第四篇典型發(fā)酵工程過程篇演示文稿

第四篇典型發(fā)酵工程過程篇演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有88頁\編輯于星期一優(yōu)選第四篇典型發(fā)酵工程過程篇現(xiàn)在是2頁\一共有88頁\編輯于星期一第27章抗生素生產(chǎn)工藝27.1概述（視頻抗生素濫用之禍）27.1.1抗生素：微生物（細菌、真菌、放線菌）或動植物在生命活動中產(chǎn)生的，低濃度下選擇性地抑制或殺滅其他微生物或腫瘤細胞的具有生物活性的物質(zhì)。抗菌、抗腫瘤、抗病毒、抗原蟲、抗寄生蟲、抗血纖維蛋白溶酶作用。目前人們在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的6000多種抗生素，約60％來自放線菌?，F(xiàn)在是3頁\一共有88頁\編輯于星期一27.1.2抗生素發(fā)展史抗生素是現(xiàn)代生物學史上最偉大的成就之一。是人們使用最多的藥物，也是制藥工業(yè)中利潤最高的產(chǎn)品。世界各國由發(fā)酵法生產(chǎn)的抗生素約400種，廣泛應用的僅120種?？股厣a(chǎn)為近代微生物技術中最大產(chǎn)業(yè)之一，世界產(chǎn)量超過35000噸，不但在經(jīng)濟上占有重要位置，且為人類健康作了出巨大貢獻。

現(xiàn)在是4頁\一共有88頁\編輯于星期一青霉素：弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素是最早發(fā)現(xiàn)并用于臨床的一種抗生素。1928年英國人FIeming發(fā)現(xiàn)，20世紀40年代投入工業(yè)生產(chǎn)，它能有效地控制傷口的細菌感染，在二戰(zhàn)期間挽救了數(shù)百萬戰(zhàn)爭中受傷者的性命。推動抗生素發(fā)展：牛津大學病理學教授弗洛里、錢恩等優(yōu)秀的化學家。1952年的諾貝爾生理學或醫(yī)學獎頒發(fā)給塞爾曼·亞伯拉罕·瓦克斯曼（SelmanAbrahamWaksman

），他發(fā)現(xiàn)了鏈霉素，第一有效抗生素用于治療肺結核。

現(xiàn)在是5頁\一共有88頁\編輯于星期一27.1.3抗生素的分類現(xiàn)在是6頁\一共有88頁\編輯于星期一抗生素的分類現(xiàn)在是7頁\一共有88頁\編輯于星期一27.2抗生素工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)過程1.生物合成法：①傳統(tǒng)方法②“工程菌”制造法③細胞融合技術法

2.化學合成法；

3.生物合成+化學合成法生產(chǎn)方法現(xiàn)在是8頁\一共有88頁\編輯于星期一27.2.1生物合成法：①傳統(tǒng)方法：多數(shù)抗生素是由放線菌和霉菌產(chǎn)生

菌種從土壤中分離、篩選獲得，采用深層通風攪拌發(fā)酵罐生產(chǎn)。由于傳統(tǒng)方法存在很多不足，人們采用基因工程和細胞融合技術，對抗生素產(chǎn)生菌進行了改造，可以制造出許多高效低毒的新型抗生素，通過改革工藝，使抗生素產(chǎn)量成倍地增長。現(xiàn)在是9頁\一共有88頁\編輯于星期一②“工程菌”制造法

第一次由“工程菌”制造的全新抗生素—麥迪紫紅素A是美國報道的。將產(chǎn)放線紫紅素的部分基因插入產(chǎn)麥迪霉素的放線菌中，構建的“工程菌”產(chǎn)生了全新的抗生素。

我國新構建的生產(chǎn)丁胺卡那霉素的“工程菌”，就是把?；富蚩寺〉娇敲顾禺a(chǎn)生菌中獲得的。新的“工程菌”生產(chǎn)的新抗生素毒副作用小，對耐卡那霉素、慶大霉素致病菌臨床療效顯著。現(xiàn)在是10頁\一共有88頁\編輯于星期一③細胞融合技術法

對抗生素產(chǎn)生菌采用細胞融合技術的成果更為突出。橄欖色無孢小單孢菌細胞融合株抗生素產(chǎn)率比原菌株提高100倍。目前DNA重組技術已廣泛用于紅霉素、鏈霉素等20多種抗生素的育種工作，不久將來會有更多的由“工程菌”生產(chǎn)的新型抗生素問世?，F(xiàn)在是11頁\一共有88頁\編輯于星期一27.2.2化學合成法

