酶促反應動力學生物化學全

第10章酶促反應動力學

影響酶促反應速度的因素

kineticsofenzyme—catalyzedreactions

酶促反應動力學生物化學全酶促反應的動力學酶促反應速度的測定與酶的活力單位反應時間產(chǎn)物濃度1酶促反應速度的測定2酶活力的測定酶促反應動力學生物化學全酶活力的表示方法酶的活力單位習慣單位：某酶在最適條件下，單位時間內(nèi)一定底物的減少或產(chǎn)物的生成所需的酶量國際單位（IU）：在標準條件下，一分鐘內(nèi)催化1umol底物轉化的酶量為一個酶活力單位Kat單位：在一定條件下，每秒鐘轉化1mol底物所需的酶量酶的比活力每毫克蛋白所含酶的活力單位數(shù)（常常作為酶制劑純度的指標）酶的轉換數(shù)（Kcat）每秒鐘、每個酶分子轉換底物的umol數(shù)酶促反應動力學生物化學全影響酶反應速度的因素

2、底物濃度3、pH（最適pH的概念）4、溫度（最適溫度的概念）5、激活劑6、抑制劑1、酶濃度當S足夠過量，其它條件固定且無不利因素時，v=k[E]酶促反應動力學生物化學全二、底物濃度對酶反應速度的影響1、酶反應速度與底物濃度的關系曲線（Michaelis—Menten曲線）2、米氏方程的提出及推導3、米氏常數(shù)的意義4、米氏常數(shù)的測定酶促反應動力學生物化學全1、酶反應速度與底物濃度的關系曲線酶促反應動力學生物化學全酶促反應速度的測定反應時間產(chǎn)物濃度酶促反應動力學生物化學全底物濃度對酶促反應速度的影響一級反應混合級反應零級反應[S]VVmax1/2VmaxKm酶促反應速度與底物濃度的關系（Michaelis-Menten曲線）1、當?shù)孜餄舛容^低時，表現(xiàn)為一級反應（v=dc/dt=kc線性關系）2、隨著底物濃度的增加，反應表現(xiàn)為混合級反應。3、當?shù)孜餄舛冗_到相當高時，表現(xiàn)為零級反應（與底物濃度無關）。

酶促反應動力學生物化學全根據(jù)以上實驗結果，Henri和Wurtz提出了酶底物中間絡合物學說。即酶和底物形成中間復合物的學說已得到許多實驗證明。k2k1k3酶促反應動力學生物化學全2、單分子酶促反應的米氏方程及Km推導原則：從酶被底物飽和的現(xiàn)象出發(fā)，按照“穩(wěn)態(tài)平衡”假說的設想進行推導。假定：1、[ES]穩(wěn)態(tài)(濃度保持不變的狀態(tài))2、[底物]》[E]3、ES分解成產(chǎn)物的逆反應忽略不記k2k1k3酶促反應動力學生物化學全米氏方程的推導則：k2k1k3設km=———k2+k3k1[][][][][]1kESSESSEt=-k2+k3[ES]生成速度：V1=K1([Et]-[ES])[S][ES]分解速度：

V2=K2[ES]+K3[ES]即：K1([Et]-[ES])[S]=K2[ES]+K3[ES]當酶反應體系處于恒態(tài)時：V1=

V2酶促反應動力學生物化學全將（4）代入（3）則：(1)經(jīng)整理得：將（1）代入（2）得：(3)當[Et]=[ES]時，所以

酶促反應速度由[ES]決定，即

（2）(4)[]tmEkV3=[]ESkv3=[][][]SKSEkmt+=3酶促反應動力學生物化學全米氏方程:米氏常數(shù):

km=———k2+k3k1酶促反應動力學生物化學全3、Km值（米氏常數(shù)）的意義（重點）（1）Km的物理意義：當酶促反應速度達到最大反應速度一半時的底物濃度。（2）Km是酶的特征常數(shù)之一，只與酶的性質有關，與酶濃度無關。（3）如果一種酶有幾種底物，則對每一種底物，各有一個特定的Km值，其中Km最小的稱為該酶的最適底物或天然底物。Km還受PH及溫度的影響，因此Km作為常數(shù)只是針對一定的底物、一定PH、一定溫度而言。測定的Km值可以作為鑒別酶的手段，但是必須在指定的實驗條件下進行。酶促反應動力學生物化學全酶底物Km(mmol/L)脲酶尿素25溶菌酶6-N-乙酰葡萄糖胺0.006葡萄糖-6-磷酸脫氫酶6-磷酸-葡萄糖0.058胰凝乳蛋白酶苯甲酰酪氨酰胺2.5甲酰酪氨酰胺12.0乙酰酪氨酰胺32.0Km=(k2+k3)/k1酶促反應動力學生物化學全（4）判斷反應速率v和Vmax之間的關系：若已知某個酶的Km值，就可以計算出在某一底物濃度時，其反應速率v相當于Vmax的百分率。或計算任何v下的[s]。（用Km的倍數(shù)表示）。

