測序技術介紹

測序技術介紹第1頁/共72頁測序技術發(fā)展史第2頁/共72頁一代測序1954年，Whitfeld等用化學降解法測定多聚核糖核苷酸序列，是關于DNA測序技術的較早報道。1977年，Sanger發(fā)明DNA雙脫氧核苷酸末端終止測序法（chainterminatorsequencing），A.M.Maxam和W.Gilbert發(fā)明DNA化學降解測序法(chemicaldegradationsequencing)，2項技術的出現(xiàn)，標志第1代測序技術誕生。第3頁/共72頁Sanger測序法的原理每一次DNA測序反應都由4個獨立反應組成；由于DNA雙鏈中核苷酸以3′，5′-磷酸二酯鍵相連，因此在測序過程中摻入2′，3′-雙脫氧核苷三磷酸———ddNTP（不含3′-OH），當ddNTP位于DNA雙鏈的延伸末端時，無羥基3′端不能與其他脫氧核苷酸形成3′，5′-磷酸二酯鍵，因此，DNA雙鏈合成便終止；若在終止位點摻入ddATP，則新生鏈末端為A，若摻入ddTTP、ddCTP、ddGTP，相應地，新生鏈末端則是T、C或G。第4頁/共72頁第5頁/共72頁第6頁/共72頁第7頁/共72頁第8頁/共72頁該測序技術的具體做法如下：將模板、引物、4種dNTP（其中含有一種為放射性同位素標記的核苷酸）與DNA聚合酶共同保溫，形成的混合物包含許多長短不一的片段，最后利用聚丙烯酰胺變性凝膠電泳（SDS）分離該混合物，得到放射性同位素自顯影條帶圖譜，人們依據(jù)凝膠電泳圖即可讀出DNA雙鏈的堿基序列組成。第9頁/共72頁第10頁/共72頁第11頁/共72頁第12頁/共72頁自動化測序?qū)嶋H上已成為當今dna序列分析的主流。美國PEABI公司已生產(chǎn)出373型、377型、310型、3700和3100型等dna測序儀，其中310型是臨床檢測實驗室中使用最多的一種型號。第13頁/共72頁測序過程中的常見問題分析在進行DNA測序時，緊接引物的10—30Bases有時不一定能完全讀清楚。由于DNA結構上的原因，有時會出現(xiàn)反應中途無法進行之情況。如：G/Crich;G/CCluster；PolyA、PolyT的連續(xù)結構等。此外，另一種情況為反應中途出現(xiàn)的套峰現(xiàn)象，此種情況一般為DNA結構中的重復序列，造成測序用引物和模板之間有二個以上的結合位點。具體問題分析如下：1：測序結果有很多套峰，出現(xiàn)很多N值原因分析：PCR產(chǎn)物直接進行測序，在PCR產(chǎn)物長度以后將無反應信號，機器將產(chǎn)生許多N值。

在序列的起始端出現(xiàn)N值，主要是由于有未去除的染料單體造成的干擾峰，是機器無法正確判讀出位何值。有時，引物二聚體或者起始端小片段的丟失，也會出現(xiàn)N值。模版本身含雜合序列，有等位基因。第14頁/共72頁測序過程中的常見問題分析2：為什么找不到我的PCR引物序列？用PCR引物作為測序引物，所測序列是從引物3末端后第一個堿基開始的，所以就找不到您的測序引物了?？梢赃M行反向測序，得到引物的反向互補序列。還可以將所測片段克隆到適當載體中，由于通用引物與插入序列有一段距離，就可以測出您的引物序列。3：測序結果和文獻資料不一樣，為什么?原因有很多，如同一種動物，在不同的種族之間，或者不同的個體之間，基因序列也不一定完全一樣。如果是PCR產(chǎn)物克隆測序,那還有PCR過程中的錯配因素等等。我們提供的測序結果是客戶樣品序列的忠實結果，不能保證和文獻序列完全一致。4：過短的PCR產(chǎn)物為什么不適于直接測序？首先由于一般的PCR產(chǎn)物純化試劑盒要求產(chǎn)物片段大于200bp,過短的PCR產(chǎn)物不能進行純化；再者，測序的前50bp和后50bp的序列是不好的，所以不適于直接測序。