根據(jù)某種抗生素的化學組成和結構，通過化學合成的方法，可生產(chǎn)部分抗生素。如氯霉素、磷霉素等。經(jīng)過化學合成方法和控制條件的不斷深入研究，越來越多的抗生素可用化學合成法生產(chǎn)?，F(xiàn)在是12頁\一共有88頁\編輯于星期一27.2.3生物合成加化學合成法許多細菌逐漸出現(xiàn)了抗藥性，證實某些抗藥性因子位于細菌內(nèi)的質(zhì)粒上，質(zhì)粒在細菌之間轉移使抗性菌日益增多，抗生素療效就越來越低。為對付細菌的抗藥性，科學家對抗生素進行了“整容手術”，細菌因再無法識別改頭換面的抗生素而被抑制或殺死。現(xiàn)在已能使用克隆了?；富虻摹肮こ叹保ù竽c桿菌）高效率的生產(chǎn)半合成抗生素。臨床現(xiàn)在使用的特效藥物先鋒霉素（頭孢菌素類）、氨芐青霉素就是這類半合成抗生素類藥物?，F(xiàn)在是13頁\一共有88頁\編輯于星期一生產(chǎn)前期研究產(chǎn)生菌的篩選抗菌性試驗提取、精制、鑒定毒性試驗藥理和臨床試驗現(xiàn)在是14頁\一共有88頁\編輯于星期一Agardiffusionassayagarplate瓊脂培養(yǎng)基lawnoftestbacteria測試菌苔filterpaperssoakedwithtestcompounds含藥物濾紙zonesofinhibition(nogrowth)抑菌圈現(xiàn)在是15頁\一共有88頁\編輯于星期一微生物發(fā)酵生產(chǎn)抗生素的基本過程菌種→孢子制備→種子準備→發(fā)酵→發(fā)酵液過濾與預處理→提取及精制→成品包裝現(xiàn)在是16頁\一共有88頁\編輯于星期一現(xiàn)在是17頁\一共有88頁\編輯于星期一現(xiàn)在是18頁\一共有88頁\編輯于星期一Fleming分離的點青霉，只能產(chǎn)生2U/ml青霉素。目前全世界用于生產(chǎn)青霉素的高產(chǎn)菌株，大都由一種產(chǎn)黃青霉菌株經(jīng)不同改良途經(jīng)得到;20世紀70年代前育種：誘變和隨機篩選方法；現(xiàn)在原生質(zhì)體融合技術、基因克隆技術青霉素工業(yè)發(fā)酵已達80000U/ml。生產(chǎn)菌株一般在真空冷凍干燥狀態(tài)下保存其分生孢子，也可用甘油或乳糖溶劑作懸浮劑，在-70℃冰箱或液氮中保存孢子懸浮液和營養(yǎng)菌絲體。27.3青霉素生產(chǎn)工藝現(xiàn)在是19頁\一共有88頁\編輯于星期一HNONSCH3CH3HCOO-Hβ-內(nèi)酰胺環(huán)R青霉素類的基本結構：由母核6-氨基青霉烷酸(6-amino-penicillanicacid,6-APA)及側鏈組成，側鏈不同形成不同青霉素，抗菌能力不同6-APA是由一個噻唑環(huán)(A)連結β-內(nèi)酰胺環(huán)(B)組成BA現(xiàn)在是20頁\一共有88頁\編輯于星期一青霉素的分類青霉素G類:如青霉素G鉀、青霉素G鈉、長效西林等.青霉素V類:(別名苯氧甲基青霉素、６Ｇ苯氧乙酰胺基青霉烷酸)如青霉素V鉀等.耐酶青霉素:如苯唑青霉素(新青Ⅱ號)、氯唑青霉素等.廣譜青霉素:如氨芐西林、阿莫西林等.抗綠膿桿菌的廣譜青霉素:如羧芐西林、哌拉西林鈉、呋芐青霉素等.氮咪青霉素:如美西林及其酯匹美西林等,其特點為較耐酶,對某些陰性桿菌(如大腸桿菌、克雷伯菌和沙門菌)有效,但對綠膿桿菌效果差.現(xiàn)在是21頁\一共有88頁\編輯于星期一青霉素生產(chǎn)流程冷凍干燥孢子→瓊脂斜面→米孢子→種子罐（一、二級)→發(fā)酵罐→預處理→過濾→乙酸丁酯萃取→蒸發(fā)（脫水脫色）→結晶→工業(yè)鹽→綜合利用現(xiàn)在是22頁\一共有88頁\編輯于星期一27.3.1菌種：產(chǎn)黃青霉（(Penicilliumchrysogenum)產(chǎn)綠色、黃色孢子）生長發(fā)育分7個階段：Ⅰ期：分生孢子萌發(fā)；Ⅱ期：菌絲繁殖；Ⅲ期：脂肪粒形成；Ⅳ期：脂肪粒減少，中、小空孢Ⅴ期：形成大空孢，脂肪粒消失；Ⅵ~Ⅶ期：細胞內(nèi)沒有顆粒，菌絲體自溶。Ⅰ—Ⅳ期：菌絲生長期，Ⅲ期適宜做發(fā)酵種子；Ⅳ—Ⅴ期：青霉素分泌期；Ⅵ期到來之前結束發(fā)酵現(xiàn)在是23頁\一共有88頁\編輯于星期一種子制備階段以生產(chǎn)豐富的孢子（斜面和米孢子培養(yǎng)）或大量健壯的菌絲體(種子罐培養(yǎng))為目的所以，要在培養(yǎng)基中加入豐富的、容易代謝的碳源（如葡萄糖或蔗糖）、氮源（如玉米漿）、緩沖pH的碳酸鈣以及生長所必需的無機鹽，并保持最適生長溫度（25~26℃）和充分通氣、攪拌。種子制備的培養(yǎng)條件及原材料質(zhì)量均應嚴格控制以保持種子質(zhì)量的穩(wěn)定性?，F(xiàn)在是24頁\一共有88頁\編輯于星期一27.3.2培養(yǎng)基：

碳源：乳糖、蔗糖、葡萄糖等；淀粉水解糖。通常采用葡萄糖和乳糖。發(fā)酵初期，利用葡萄糖使菌絲快速生長；當葡萄糖耗竭后，利用乳糖，分泌青霉素。氮源：玉米漿、花生餅、棉籽餅、麩皮粉，氯化銨、硫酸銨、硝酸銨。前體：苯乙酸或苯乙酰胺；多次流加，每次﹤0.1％無機鹽：S、P、Ga、Mg、K等。

