中,厚度約1～2ｍｍ。4)封口:用石蠟?zāi)し馀囵B(yǎng)皿。鏡檢：用倒置顯微鏡觀察將單細(xì)胞做標(biāo)記,已獲得真正的單細(xì)胞系。培養(yǎng)：２5℃平板培養(yǎng)的效果一般用植板率來衡量.植板率:能長出細(xì)胞團(tuán)的單細(xì)胞在接種單細(xì)胞中所占的比例.植板率(％）＝每個(gè)平板形成的細(xì)胞團(tuán)數(shù)每個(gè)平板接種的細(xì)胞總數(shù)平板培養(yǎng)中細(xì)胞密度和培養(yǎng)基成分是培養(yǎng)成功的關(guān)鍵,而細(xì)胞密度和培養(yǎng)基成分互相依賴（負(fù)相關(guān)）。２、看護(hù)培養(yǎng)概念：用一塊愈傷組織或植物離體組織看護(hù)單細(xì)胞使其生長增殖的一種單細(xì)胞培養(yǎng)方法。操作方法:在固體培養(yǎng)基上置入一塊活躍生長的愈組織,再在愈傷組織上放一小片濾紙，待濾紙濕潤后將細(xì)胞接種于濾紙上。當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞長出微小細(xì)胞團(tuán)以后,將其直接轉(zhuǎn)至瓊脂培養(yǎng)基上讓其迅速生長三、植物細(xì)胞的規(guī)?；囵B(yǎng)及有用物質(zhì)生產(chǎn)第四節(jié)細(xì)胞融合技術(shù)細(xì)胞融合定義,利用自然或人工方法使兩個(gè)或幾個(gè)不同細(xì)胞融合為一個(gè)細(xì)胞．機(jī)理1）細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)磷脂雙分子層，因此具有流動性2)如何實(shí)現(xiàn)不同細(xì)胞之間的融合:１.膜之間相互靠近(克服二者之間靜電斥力和水合力）2．兩層膜連接起來（局部雙層結(jié)構(gòu)破壞，形成不穩(wěn)定的中間結(jié)構(gòu)）3．胞內(nèi)物質(zhì)交換（遺傳物質(zhì)發(fā)生交換重組）4．新的雙層構(gòu)象重新形成3)主要影響因素(1)pＨ；〉8—9形成雙層,＜7形成非雙層（2）鈣離子：誘發(fā)膜上帶負(fù)電荷脂雙層結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，并能中和電荷，靜電斥力減弱,水化作用減弱。(3）溫度：溫度升高，使非雙層脂的脂雙層