第15頁/共72頁測序過程中的常見問題分析5：酒精如果沒有揮發(fā)完全,在約300bp處會出現(xiàn)連續(xù)異常的G峰，酒精揮發(fā)時間過長會導致DNA斷裂。第一個峰，重疊干擾。如果不判讀為干擾峰，那就說明樣品不純，如果是基因組DNA，就很好地說明了樣品為雜合子，該位點可能存在SNP現(xiàn)象（T/G）。如果判讀為干擾峰，我們只需認定樣品此處堿基為T為行了。第二個峰，錯位干擾。如果不判讀為干擾峰，則說明樣本可能比預期多一個堿基（G），如果判讀為干擾峰，我們?nèi)灾恍枵J定樣品此處堿基為T為行了。第16頁/共72頁測序過程中的常見問題分析6：為什么用PCR產(chǎn)物或質(zhì)粒測序時，經(jīng)常會出現(xiàn)套峰現(xiàn)象?下圖是pGEM-T載體測序的結果，在83位點處測序結果出現(xiàn)雙峰，即模板中含有兩個或兩個以上的相同載體，但是插入片段不同。解決辦法：重新挑取單克隆或者重新提取質(zhì)粒。需要注意的是，重新進行PCR反應或者酶切鑒定僅能證明該克隆含有插入片段，并不足以證明模板的單一。第17頁/共72頁測序過程中的常見問題分析7：poly結構的測序結果以polyT為例，在polyA/T結構之后往往出現(xiàn)移碼現(xiàn)象，而在polyG/C之后會往往導致測序信號的衰減。解決辦法：使用反向引物對模板進行測序，測到該poly結構處，即可完成模板全長的拼接。第18頁/共72頁第二代測序技術（Next-GenerationSequencing）第19頁/共72頁各自的優(yōu)點454測序平臺得到的片段能夠達到400bp，并且讀長的質(zhì)量高；Solexa測序平臺的性價比最高，在數(shù)據(jù)量相同的情況下，測序成本僅為454測序平臺的1/10；SOLiD測序平臺準確度能夠達到99.94%，在片段覆蓋率為15×時，測序準確度可接近100%。第20頁/共72頁2005年底，454公司推出第一個基于焦磷酸測序原理的高通量基因組測序系統(tǒng)——GenomeSequencer20System，這是核酸測序技術發(fā)展史上里程碑式的事件。隨后，羅氏公司以1.55億美元收購了454公司，并在2006年推出了更新的GSFLX測序系統(tǒng)，該系統(tǒng)可在10小時的運行中獲得100萬條讀長（reads），4~6億個堿基信息（basepair），且準確率達到99%以上。2008年，GSFLX系統(tǒng)再次升級，通量提高了5倍，讀長和準確率也有所增加。雖然454GS測序平臺也許不是市場占有率最高的測序儀，但截至2011年3月，利用該系統(tǒng)進行研究的論文已發(fā)表超過1000余篇，而它在讀長上的優(yōu)勢明顯勝于另兩套系統(tǒng)，因此在從頭測序（denovo）和宏基因組測序（metagenome）方面有著不可替代的地位。第21頁/共72頁2006年，Solexa公司也推出了自己的NGS系統(tǒng)——GenomeAnalyzer，簡稱GA。這套基于DNA簇（DNAcluster）、橋式PCR（BridgePCR）和可逆阻斷（Reversibleterminator）等核心技術的系統(tǒng)具有高通量、低錯誤率、低成本、應用范圍廣等優(yōu)點。2007年，Illumina公司以6億美元的高價收購了Solexa，使GA得以商品化。GA最早期的版本一次運行可獲得1Gb的數(shù)據(jù)，因此也有1GbAnalyzer的含義，而最新的Hiseq2000平臺則能夠在10天的運行中獲得300Gb以上的數(shù)據(jù)，讀取的堿基長度達到150bp左右。