鐵離子有害，控制在﹤30μg/ml?，F(xiàn)在是25頁\一共有88頁\編輯于星期一27.3.3發(fā)酵工藝過程（1）生產(chǎn)孢子的制備保藏的孢子→活化（25~26℃，6~8d）→獲得單菌落（25~26℃，7d）→獲得斜面孢子→制得小米或大米孢子（優(yōu)質(zhì)小米或大米固體培養(yǎng)基25℃，7d）每批孢子必須進行嚴格搖瓶試驗，測定效價及雜菌情況.現(xiàn)在是26頁\一共有88頁\編輯于星期一（2）種子罐和發(fā)酵罐培養(yǎng)工藝

青霉素生產(chǎn)采用三級發(fā)酵。一級種子培養(yǎng)：接種小米孢子→萌發(fā)形成菌絲。培養(yǎng)基成分為葡萄糖、蔗糖、乳糖、玉米漿、碳酸鈣、玉米油、消沫劑等。通無菌空氣，空氣流量1:3(V/V)，300~350r/min;培養(yǎng)時間40~50h;pH自然，溫度,27℃±1℃。二級種子培養(yǎng)：菌絲體大量繁殖。培養(yǎng)基成分為玉米漿、葡萄糖等。通無菌空氣，空氣流量1:(1~1.5)(V/V)，250~280r/min、pH自然，25℃±1℃，培養(yǎng)時間10~14h?，F(xiàn)在是27頁\一共有88頁\編輯于星期一三級發(fā)酵培養(yǎng):培養(yǎng)基為花生餅粉(高溫)、麩皮、玉米漿、葡萄糖、尿素、硫酸銨、硫酸鈉、硫代硫酸鈉、磷酸二氫鈉、苯乙酰胺、碳酸鈣及消泡劑等。接種量為12%~15%。青霉素的發(fā)酵對溶氧要求極高，通氣量偏大，通氣比控制1:(0.7~1.8)(V/V)，150~200r/min;100m3的發(fā)酵罐攪拌功率為200~300kW,罐壓控制0.04~0.05MPa,25~26℃下培養(yǎng)。前60h,pH5.7~6.3，溫度26℃，以后pH6.3~6.6;溫度24℃，發(fā)酵周期為200h左右?，F(xiàn)在是28頁\一共有88頁\編輯于星期一27.3.4發(fā)酵條件控制補糖：殘?zhí)墙抵?.6％、pH上升時開始加糖；補氮：發(fā)酵液氨態(tài)氮0.01~0.05％，補硫銨、氨水或尿素補前體：發(fā)酵液中殘存乙酰胺0.05~0.08%；pH控制：前期pH5.7~6.3，中后期6.3~6.6,通過進行調(diào)節(jié)通過加糖、加酸、加堿補加氨水調(diào)節(jié)；現(xiàn)在是29頁\一共有88頁\編輯于星期一溫度控制：前期，25~26℃；后期，23℃；通風比：1:0.8vvm(單位培養(yǎng)液體積在單位時間內(nèi)通入的空氣量)溶氧：發(fā)酵液中的溶氧≥氧飽和溶解度的30％；消沫劑：添加玉米油、豆油或化學消沫劑”泡敵”，少量多次。現(xiàn)在是30頁\一共有88頁\編輯于星期一27.3.5青霉素的分離純化（1）預處理：濃縮目的產(chǎn)物，去除大部分雜質(zhì)，改變發(fā)酵液的流變學特征，利于后續(xù)的分離純化過程。（2）過濾：加入絮凝劑→轉鼓式真空：吸濾、洗滌、吸洗液、刮除濾餅。除掉菌絲體及部分蛋白質(zhì)。現(xiàn)在是31頁\一共有88頁\編輯于星期一（3）萃?。喝苊捷腿》?，二級逆流工藝或二級順流工藝；青霉素游離酸易溶于有機溶劑，而青霉素鹽易溶于水。工業(yè)上通常用乙酸丁酯和戊酯，萃取2~3次，濃縮10倍，濃度幾乎達到結晶要求。

