流式細(xì)胞術(shù)原理及應(yīng)用新

流式細(xì)胞術(shù)原理及應(yīng)用新第1頁/共81頁流式細(xì)胞術(shù)的原理及其應(yīng)用

第2頁/共81頁第3頁/共81頁FLOWCYTOMETRY

流式細(xì)胞術(shù)FLOWCYTOMETOR流式細(xì)胞儀第4頁/共81頁FlowCytometryMeasuringpropertiesofcellsinflowFlowSortingSorting(separating)cellsbasedonpropertiesmeasuredinflowAlsocalledFluorescence-ActivatedCellSorting(FACS)第5頁/共81頁分為三大類：第一類－－臺(tái)式機(jī)

光路調(diào)節(jié)系統(tǒng)固定，自動(dòng)化程度高，操作簡(jiǎn)便，易學(xué)易掌握,適合用于臨床第二類－－大型機(jī)

科研型，分辨率高，可分選用于培養(yǎng)，可選配多種激光器，更靈活第三類－－新型流式細(xì)胞儀

裝配有2～4根激光管，同時(shí)檢測(cè)15個(gè)參數(shù)，高速分選達(dá)50000個(gè)/s第6頁/共81頁第7頁/共81頁第8頁/共81頁第9頁/共81頁第10頁/共81頁流式細(xì)胞儀的主要組成部分：光路系統(tǒng)鞘液系統(tǒng)信號(hào)轉(zhuǎn)換及放大系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第11頁/共81頁流式細(xì)胞術(shù)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種技術(shù)，有人將流式細(xì)胞儀比喻成高級(jí)的熒光顯微鏡。目前，該技術(shù)以廣泛用于生物及醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究與臨床檢測(cè)，在分子生物學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)等領(lǐng)域內(nèi)發(fā)揮著重要作用。第12頁/共81頁

流式細(xì)胞儀熒光顯微鏡控制電腦人腦光源激光紫外光標(biāo)本制備成的單細(xì)胞（或顆粒）懸液放于固定的標(biāo)本臺(tái)上效率高幾百~幾萬個(gè)細(xì)胞/秒低幾十個(gè)細(xì)胞/分結(jié)果精確、客觀有主觀因素功能可同時(shí)測(cè)多個(gè)參數(shù)、能進(jìn)行分選一般只測(cè)一個(gè)參數(shù)、不能分選第13頁/共81頁鞘液系統(tǒng)流動(dòng)室第14頁/共81頁第15頁/共81頁光路系統(tǒng)檢測(cè)區(qū)第16頁/共81頁第17頁/共81頁第18頁/共81頁第19頁/共81頁第20頁/共81頁第21頁/共81頁光學(xué)原理laser第22頁/共81頁第23頁/共81頁第24頁/共81頁第25頁/共81頁抗體標(biāo)記的方法第26頁/共81頁抗體的選擇首選直接標(biāo)記抗體熒光分子

PE最強(qiáng)，適用于弱表達(dá)抗原

FITC最便宜，適用于強(qiáng)表達(dá)抗原間接標(biāo)記

適用范圍廣,biotin-avidin不適合弱抗原的檢測(cè)第27頁/共81頁數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第28頁/共81頁流式細(xì)胞分析的信息Forwardscatter(FSC)Sidescatter(SSC)FL1-FITCFL2-PEFL3-PerCPPL4-APC第29頁/共81頁流式細(xì)胞的基本信息:“形態(tài)”第30頁/共81頁流式細(xì)胞的主要信息:FluorescenceFL1FL2FL3FL4最常用的標(biāo)記方法是熒光素分子標(biāo)記的抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合第31頁/共81頁Gating

常用術(shù)語第32頁/共81頁流式常見圖形

(Histogram

Plot)直方圖適用于：?jiǎn)螀?shù)分析第33頁/共81頁流式常見圖形

(DotPlot)散點(diǎn)圖適用于：多參數(shù)分析第34頁/共81頁流式應(yīng)用常見范圍細(xì)胞大小細(xì)胞的顆粒度細(xì)胞表面分子：CD系列細(xì)胞漿內(nèi)分子：胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞核內(nèi)分子：P53細(xì)胞功能檢測(cè)：細(xì)胞周期、凋亡其他（膜電位、鈣離子濃度、核酸等）第35頁/共81頁實(shí)驗(yàn)對(duì)照的設(shè)計(jì)空白對(duì)照：ALL陰性對(duì)照：常用同型抗體對(duì)照單色分析：設(shè)同型抗體對(duì)照多色分析：同型對(duì)照，單陽性對(duì)照

（用于儀器校正）陽性對(duì)照：檢測(cè)陰性時(shí)第36頁/共81頁實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的處理單細(xì)胞懸液的制備：