練習題：已知某酶的Km值為0.05mol.L-1，要使此酶所催化的反應速度達到最大反應速度的80％時底物的濃度應為多少？

酶促反應動力學生物化學全（5）、Km值可以幫助推斷某一代謝反應的方向和途徑，這對了解酶在細胞內(nèi)的主要催化方向及生理功能有重要意義。催化可逆反應的酶，對正逆兩向底物的Km值往往是不同的，測定這些Km值的差別以及細胞內(nèi)正逆兩向底物的濃度，可以大致推測該酶催化正逆兩向反應的效率。酶促反應動力學生物化學全Vmax的意義

在一定酶濃度下，酶對特定底物的Vmax也是一個常數(shù)。pH、溫度和離子強度等因素也影響Vmax的數(shù)值，同一種酶對不同底物的Vmax也不同。酶促反應動力學生物化學全轉換數(shù)的定義當?shù)孜餄舛群芨邥r，Vmax=k3[ES]=k3[E]，k3表示當酶被底物飽和時，每秒鐘每個酶分子轉換底物的分子數(shù)，這個常數(shù)又叫做轉換數(shù)(簡稱TN)，又稱為催化常數(shù)(catalyticconstant，kcat)。kcat值越大，表示酶的催化效率越高。酶促反應動力學生物化學全主要利用作圖法測定Vmax?Vmax[S]vKm4、米氏常數(shù)的測定(1)測定不同底物濃度的反應初速率，以v-[S]作圖，可以得到Vmax，再從1/2Vmax，可求得相應的[S]，即Km值。酶促反應動力學生物化學全(2)雙倒數(shù)作圖法1VKm+[S]Vmax[S]=KmVmax.[S]1+Vmax1=V1Vmax1Km1-[S]1Lineweaver-Burk曲線斜率=Km/Vmax將米氏方程式兩側取雙倒數(shù)，以1/v--1/[s]作圖，得出一直線.酶促反應動力學生物化學全

將左式兩邊均乘以[S]得：以[s]/v～[s]作圖，得一直線，橫軸的截距為-Km，斜率為1/Vmax(3)Hanes—Woolf作圖法1VKmVmax.[S]1+Vmax1=酶促反應動力學生物化學全三、pH對酶反應速度的影響酶促反應動力學生物化學全

pH影響酶活力的原因：

(1)過酸或過堿可以使酶的空間結構破壞，引起酶構象的改變，酶活性喪失。(2)當pH改變不很劇烈時，酶雖未變性，但活力受到影響。影響了底物的解離狀態(tài)；影響酶分子活性部位上有關基團的解離；影響到中間絡合物ES的解離狀態(tài)，不利于催化生成產(chǎn)物。(3)影響維持酶分子空間結構的有關基團解離，從而影響酶活性部位的構象。酶促反應動力學生物化學全四、溫度與酶反應速度的關系在達到最適溫度以前，反應速度隨溫度升高而加快酶是蛋白質，其變性速度亦隨溫度上升而加快酶的最適溫度不是一個固定不變的常數(shù)v溫度酶促反應動力學生物化學全