（4）脫色：加活性碳150-200g/10億單位；現(xiàn)在是32頁\一共有88頁\編輯于星期一（5）精制：乙酸丁酯萃取液用0.5mol/L氫氧化鈉萃取→調(diào)pH6.4~6.8→得青霉素鈉鹽濃縮液（5萬單位/ml）→加3~4倍體積的丁醇，16~26℃,5~110mmHg下真空蒸餾，將水、丁醇共沸物蒸發(fā)出去→濃縮到青霉素鈉鹽濃縮液的體積、蒸出餾分中含水量為2~4%時，停止蒸餾→青霉素鈉鹽結晶析出→過濾→洗滌得到成品（6）溶媒回收：各種有機溶劑回收，以降低成本、減少環(huán)境污染現(xiàn)在是33頁\一共有88頁\編輯于星期一第28章氨基酸生產(chǎn)工藝28.1概述氨基酸是蛋白質(zhì)的基本結構單位，在自然界已發(fā)現(xiàn)組成各種蛋白質(zhì)的氨基酸有二十多種，其中蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸及色氨酸八種氨基酸是人類本身不能合成的必需氨基酸，只能從食物中攝取。氨基酸在食品、醫(yī)藥、飼料、化工、農(nóng)業(yè)、化妝品等領域廣泛應用。現(xiàn)在是34頁\一共有88頁\編輯于星期一氨基酸的生產(chǎn)方法主要有抽提法、化學合成法、微生物發(fā)酵法和酶法四種。到目前為止，60％以上的氨基酸采用微生物發(fā)酵法進行生產(chǎn)，其中產(chǎn)量最大的是谷氨酸，其次是賴氨酸。現(xiàn)在是35頁\一共有88頁\編輯于星期一氨基酸的生產(chǎn)方法抽提法：將蛋白質(zhì)原料進行水解，然后從水解液中抽提氨基酸，是生產(chǎn)氨基酸最早采用的方法。水解方法有酸法水解、堿法水解和酶法水解。目前胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸仍用抽提法生產(chǎn)?；瘜W合成法：用化學合成的方法制造氨基酸。目前用化學合成法制造的氨基酸有DL-蛋氨酸、DL-丙氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸?，F(xiàn)在是36頁\一共有88頁\編輯于星期一微生物發(fā)酵法：是目前氨基酸生產(chǎn)最常用的方法。根據(jù)微生物本身具有合成氨基酸的能力的特點，通過菌株的篩選、誘變處理及代謝調(diào)節(jié)來達到合成某種氨基酸的目的。發(fā)酵法分為直接發(fā)酵法和添加前體發(fā)酵法。酶法：利用微生物細胞或微生物產(chǎn)生的酶進行生物催化反應制造氨基酸的方法。賴氨酸、色氨酸、天門冬氨酸、酪氨酸、丙氨酸等均可用酶法生產(chǎn)。采用固定化酶或細胞連續(xù)生產(chǎn)，其優(yōu)點更突出?，F(xiàn)在是37頁\一共有88頁\編輯于星期一28.2氨基酸發(fā)酵工藝控制28.2.1菌種：氨基酸發(fā)酵的菌種主要有谷氨酸棒狀桿菌、黃色短桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌、短芽孢桿菌、黏質(zhì)賽氏桿菌等。下頁為一些氨基酸生產(chǎn)菌種及用途。28.2.2培養(yǎng)基培養(yǎng)基一般都包括碳源、氮源、無機鹽、生長因子、水等成分。發(fā)酵培養(yǎng)基的成分與配比是決定氨基酸產(chǎn)生菌生長、代謝的主要因素，與氨基酸的產(chǎn)率、轉化率及收率的關系密切。現(xiàn)在是38頁\一共有88頁\編輯于星期一一些氨基酸的生產(chǎn)菌種及用途氨基酸生產(chǎn)菌種用途谷氨酸棒桿菌Asl.299、棒桿菌7338、鈍齒棒桿菌Asl.542、棒桿菌Dll0、棒桿菌S-914、黃色短桿菌T6-13、黃色短桿菌FM84-415等主要用作制造味精，也用于預防或治療肝昏迷，對于腦震蕩和腦神經(jīng)損傷也有一定的療效L-賴氨酸谷氨酸棒狀桿菌、黃色短桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌、短芽孢桿菌、黏質(zhì)賽氏桿菌它是人類和動物發(fā)育必需的氨基酸，飼料添加劑，食品保鮮劑，制備復方氨基酸輸液等藥物L-谷氨酰胺谷氨酸棒狀桿菌、黃色短桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌、嗜氨小桿菌等治療胃潰瘍和十二指腸潰瘍等L-脯氨酸谷氨酸棒狀桿菌、黃色短桿菌、粘質(zhì)賽氏桿菌配制氨基酸輸液，合成抗高血壓藥物和治療帕金森氏癥的多肽類藥物，食品工業(yè)的甜味劑L-精氨酸粘質(zhì)沙雷氏桿菌、鈍齒棒桿菌等合成蛋白質(zhì)和肌酸的重要原料L-天門冬氨酸黃色短桿菌、大腸桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等生產(chǎn)甜味肽的主要原料L-蘇氨酸大腸桿菌、谷氨酸棒狀桿菌、黃色短桿菌、黏質(zhì)賽氏桿菌等的基因工程菌飼料添加劑，氨基酸營養(yǎng)液原料L-蛋氨酸主要為酶法，發(fā)酵法尚在研究中有抗脂肪肝和解毒作用，藥物或食品強化劑，飼料添加劑L-色氨酸枯草桿菌、黃桿菌、枯草桿菌、基因工程菌等食品強化劑，飼料添加劑L-苯丙氨酸大腸桿菌、谷氨酸棒狀桿菌、黃色短桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌等的變異株生產(chǎn)甜味肽L-酪氨酸產(chǎn)氣克雷氏菌的重組株、草剩歐文氏菌合成L-多巴等L-絲氨酸嗜甘氨酸棒狀桿菌、基因工程菌食品、藥品、化妝品的添加劑L-半胱氨酸球形芽孢桿菌食品、藥品、化妝品的添加劑L-纈氨酸乙酸鈣不動桿菌等藥物，食品強化劑L-亮氨酸谷氨酸棒狀桿菌、黃色短桿菌配制復合氨基酸輸液L-組氨酸基因工程菌生化試劑、藥物現(xiàn)在是39頁\一共有88頁\編輯于星期一（1）碳源氨基酸發(fā)酵中可采用淀粉水解糖、糖蜜、醋酸、乙醇、烷烴等多種碳源。根據(jù)微生物菌種的性質(zhì)、氨基酸種類和發(fā)酵工藝方法，選擇碳源種類和濃度。最常采用的是淀粉水解糖液或糖蜜。（2）氮源