物理法（剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨粉）

化學(xué)法（酶消化）抗體或標(biāo)記分子的染色：抗原抗體反應(yīng)非特異結(jié)合的去除：洗滌和封閉

封閉－－血清和同型抗體第37頁/共81頁可用流式細(xì)胞儀分析的標(biāo)本外周血、骨髓、癌組織、癌旁組織、石蠟切片、各種體液（尿、腦脊液、胸腹水等）

必需制備成單細(xì)胞懸液?jiǎn)渭?xì)胞生物、特殊處理的植物細(xì)胞、某些非細(xì)胞粒子、可溶性分子第38頁/共81頁

待測(cè)標(biāo)本處理成單event懸液熒光素標(biāo)記的單抗染色鞘液經(jīng)處理的細(xì)胞單個(gè)通過激光聚焦區(qū)檢測(cè)散射光、熒光

信號(hào)轉(zhuǎn)化、放大

計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理分選第39頁/共81頁SORTING（細(xì)胞分選）分選速度分選純度分選收獲率第40頁/共81頁第41頁/共81頁流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用

細(xì)胞死亡分兩種：凋亡和壞死細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡不是一件被動(dòng)的過程，而是主動(dòng)過程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用；它并不是病理?xiàng)l件下，自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)爭(zhēng)取的一種死亡過程。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，就像樹葉或花的自然凋落一樣，借用希臘“Apoptosis”來表示，意思是像樹葉或花的自然凋落，可譯為細(xì)胞凋亡。

（一）凋亡的檢測(cè)第42頁/共81頁細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別

雖然凋亡與壞死的最終結(jié)果極為相似，但它們的過程與表現(xiàn)卻有很大差別。

壞死（necrosis）：壞死是細(xì)胞受到強(qiáng)烈理化或生物因素作用引起細(xì)胞無序變化的死亡過程。表現(xiàn)為細(xì)胞脹大，胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分，引起局部嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。

凋亡是細(xì)胞對(duì)環(huán)境的生理性、病理性刺激信號(hào)，環(huán)境條件的變化或緩和性損傷產(chǎn)生的應(yīng)答有序變化的死亡過程。其細(xì)胞及組織的變化與壞死有明顯的不同。

第43頁/共81頁細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義胚胎形成、肌體正常發(fā)育、衰老和損傷細(xì)胞的清除以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸等都與細(xì)胞凋亡有關(guān)。生物醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)第44頁/共81頁凋亡檢測(cè)

每一步都有檢測(cè)試劑盒每一步都有檢測(cè)試劑盒第45頁/共81頁1、半胱氨酸蛋白酶3檢測(cè)法（早早期）2、AnnexinV-FITC/PI法（早期）3、Apo2.7檢測(cè)法（早期）4、TUNEL法（晚期）5、DNA含量分析法（晚晚期）6、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡第46頁/共81頁

亞二倍體峰（凋亡峰）

---PIstaining

不能區(qū)分凋亡與死亡細(xì)胞第47頁/共81頁AnnexinVAssay

建議用于懸浮細(xì)胞第48頁/共81頁AnnexinVAssay

能夠區(qū)分死亡與凋亡

第49頁/共81頁第50頁/共81頁細(xì)胞周期G1MG2SQuiescentcellsG0第51頁/共81頁（二）定量流式細(xì)胞術(shù)（quantitativeflowcytomety)

通過檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)微球的熒光強(qiáng)度獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求得待測(cè)細(xì)胞的某種生物分子的精確數(shù)值，從而反映在某種生理病理?xiàng)l件下出現(xiàn)的微細(xì)變化，對(duì)臨床疾病的研究、診斷及治療等具有重要意義。第52頁/共81頁微球流式芯片技術(shù)

CBA(CytometricBeadArray)采用夾心法分析策略,以微珠來捕獲可溶性分子。第53頁/共81頁（三）流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用白血病免疫分型HLA-B27:強(qiáng)直性脊柱炎淋巴細(xì)胞亞群造血干細(xì)胞計(jì)數(shù)：造血干細(xì)胞移植網(wǎng)織紅細(xì)胞PNH診斷（CD55、CD59）血小板活化試驗(yàn)第54頁/共81頁流式細(xì)胞術(shù)與造血干細(xì)胞移植第55頁/共81頁流式細(xì)胞術(shù)與白血病免疫分型第56頁/共81頁流式細(xì)胞的免疫分型：是白血病分型的重要指標(biāo)，而白血病分類是選擇化療方案和判斷預(yù)后的重要依據(jù)。

FAB標(biāo)準(zhǔn)(MICM)，形態(tài)學(xué)、免疫表型染色體、分子生物學(xué)結(jié)合,適合于白血病的分型診斷，但不適合用于確診是不是白血病。Minimalresidualdiseases(MRD)第57頁/共81頁微小殘留病變的檢出（MRD）：

MRD是白血病復(fù)發(fā)的主要根源，F(xiàn)CM的高特異性和敏感性可以在患者緩解期檢測(cè)是否有殘留病變細(xì)胞，早期探測(cè)MRD，以免復(fù)發(fā)。第58頁/共81頁有證據(jù)表明外周血淋巴細(xì)胞HLA-B27的表達(dá)及其表達(dá)程度與強(qiáng)直性脊髓炎的發(fā)生有很大相關(guān)性，利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行HLA-B27檢測(cè)，可同時(shí)排除交叉反應(yīng)，是目前檢測(cè)HLA-B27的最好方法。流式細(xì)胞術(shù)與強(qiáng)直性脊柱炎第59頁/共81頁第60頁/共81頁淋巴細(xì)胞亞群分析