更有消息稱，Illumina已完成了600Gb的運行測試并在部分客戶中開展了前期體驗，Tb（1000Gb）級的測試Run也將于年內(nèi)進行。據(jù)不完全統(tǒng)計，Illumina公司已售出超過600臺/套GAIIx和Hiseq2000平臺，2010年僅深圳華大基因研究院一家就購買了128臺Hiseq2000，一舉成為全球最大的基因組測序與分析中心，Illumina公司在測序領域的影響力由此可見一斑。第22頁/共72頁在Sanger測序時代，美國應用生物系統(tǒng)公司（ABI）一直是該行業(yè)的龍頭老大，其壟斷地位無人能撼，從早期的377到全自動化的3730xl，ABI的測序儀被廣泛應用在基因組學研究的各個方面。然而在第二代測序技術迅猛發(fā)展之初，ABI起步較晚，顯得有些漫不經(jīng)心。直到2005年454公司推出GS平臺，ABI的領先地位受到威脅，這才開始發(fā)力，迅速收購了研發(fā)NGS的一家小公司Agencourt，并于2007年推出了它的SOLiD測序平臺。此后SOLiD不斷升級，目前已到SOLiD5版本（SOLiD5500xl）。SOLiD的全稱是SequencingbyOligoLigationDetection，即寡聚物連接檢測測序，其基本原理是通過熒光標記的8堿基單鏈DNA探針與模板配對連接，發(fā)出不同的熒光信號，從而讀取目標序列的堿基排列順序。在該方法下，目標序列的所有堿基都被讀取了兩遍，因此SOLiD最大的優(yōu)勢就是它的高準確率。據(jù)悉，SOLiD5平臺的測序通量已達到30Gb/天，成本低于60美元/Gb，準確率高達99.99%。并且由于SOLiD系統(tǒng)采用的不是PCR反應進行DNA合成與測序，因此對于高GC含量的樣本，SOLiD系統(tǒng)具有非常大的優(yōu)勢。第23頁/共72頁2023/4/16454測序原理焦磷酸測序法（Pyrosequencing)的原理第24頁/共72頁2023/4/16454測序原理焦磷酸測序法（Pyrosequencing)的原理第25頁/共72頁2023/4/16454測序原理焦磷酸測序法（Pyrosequencing)的原理第26頁/共72頁2023/4/16454測序原理在454測序儀中，A、T、G、C四種堿基是分別存儲在單獨的試劑瓶中的，每步反應四種堿基依次加入反應池，當堿基配對結合，就會釋放出一個焦磷酸（PPi），而這個焦磷酸在酶的作用下，將熒光素氧化成氧化熒光素，并發(fā)出光信號，從而讀取出這一位置的堿基信息。454測序儀的整個實驗步驟可大致概括為：樣品處理文庫制備emPCR反應板準備上機測序第27頁/共72頁2023/4/16454測序原理樣品處理：樣品處理主要是針對大片段的DNA分子，如基因組DNA、Fosmid或BAC質(zhì)粒等，利用超聲或氮氣打斷將這些DNA分子片段化，然后采用瓊脂糖凝膠電泳回收或磁珠純化，選擇500-800bp的DNA片段。對于非編碼RNA或PCR產(chǎn)物，則不需要這一步驟。第28頁/共72頁2023/4/16454測序原理文庫制備包括接頭連接和磁珠純化兩步，454的文庫接頭分A、B兩種，各44bp，由20bp的PCR引物、20bp的測序引物及4bp（TCAG）的“key”堿基構成，其中B接頭的5’端帶有生物素（Biotin）標記，用于磁珠純化步驟。經(jīng)過磁珠結合與DNA變性之后，只有A+目的片段+B形式的連接產(chǎn)物得以富集，另兩種形式（AA、BB）的產(chǎn)物都被去除。第29頁/共72頁2023/4/16454測序原理emPCR（乳液PCR)是454測序的一個關鍵步驟，將富集到的文庫與測序磁珠、各反應物混合，加入特定的礦物油和表面活性劑，再利用振蕩器劇烈振蕩，使反應體系形成油包水（water-in-oil）的穩(wěn)定乳濁液。