氨基酸發(fā)酵培養(yǎng)基常選用銨鹽、尿素、氨水等為無機氮源。幾乎所有的氨基酸產(chǎn)生菌都是生物素缺陷型，同時也是一些氨基酸的營養(yǎng)缺陷型，而且大多數(shù)氨基酸產(chǎn)生菌都不能分泌胞外水解蛋白酶。因此需要添加適量的有機氮源如玉米槳及精制棉籽餅、麩皮、豆餅等蛋白質(zhì)原料的水解液?，F(xiàn)在是40頁\一共有88頁\編輯于星期一（3）碳氮比

氨基酸發(fā)酵時，不僅菌體生長和氨基酸合成需要氮源，而且氮源還用來調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值。例如谷氨酸發(fā)酵的碳氮比為100:(15~21)，當碳氮比為100:11時才開始積累谷氨酸，因此發(fā)酵培養(yǎng)基氮源的需要量比一般發(fā)酵多。谷氨酸發(fā)酵消耗的氮源中，合成菌體用的氮源占總氮的3~6％，合成谷氨酸的氮源占30~80％。實際生產(chǎn)中，以尿素或氨水為氮源時，除了一部分用于調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值外，還有一部分隨空氣逸出，為此氮源的用量更大。現(xiàn)在是41頁\一共有88頁\編輯于星期一谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中當糖濃度為12.5％、總尿素量為3％時，碳氮比為100:28。氮源的用量對氨基酸生物合成產(chǎn)生顯著的影響，如谷氨酸發(fā)酵中，適量的NH4+可減少α-酮戊二酸的積累，促進谷氨酸的合成；過量的NH4+會使生成的谷氨酸轉化為谷氨酰胺。（4）無機鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中通常需要加入硫、磷、鈣、鎂、鉀等無機鹽類。磷酸鹽濃度對于氨基酸發(fā)酵的影響極為顯著。而鎂、鉀等離子是許多酶的激活劑，對菌體的生長和氨基酸的積累有重要的作用?，F(xiàn)在是42頁\一共有88頁\編輯于星期一（5）生長因子

生物素是氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)中重要的生長因子。影響細胞膜的通透性和代謝途徑，它的濃度與微生物菌體的生長和氨基酸的合成關系密切。以淀粉水解糖為原料進行谷氨酸發(fā)酵時，必須控制生物素的濃度為亞適量，以2~5μg/L為宜（實際上是控制玉米漿的濃度），保證菌體細胞膜的通透性良好，谷氨酸才能大量分泌。現(xiàn)在是43頁\一共有88頁\編輯于星期一在天門冬氨酸族氨基酸（如賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸等）的發(fā)酵中期望菌體細胞膜完整，要求控制生物素過量，如賴氨酸發(fā)酵中添加過量的生物素（200~500μg/L），賴氨酸合成顯著增加。氨基酸發(fā)酵一般以玉米漿、麩皮水解液、甘蔗糖蜜或甜菜糖蜜作為生物素的來源?，F(xiàn)在是44頁\一共有88頁\編輯于星期一28.2.3發(fā)酵條件控制（1）pH值對氨基酸發(fā)酵的影響及控制