機(jī)體免疫狀態(tài)是衡量機(jī)體是否罹患疾病的重要指標(biāo)，目前多采用流式細(xì)胞術(shù)來檢測(cè)機(jī)體的免疫狀態(tài)，其中最重要的指標(biāo)是檢測(cè)T,B,NK淋巴細(xì)胞的水平。第61頁/共81頁常用細(xì)胞表型及意義（clusterofdifferentiation,CD)CD3總T細(xì)胞CD4T輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞亞群CD8T抑制/細(xì)胞毒細(xì)胞亞群CD19B細(xì)胞抗原CD16+56NK細(xì)胞CD33髓細(xì)胞前體CD34多能干細(xì)胞第62頁/共81頁由于T淋巴細(xì)胞在人體的免系統(tǒng)中承擔(dān)著重要功能，因此當(dāng)感染發(fā)生時(shí)，T淋巴細(xì)胞各亞群的變化往往能很敏感地反應(yīng)感染的狀態(tài)和程度。例如：CD4分子有HIV識(shí)別部位，因CD4細(xì)胞是HIV病毒的受體，AIDS患者CD4+T細(xì)胞明顯減少，該指標(biāo)是診斷AIDS的重要指標(biāo)。當(dāng)病毒感染發(fā)生時(shí)（如乙型肝炎、EB病毒和巨細(xì)胞病毒包涵體病毒），CD8+T細(xì)胞增多，對(duì)CD8T細(xì)胞測(cè)定有助于對(duì)感染的診斷、治療效果的動(dòng)態(tài)觀察。第63頁/共81頁利用流式細(xì)胞儀可對(duì)器官移植和骨髓移植后的患者進(jìn)行監(jiān)控。當(dāng)患者CD3+、CD25+持續(xù)增加提示已開始發(fā)生排異，CD4+/CD8+

T持續(xù)下降，表明有感染發(fā)生，當(dāng)其比值小于0.2時(shí)必需停用免疫抑制劑。

流式細(xì)胞術(shù)與移植第64頁/共81頁其它免疫性疾病分析

SLE患者的淋巴細(xì)胞變化可以反應(yīng)該病的活動(dòng)情況和器官侵犯程度，活動(dòng)或非活動(dòng)性伴有多系統(tǒng)疾病，但無腎臟損害的患者可出現(xiàn)CD4+CD8+T比值升高，伴有嚴(yán)重腎臟損害的SLE患者可出現(xiàn)低CD4+、高CD8+的現(xiàn)象。第65頁/共81頁流式細(xì)胞術(shù)與PNH利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿（PNH），根據(jù)血細(xì)胞的細(xì)胞膜所缺乏的糖化肌醇磷脂（GPI）所連接的蛋白，如DAF（CD55）與MIRI（CD59），來確診此病，比傳統(tǒng)的血清溶血試驗(yàn)具有更高的特異性與敏感性。第66頁/共81頁第67頁/共81頁第68頁/共81頁血小板：巨血小板血小板無力癥

網(wǎng)織血小板流式細(xì)胞術(shù)與血小板第69頁/共81頁血栓性疾與血栓前狀態(tài)：

由于活化血小板是血栓的主要成分之一，也是引起血栓形成的主要原因，所以血小板活化程度的增高與疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。第70頁/共81頁流式細(xì)胞術(shù)與網(wǎng)織紅細(xì)胞第71頁/共81頁

DNA非整倍體的出現(xiàn)可能是惡變細(xì)胞的重要標(biāo)志，F(xiàn)CM在腫瘤學(xué)上的應(yīng)用，主要是利用DNA含量測(cè)定，進(jìn)行癌前病變及早期癌變的檢出、化療指導(dǎo)以及預(yù)后評(píng)估等工作。

癌前病變的癌變率與病變的增生程度一致，而增生程度與DNA含量的異常改變又呈平行關(guān)系。

流式細(xì)胞術(shù)與腫瘤第72頁/共81頁

FCM通過精確定量DNA含量，能對(duì)癌前病變的性質(zhì)和發(fā)展趨勢(shì)作出判斷，有助于癌前病變的早期診斷。

DNA倍體分析有助于臨界性腫瘤的診斷，如卵巢交界性腫瘤，異倍體的出現(xiàn)與病變的惡性發(fā)展有關(guān)。第73頁/共81頁

DNA異倍體、高S期細(xì)胞比值和高增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）表達(dá)與細(xì)胞增殖能力、惡性程度和不良預(yù)后呈正相關(guān)。第74頁/共81頁為治療方案和藥理學(xué)研究提供依據(jù)：不同類型的腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性不同。可利用FCM進(jìn)行細(xì)胞周期分析，適當(dāng)選擇周期特異性藥物或非周期特異性藥物。