在理想條件下，每一個液滴，或稱微反應器（microreactor）中將只包含一個磁珠和一條單鏈DNA，通過控制該步驟的條件，1mL乳液中可以形成至少10的6次方個理想的微反應器。經(jīng)過PCR擴增后，每一個磁珠上將形成密集的DNA簇，這些DNA序列完全相同，即可用于后續(xù)的步驟。隨后，乳液混合物被打破，擴增的片段依然結合在磁珠上。第30頁/共72頁2023/4/16454測序原理454測序的反應板稱為PTP（PicoTiterPlate），含有350萬個由光纖組成的小孔，每個孔的直徑為29μm，而測序磁珠的直徑為20μm，因此每個孔中僅能容納一個磁珠。將磁珠與測序試劑加入PTP中，使之可用于上機測序。第31頁/共72頁2023/4/16454測序原理測序步驟如前所述，四種堿基在泵的控制下依次加入反應板，反應完成后再洗去，每延伸一個或若干個堿基，就會發(fā)出一次光信號，通過記錄信號的有無和強度，即可測定DNA序列。第32頁/共72頁2023/4/16第33頁/共72頁2023/4/16454測序原理優(yōu)缺點：454測序準確度較高，當讀長超過400bp時，其準確性仍能達到99%以上；主要的錯誤來自于同聚物，即相同堿基的連續(xù)延伸，如ATTTG這樣一段序列，A和G的讀取沒有問題，但T只記錄了一次光信號，僅信號強度與ATG序列的T有所不同，因此同聚物越長，可能產(chǎn)生的誤差就越大。目前，由于454測序儀在讀長上的明顯優(yōu)勢，它在大基因組從頭測序（denovo）、轉(zhuǎn)錄組分析、基因組結構分析等領域有著廣泛的應用。第34頁/共72頁Solexa測序2023/4/16第35頁/共72頁Solexa測序2023/4/16常用術語：SBS：邊合成邊測序反應，每次SBS會延伸一個堿基，大約耗時70分鐘。Run：單次上機測序反應，可以產(chǎn)生4G-75G測序通量不等。Lane：單泳道，每條泳道可以直接物理區(qū)分測序樣品，1次run最多可以同時上樣8條Lane。Channel：Lane的同義詞。Tile：小區(qū)，每條Lane中排有2列tile，合計120個小區(qū)。每個小區(qū)上分布數(shù)目繁多的簇結合位點。Cluster：簇，在Solexa測序技術中會采用橋式PCR方式生產(chǎn)DNA簇，每個DNA簇才能產(chǎn)生亮度達到CCD可以分辨的熒光點。第36頁/共72頁Solexa測序2023/4/16Index：標簽，在Solexa多重測序（MultiplexedSequencing）過程中會使用Index來區(qū)分樣品，并在常規(guī)測序完成后，針對Index部分額外進行7個循環(huán)的測序，通過Index的識別，可以在1條Lane中區(qū)分12種不同的樣品。Barcode:

Index同義詞Fasta：一種序列存儲格式。一個序列文件若以FASTA格式存儲，則每一條序列的第一行以“>”開頭，而跟隨“>”的是序列的ID號（即唯一的標識符）及對該序列的描述信息；第二行開始是序列內(nèi)容，序列短于61nt的，則一行排列完；序列長于61nt的，則每行存儲61nt，最后剩下小于61nt的，在最后一行排列完；第二條序列另起一行，仍然由“>”和序列的ID號開始，以此類推。第37頁/共72頁Solexa測序2023/4/16Fastq：Fastq是Solexa測序技術中一種反映測序序列的堿基質(zhì)量的文件格式。第一行以“@”符號開頭，后面緊跟一個序列的描述信息；第二行是該序列的內(nèi)容；第三行以“+”符號開頭，后面緊跟的內(nèi)容與第一行一樣，同樣是該序列的描述信息；而第四行是第二行中的序列內(nèi)容每個堿基所對應的測序質(zhì)量值。