pH值影響酶的活性和菌的代謝；谷氨酸發(fā)酵中，在中性和微堿性條件下（pH7.0~8.0）積累谷氨酸，在酸性條件下（pH5.0~5.8），則易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺。發(fā)酵前期pH值偏高對菌體生長不利，糖耗慢、發(fā)酵周期延長；反之，pH值偏低則菌體生長旺盛，糖耗快，不利于谷氨酸合成。現(xiàn)在是45頁\一共有88頁\編輯于星期一但發(fā)酵前期pH值偏高（pH7.5~8.0）對抑制雜菌有利，故控制發(fā)酵前期的pH值以7.5左右為宜。由于谷氨酸脫氫酶的最適pH值為7.0~7.2，氨基轉移酶的最適pH值為7.2~7.4，因此控制發(fā)酵中后期的pH值為7.2左右?，F(xiàn)在是46頁\一共有88頁\編輯于星期一生產(chǎn)上控制pH值的方法一般有兩種，流加尿素和流加氨水（少量多次，可使pH值較穩(wěn)定）。流加尿素的數(shù)量和時間主要根據(jù)pH值變化、菌體生長、糖耗情況和發(fā)酵時期等因素來決定。如當菌體生長和糖耗均緩慢時，要少量多次地流加尿素、避免pH值過高而影響菌體生長；菌體生長和糖耗均較快時，流加尿素可多些，使pH值適當高些，以抑制生長；發(fā)酵后期殘?zhí)呛苌伲咏殴迺r應盡量少加或不加尿素，以免造成浪費和增加氨基酸提取難度。不同的氨基酸發(fā)酵對pH的要求見下頁表現(xiàn)在是47頁\一共有88頁\編輯于星期一不同氨基酸發(fā)酵的最適pH和溶解氧分壓氨基酸最適pH溶解氧分壓（105Pa）谷氨酰胺6.50≥0.01脯氨酸7.00≥0.01精氨酸7.00≥0.01谷氨酸7.80≥0.01賴氨酸7.00≥0.01蘇氨酸7.00≥0.01異亮氨酸7.00≥0.01亮氨酸6.25≈0纈氨酸6.50≈0苯丙氨酸7.25≈0現(xiàn)在是48頁\一共有88頁\編輯于星期一（2）溫度對氨基酸發(fā)酵的影響及控制氨基酸發(fā)酵的最適溫度因菌種和所生產(chǎn)的氨基酸種類不同而異。氨基酸發(fā)酵一般屬于Gaden分類的Ⅱ型即生長部分偶聯(lián)型發(fā)酵，菌體生長到一定程度后再開始產(chǎn)生氨基酸。菌體生長最適溫度和氨基酸合成的最適溫度是不同的?，F(xiàn)在是49頁\一共有88頁\編輯于星期一如谷氨酸發(fā)酵，菌體生長最適溫度為30~32℃，谷氨酸合成的最適溫度為34~37℃。如果菌體生長階段溫度過高，則菌體易衰老；在發(fā)酵中后期，菌體生長已基本停止，需要維持最適的產(chǎn)酸溫度，以利谷氨酸的合成?，F(xiàn)在是50頁\一共有88頁\編輯于星期一（3）溶氧對氨基酸發(fā)酵的影響及控制不同的氨基酸發(fā)酵對溶氧的要求不同多數(shù)氨基酸發(fā)酵是在供氧充足的條件下進行的，如谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸等；也有一些氨基酸的發(fā)酵過程需要限制供氧，如亮氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸等發(fā)酵適宜在缺氧條件下進行，只有當菌體呼吸在一定程度上受阻時才最適合這些氨基酸的生產(chǎn)；現(xiàn)在是51頁\一共有88頁\編輯于星期一而賴氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸等的發(fā)酵需氧量介于上述兩者之間。發(fā)酵的不同階段氧分壓的要求也是不同的，因此在發(fā)酵過程中應根據(jù)具體情況對供氧進行控制。（4）泡沫的控制發(fā)酵過程中通常產(chǎn)生大量的泡沫，可采用豆油、玉米油等天然油脂或環(huán)氧丙烯、環(huán)氧乙烯、聚醚類等化學消泡劑進行消泡。并控制消泡劑的用量和加入的時間與方法，否則影響菌體的代謝和產(chǎn)物的提取。現(xiàn)在是52頁\一共有88頁\編輯于星期一28.3氨基酸分離純化氨基酸的分離和純化又稱為氨基酸發(fā)酵液的后處理或下游工程（downstreamprocessing），是氨基酸工業(yè)生產(chǎn)中的一個重要組成部分。發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸的發(fā)酵液是極其復雜的多相體系，含有微生物菌體細胞、代謝產(chǎn)物、未消耗盡的培養(yǎng)基等，因此要提取高純度的氨基酸?，F(xiàn)在是53頁\一共有88頁\編輯于星期一氨基酸的分離純化：對氨基酸發(fā)酵液進行預處理→菌體分離→初步純化→高度純化等步驟。前三步驟稱為分離（或提?。禾幚淼捏w積較大，著重于分離和濃縮；高度純化稱為純化（或精制）：精細的分離操作，著重于純化?，F(xiàn)在是54頁\一共有88頁\編輯于星期一菌體分離(離心分離、過濾、壓濾、超濾等)預處理（加熱、調(diào)pH、絮凝等）發(fā)酵液初步純化（沉淀、吸附、離子交換、萃取等）高度純化(超濾、吸附、結晶、重結晶等)成品加工氨基酸的分離純化工藝流程現(xiàn)在是55頁\一共有88頁\編輯于星期一28.4賴氨酸生產(chǎn)工藝賴氨酸是人體必需的8種氨基酸之一，人和高等動物體內(nèi)不能合成。自1960年日本用谷氨酸棒狀桿菌的高絲氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株發(fā)酵生產(chǎn)賴氨酸獲得成功后，微生物發(fā)酵法成為生產(chǎn)賴氨酸的主要方法。賴氨酸有L型和D型２種構型。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的均為L型?，F(xiàn)在是56頁\一共有88頁\編輯于星期一28.4.1賴氨酸的生產(chǎn)菌種與生物合成途徑（1）細菌：如短桿菌屬（黃色短桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌）和棒狀桿菌屬（谷氨酸棒狀桿菌）。它們多以谷氨酸生產(chǎn)菌為出發(fā)菌株，通過人工誘變獲得各種突變株（高絲氨酸營養(yǎng)缺陷型兼AEC抗性突變株）。（2）酵母菌：如產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母。酵母菌賴氨酸的生物合成產(chǎn)率要低于細菌的，目前賴氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)都是以細菌為生產(chǎn)菌種?，F(xiàn)在是57頁\一共有88頁\編輯于星期一賴氨酸合成途徑（1）二氨基庚二酸途徑：存在于細菌、綠藻、原生動物和高等植物中；P329圖28-2（2）α-氨基己二酸途徑：存在于酵母、霉菌中。P329圖28-3現(xiàn)在是58頁\一共有88頁\編輯于星期一28.4.2賴氨酸的發(fā)酵條件控制賴氨酸生產(chǎn)菌多以谷氨酸生產(chǎn)菌為出發(fā)菌株，通過選育高絲氨酸營養(yǎng)缺陷型、抗賴氨酸結構類似物(AECr)、抗蘇氨酸結構類似物(AHVr)的突變株，以解除自身的代謝調(diào)節(jié)來實現(xiàn)的。賴氨酸發(fā)酵是典型的代謝控制發(fā)酵?？刂婆囵B(yǎng)物中的生物素、L-氨酸和L-甲硫氨酸的含量、溫度、pH、溶解氧（通風量、攪拌速度）等條件，賴氨酸大量積累?，F(xiàn)在是59頁\一共有88頁\編輯于星期一賴氨酸發(fā)酵時間以16~20h為界，分為前、后兩個時期。前期（生長期）：菌體增殖迅速，有少量賴氨酸生成，糖和氮的消耗主要是用于合成細胞物質(zhì)及供給菌體的能量代謝；后期（賴氨酸合成期），菌體生長速度明顯減慢，L-賴氨酸大量積累，糖和氮消耗主要用于L-賴氨酸的合成。兩個階段在工藝控制上是不同的。現(xiàn)在是60頁\一共有88頁\編輯于星期一（1）溫度對賴氨酸發(fā)酵的影響及控制在低于20℃時，氨基酸合成途徑的終產(chǎn)物對第一步反應的酶的反饋抑制作用比在正常生長溫度下更大。