溫度對酶反應的影響

最適溫度

機理：溫度導致酶蛋白變性酶促反應動力學生物化學全溫度對酶反應的影響在最適溫度之前，一般溫度越高，反應速度就越快。Q10（溫度系數(shù)）：反應溫度提高10℃，其反應速率與原來反應速率之比，對大多數(shù)酶來講，溫度系數(shù)Q10多為2，酶的固體狀態(tài)比在溶液中對溫度的耐受力要高。通常酶制劑以固體保存為佳。酶促反應動力學生物化學全五、激活劑對反應速度的影響激活劑：能提高酶活性的物質2中等大小的有機分子：輔助因子；可能與酶分子肽鏈上側鏈基團結合，穩(wěn)定酶分子活性構象；生成螯合物，在酶和底物間起橋梁作用1無機離子金屬離子非金屬離子（陰離子）還原劑:Cys、GSH金屬螯合劑：EDTA3具有蛋白質性質的生物大分子（酶原的激活）一些蛋白酶酶促反應動力學生物化學全1.激活劑(activator)激活劑：凡是能提高酶活性的物質。其中大部分是無機離子或簡單有機化合物。金屬離子有K+、Na+、Ca2+、Mg2+等離子，如Mg2+是多數(shù)激酶及合成酶的激活劑，無機陰離子如：Cl—、Br—、I—等都可作為激活劑。如Cl—是唾液淀粉酶的激活劑簡單的有機化合物：Cys對某些含巰基的酶有激活作用酶促反應動力學生物化學全2.激活劑對酶作用的特點（1）激活劑對酶的作用具有一定的選擇性；即一種激活劑對某種酶起激活作用，而對另一種酶可能起抑制作用（2）有時金屬離子之間也可相互替代（3）激活離子對于同一種酶，可因濃度不同而起不同的作用，低濃度激活，高濃度抑制酶促反應動力學生物化學全六、抑制劑對酶促反應速度的影響（重點）酶促反應動力學生物化學全抑制劑（inhibitor）:使酶的必需基因或酶的活性部位中的基團的化學性質改變而降低酶活力甚至使酶完全喪失活性的物質。抑制作用(inhibition):酶的必需基團化學性質的改變，但酶未變性，而引起酶活力的降低或喪失。有選擇性。失活作用(inactivation):使酶蛋白變性而引起酶活力喪失的作用,變性劑對酶的變性作用無選擇性.抑制劑；抑制作用；失活作用酶促反應動力學生物化學全抑制與失活之間關系的總結失活抑制酶蛋白變性未變性機理酶蛋白結構解體必需基團性質改變變性劑或抑制劑無選擇性有選擇性酶促反應動力學生物化學全1、抑制作用的類型

根據(jù)抑制作用是否可逆:1、不可逆的抑制作用:抑制劑與酶的必需基團以共價鍵結合而引起酶活力喪失，不能用透析、超濾等物理方法除去抑制劑而使酶復活的作用.2、可逆的抑制作用:抑制劑與酶以非共價鍵結合而引起酶活力降低或喪失，能用物理方法除去抑制劑而使酶復活，抑制作用是可逆的v[E]12酶促反應動力學生物化學全非專一性不可逆抑制劑

抑制劑作用于酶分子中的一類或幾類基團，這些基團中包含了必需基團，因而引起酶失活。類型：酶促反應動力學生物化學全實例：有機磷殺蟲劑

-Ser-OH-Ser-OPO-RO-ROPO-RO-ROX酶促反應動力學生物化學全專一性不可逆抑制劑

這類抑制劑選擇性很強，它只能專一性地與酶活性中心的某些基團不可逆結合，引起酶的活性喪失。親和標記試劑：具有底物類似的結構，可以和相應的酶結合，同時還帶有一個活潑化學基團，能與酶分子中的必需基團反應進行化學修飾，從而抑制酶活性，因抑制是利用酶對底物的親和力來對酶進行修飾標記的，故稱之。

酶促反應動力學生物化學全自殺性底物：不但具有天然底物的類似結構，而且也是酶的底物，但它還有一個潛伏的反應基團，當酶對它進行催化反應時，這個潛伏的反應基團被暴露或活化，并作用于酶活性部位的必需基團或酶的輔基，使酶不可逆失活，這類抑制劑是專一性極高的不可逆抑制劑，故把這種抑制劑稱為自殺性底物。

酶促反應動力學生物化學全可逆抑制作用競爭性抑制非競爭性抑制反競爭性抑制酶促反應動力學生物化學全競爭性抑制（competitiveinhibition）抑制劑化學結構與底物相似，因而與底物競爭性地與酶活性中心結合E+PEI+IS+ESE酶促反應動力學生物化學全

實例：磺胺藥物的藥用機理H2N--SO2NH2對氨基苯磺酰胺H2N--COOH對氨基苯甲酸對氨基苯甲酸谷氨酸蝶呤葉酸酶促反應動力學生物化學全非競爭性抑制（noncompetitiveinhibition）酶可以同時與底物與抑制劑結合E+PEI+IS+ESES+ESI（不能分解為產(chǎn)物）+I酶促反應動力學生物化學全反競爭性抑制:酶只有在與底物結合后，才能與抑制劑結合S+ESE+PEESI（不能分解為產(chǎn)物）+I酶促反應動力學生物化學全競爭性抑制作用非競爭性抑制作用競爭性非競爭性抑制作用機理示意圖底物與酶專一性結合酶促反應動力學生物化學全2、可逆抑制作用的動力學（重點）（1）競爭性抑制的動力學特征Vmax不變，Km增大酶促反應動力學生物化學全競爭性抑制（competitiveinhibition