PF%：PF%是指符合測序質(zhì)量標準的簇的百分比（MultiplexedSequencing），與測序的通量相關聯(lián)。Read：Solexa是成簇反應的，每個簇對應一條DNA序列片段，成為一個read。第38頁/共72頁Solexa測序2023/4/16第39頁/共72頁Solexa測序2023/4/16第40頁/共72頁Solexa測序2023/4/16第41頁/共72頁Solexa測序2023/4/16第42頁/共72頁Solexa測序2023/4/16第43頁/共72頁Solexa測序2023/4/16第44頁/共72頁Solexa測序2023/4/16第45頁/共72頁Solexa測序2023/4/16第46頁/共72頁Solexa測序2023/4/16應用：

Solexa平臺的應用范圍極廣，幾乎囊括了目前基因組學研究的所有方面，例如基因組從頭測序（denovo）、重測序（re-sequencing）、基因組結構分析、轉(zhuǎn)錄組測序、表達譜分析、小RNA及非編碼RNA測序、表觀遺傳學研究等等。第47頁/共72頁SOLiD測序2023/4/16第48頁/共72頁SOLiD測序2023/4/16第49頁/共72頁SOLiD測序2023/4/16第50頁/共72頁SOLiD測序2023/4/16第51頁/共72頁SOLiD測序2023/4/16第52頁/共72頁SOLiD測序2023/4/16第53頁/共72頁SOLiD測序2023/4/16第54頁/共72頁SOLiD測序2023/4/16第55頁/共72頁SOLiD測序2023/4/16第56頁/共72頁SOLiD測序2023/4/16第57頁/共72頁SOLiD測序2023/4/16第58頁/共72頁SOLiD測序2023/4/16第59頁/共72頁SOLiD測序2023/4/16第60頁/共72頁SOLiD測序2023/4/16第61頁/共72頁SOLiD測序2023/4/16第62頁/共72頁SOLiD測序2023/4/16第63頁/共72頁三者比較Ｒｏｃｈｅ／４５４測序技術讀取長度（６００～１０００ｂｐ），在３種測序技術中最長，可以對未知基因組進行從頭測序，但其通量最低（０．５～１Ｇｂ／ｒｕｎ）。當遇到ｐｏｌｙｍｅｒ（如ＡＡＡＡＡＡ等）時，堿基個數(shù)和熒光信號強度不成線性關系，即判斷重復堿基有困難。2023/4/16第64頁/共72頁三者比較Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ屬于高度自動化的系統(tǒng)，讀取片段比其它種類的測序多，適合進行大量小片段的測序（如ｍｉｃｒｏＲＮＡｐｒｏｆｉｌｉｎｇ），其測序通量大，其新機型Ｈｉｓｅｑ２０００產(chǎn)出量為６００Ｇｂ／ｒｕｎ，但基于可逆反應時隨反應輪數(shù)增加效率降低、信號減弱，并且讀長（通常為１００ｂｐ）比Ｒｏｃｈｅ／４５４短，給從頭測序拼接帶來困難。2023/4/16第65頁/共72頁三者比較ＡＢＩ／ＳＯＬｉＤ技術每個堿基讀?。泊?，有非常高的準確性，特別是針對ＳＮＰ的檢測。此外，靈活的系統(tǒng)和完善的磁珠編碼系統(tǒng)可以進行樣品的ｐｏｏｌｉｎｇ來分割測序區(qū)域，特別適用于具有高質(zhì)量參考基因組序列物種的重測序，但是該測序讀長（５０ｂｐ）最短，并且讀取長度受反應輪數(shù)的限制，給從頭測序拼接帶來困難。2023/4/16第66頁/共72頁第三代測序技術原理：脫氧核苷酸用熒光標記，顯微鏡可以實時記錄熒光的強度變化。當熒光標記的脫氧核苷酸被摻入DNA鏈的時候，它的熒光就同時能在DNA鏈上探測到。當它與DNA鏈形成化學鍵的時候，它的熒光基團就被DNA聚合酶切除，熒光消失。這種熒光標記的脫氧核苷酸不會影響DNA聚合酶的活性，并且在熒光被切除之后，合成的DNA