發(fā)酵前期，溫度控制在30~32℃，如果溫度過高，菌體容易衰老，發(fā)酵液的OD值增長緩慢、耗糖慢，發(fā)酵周期延長，賴氨酸產(chǎn)量減少。發(fā)酵中、后期產(chǎn)酸階段，溫度可提高至賴氨酸生物合成酶系的最適作用溫度32~34℃。根據(jù)菌種，發(fā)酵過程可采用二級或三級溫度管理現(xiàn)在是61頁\一共有88頁\編輯于星期一（2）pH對賴氨酸發(fā)酵的影響及控制pH對微生物的生長繁殖和代謝產(chǎn)物形成的影響賴氨酸發(fā)酵的最適pH為6.5~7.0，一般控制在6.5~7.5，在發(fā)酵過程控制pH平穩(wěn)。賴氨酸發(fā)酵過程中，發(fā)酵液的pH下降，可以通過流加氨水或尿素來控制，也可加入CaCO3來維持。現(xiàn)在是62頁\一共有88頁\編輯于星期一賴氨酸發(fā)酵中，流加尿素容易調(diào)節(jié)pH，初始尿素濃度一般為0.5％~0.6％。接種2~3h后，菌體內(nèi)脲酶分解尿素釋放氨使pH上升；隨著菌體的生長，培養(yǎng)液中氨與碳源被利用，生成有機酸等中間代謝產(chǎn)物而使pH下降。當培養(yǎng)至14~18h,pH降至6.2~6.4時開始流加尿素，流加量為,0.2％~0.3％。發(fā)酵整個過程中共流加3~5次尿素，總量為,1.5％~2.5％。產(chǎn)酸旺盛期流加量大些；發(fā)酵后期殘?zhí)橇康蜁r少量流加。當殘?zhí)橇康陀?％時就不必流加尿素?，F(xiàn)在是63頁\一共有88頁\編輯于星期一（3）供氧對賴氨酸發(fā)酵的影響及控制只有在供氧充足的條件下,才大量生成賴氨酸。供氧不足時影響菌體的生長，使賴氨酸產(chǎn)量降低；嚴重供氧不足，賴氨酸產(chǎn)量很少而積累乳酸。菌體生長階段,對氧的需求量大于產(chǎn)酸階段，溶氧分壓一般控制在0.4×104~0.8×104Pa。若此時通氣和攪拌強度低，氧供給不足，乳酸生成量增加，造成培養(yǎng)基pH低，菌體生長緩慢，菌體量減少。即使在產(chǎn)酸階段增大通氣量，也無法彌補對賴氨酸產(chǎn)量的影響。通氣攪拌強度過高，會造成pH高，耗糖快,同樣也會出現(xiàn)菌體生長緩慢的現(xiàn)象，降低賴氨酸的產(chǎn)量。當菌體生長進入穩(wěn)定期以后，溶氧分壓控制在0.2×104~0.4×104Pa，直至發(fā)酵結束?，F(xiàn)在是64頁\一共有88頁\編輯于星期一（4）生物素對賴氨酸發(fā)酵的影響生產(chǎn)菌：谷氨酸產(chǎn)生菌的各種突變株，均為生物素缺陷型。發(fā)酵培養(yǎng)基中需要生物素作為生長因子。以葡萄糖、丙酮酸為唯一碳源時，添加過量生物素(200~500μg/L)可使賴氨酸的積累顯著增加。過量生物素使細胞內(nèi)合成的谷氨酸對谷氨酸脫氫酶的反饋抑制作用增強，抑制谷氨酸的大量生成，使代謝流向合成天冬氨酸的方向進行。因此生物素有促進草酰乙酸生成,增加天冬氨酸供給，提高賴氨酸產(chǎn)量的作用?，F(xiàn)在是65頁\一共有88頁\編輯于星期一（5）蘇氨酸、蛋氨酸對賴氨酸影響及控制蘇氨酸和蛋氨酸是賴氨酸生產(chǎn)菌的生長因子。賴氨酸生產(chǎn)菌缺乏蛋白質(zhì)分解酶。不能直接分解蛋白質(zhì)，只能將有機氮源水解后才能利用。大豆餅粉、花生餅粉和毛發(fā)水解液通常作為賴氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基。如果培養(yǎng)基中的蘇氨酸和蛋氨酸豐富，就會出現(xiàn)只長菌，而不產(chǎn)或少產(chǎn)賴氨酸的現(xiàn)象，所以要控制其亞適量，當菌體生長到一定時間后，轉入產(chǎn)酸期。現(xiàn)在是66頁\一共有88頁\編輯于星期一（6）前體、產(chǎn)物促進劑對賴氨酸發(fā)酵的影響在賴氨酸發(fā)酵過程中，添加某些物質(zhì)可以提高賴氨酸的產(chǎn)量。如谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵糖蜜生產(chǎn)賴氨酸時，添加與不添加胱氨酸發(fā)酵液，賴氨酸的產(chǎn)量分別為55g/L、40g/L?，F(xiàn)在是67頁\一共有88頁\編輯于星期一現(xiàn)在是68頁\一共有88頁\編輯于星期一28.5谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝谷氨酸是一種重要的氨基酸。味精——谷氨酸單鈉谷氨酸還可以制成對皮膚無刺激性的洗滌劑——十二烷基谷氨酸鈉肥皂、能保持皮膚濕潤的潤膚劑——焦谷氨酸鈉、質(zhì)量接近天然皮革的聚谷氨酸人造革，以及人造纖維和涂料等。谷氨酸是目前氨基酸生產(chǎn)中產(chǎn)量最大的一種，谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝也是氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)中最典型和最成熟的?，F(xiàn)在是69頁\一共有88頁\編輯于星期一谷氨酸的生物合成途徑包括糖酵解作用（EMP途徑）戊糖磷酸途徑（HMP途徑）三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）乙醛酸循環(huán)(DCA途徑)丙酮酸羧化支路（CO2固定）現(xiàn)在是70頁\一共有88頁\編輯于星期一現(xiàn)在是71頁\一共有88頁\編輯于星期一28.5.1谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的原料谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)以淀粉水解糖為原料。淀粉水解糖的制備一般有酸水解法和酶水解法。水解糖液要求①糖液中還原糖的含量要達到發(fā)酵用糖的標準。②糖液潔凈、杏黃色或黃綠色，有一定的透光度。③糖液中不含糊精。④糖液不能變質(zhì)?，F(xiàn)在是72頁\一共有88頁\編輯于星期一28.5.2谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的菌種主要有棒狀桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬及節(jié)桿菌屬的細菌。除節(jié)桿菌外，其他三屬中有許多菌種適用于糖質(zhì)原料的谷氨酸發(fā)酵。這些細菌都是需氧微生物，都需要以生物素為生長因子。我國所用菌種：北京棒狀桿菌ASl.299、鈍齒棒狀桿菌ASl.542、HU7251及7338、B9等。在正常情況下谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)酸率可達4%~6%，谷氨酸對糖的轉化率為40%~50%?，F(xiàn)在是73頁\一共有88頁\編輯于星期一菌種擴大培養(yǎng)（1）斜面培養(yǎng)：一般采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，pH7.0～7.2，32℃培養(yǎng)18～24h，冰箱保存。（2）一級種子培養(yǎng)：采用液體培養(yǎng)基，由葡萄糖、玉米漿、尿素、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鐵及硫酸錳等組成，pH為6.5～6.8，在三角瓶內(nèi)32℃振蕩培養(yǎng)12h，貯存于4℃冰箱。現(xiàn)在是74頁\一共有88頁\編輯于星期一（3）二級種子培養(yǎng)：培養(yǎng)基除用水解糖代替葡萄糖外，其他與一級種子培養(yǎng)基相仿。在種子罐內(nèi)32℃通氣攪拌培養(yǎng)7～10h，即可移種或冷卻至10℃?zhèn)溆谩，F(xiàn)在是75頁\一共有88頁\編輯于星期一種子的質(zhì)量要求

鏡檢：菌體健壯，排列整齊，大小均一，呈單個或八字形排列。染色性：革蘭氏陽性。二級種子的活菌濃度要求達到108~109個/ml。種子活力旺盛平板檢查：菌落淡黃色，中間隆起，表面濕潤，有光澤，邊緣整齊，呈半透明狀。小搖瓶發(fā)酵試驗，產(chǎn)酸穩(wěn)定并在高峰。現(xiàn)在是76頁\一共有88頁\編輯于星期一28.5.3谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵初期：菌體生長遲滯，約2～4h后進入對數(shù)生長期，代謝旺盛，糖耗快，這時必須流加尿素以供給氮源并調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH至7.5～8.0，溫度為30～32℃。此階段主要是菌體生長，幾乎不產(chǎn)酸，菌體內(nèi)生物素含量由豐富轉為貧乏，時間約12h?，F(xiàn)在是77頁\一共有88頁\編輯于星期一發(fā)酵中期：進入谷氨酸合成階段，此時菌體濃度基本不變，糖與尿素分解后產(chǎn)生的。ａ-酮戊二酸和氨主要用來合成谷氨酸。這一階段應及時流加尿素提供氨以維持谷氨酸合成的最適pH7.2～7.4，需要大量通氣，并將溫度提高到谷氨酸合成的最適溫度34～37℃。發(fā)酵后期：菌體衰老，糖耗慢，殘?zhí)堑?，需減少流加尿素量。當營養(yǎng)物質(zhì)耗盡、谷氨酸濃度不再增加時，及時放罐。發(fā)酵周期約為30h。現(xiàn)在是78頁\一共有88頁\編輯于星期一28.5.4谷氨酸發(fā)酵條件的控制溫度：生長30~32℃；產(chǎn)酸34~37℃pH值：發(fā)酵前期pH7.5左右；發(fā)酵中、后期pH7.2左右菌齡及接種量：接種對數(shù)期生長的種子；接種量一般為１％。通風量與攪拌速度：菌體生長期小通風、谷氨酸產(chǎn)生期加大通氣量；磷酸鹽：濃度不能太高，否則向纈氨酸發(fā)酵現(xiàn)在是79頁\一共有88頁\編輯于星期一谷氨基酸發(fā)酵的代謝控制環(huán)境因子發(fā)酵產(chǎn)物轉換溶解氧

乳酸或琥珀酸←→谷氨酸←→α－酮戊二酸

（通氣不足）（適量）（通氣過量，轉速過快）氨離子α－酮戊二酸←→谷氨酸←→谷氨酰胺

（缺乏）（適量）（過量）pH

谷氨酰胺，N－乙酰谷酰胺←→谷氨酸（pH值5～8，氨離子過多）（中性或微堿性）磷酸

纈氨