第四章 細胞培養(yǎng)與代謝調(diào)控

第四章細胞培養(yǎng)與代謝調(diào)控第1頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二體外細胞培養(yǎng)物的生長類型按生長方式劃分：1、粘附型細胞:也叫貼壁型，附著在某一固相支持物表面才能生長的細胞。2、懸浮型細胞:不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下即可生長的細胞。3、半貼壁型細胞：細胞可在懸浮狀態(tài)生長，也可以在一定條件下貼壁生長?；旧现参锛毎际菓腋⌒图毎囵B(yǎng)方式，動物細胞是粘附型細胞培養(yǎng)方式。

絕大多數(shù)動物細胞屬粘附型細胞，只有少數(shù)細胞類型如某些腫瘤細胞和白細胞可在懸浮狀態(tài)下生長。第2頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二細胞貼壁過程第3頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二貼附接觸抑制密度抑制細胞呈貼壁生長,梭形或不規(guī)則形,在粘附因子的作用下，細胞生出偽足，偽足越多，貼壁越好。細胞在生長過程中達到相互接觸時停止分裂的現(xiàn)象。因此，貼壁細胞通常都是單層細胞培養(yǎng)狀態(tài)。細胞接觸后，雖發(fā)生接觸抑制，但只要營養(yǎng)充分，細胞仍會增殖分裂，細胞數(shù)量仍在增多。但當細胞密度進一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制，導致細胞分裂停止。第4頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二粘附型細胞分為：1、成纖維細胞型：似體內(nèi)成纖維細胞的形態(tài)，胞體梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出2—3個長短不等的突起，中有卵圓形核。生長時排列成放射狀，漩渦狀，并不緊靠連成片，細胞—細胞接觸易斷開而單獨行動，游離的單獨的成纖維樣細胞，常有幾個伸長的細胞突起。2、上皮型細胞：類似體內(nèi)的上皮細胞，扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核。生長時易相連成片，相靠—緊密相連—成薄層—鋪石狀生長時呈膜狀移動，很少脫離細胞群而單個活動。3、游走細胞型：呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運動，方向不規(guī)則。此型細胞不穩(wěn)定，有時難以和其他細胞相區(qū)別。4、多形型細胞：有一些細胞，如神經(jīng)細胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。

第5頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二細胞培養(yǎng)的條件1、無菌、無毒：（1）對培養(yǎng)液和所有用具進行無菌處理（2）添加一定量的抗生素，防治培養(yǎng)過程中的污染（3）定期更換培養(yǎng)液，以便清除代謝產(chǎn)物防治細胞代謝產(chǎn)物積累對細胞自身造成危害2、全部的營養(yǎng)物質(zhì)：葡萄糖、氨基酸、無機鹽、促生長因子、微量元素、動物血清等。3、適宜的溫度和PH值：36.5+0.5度,PH值7.2-7.44、必要的氣體條件：O2

：細胞代謝所必需的CO2：維持培養(yǎng)液的PH通常采用培養(yǎng)皿或松蓋培養(yǎng)瓶將其置于含95%空氣和5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)5、其他：光照、濕度等第6頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二細胞培養(yǎng)的方式根據(jù)細胞生長方式分為貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)兩大類；根據(jù)細胞代次分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)；根據(jù)細胞培養(yǎng)操作方式分為：1、固定化培養(yǎng)：通過一些固相的交聯(lián)化合物將細胞固定于小格中，或者通過共價鍵交聯(lián)住細胞，在培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。2、分批培養(yǎng)：將細胞和培養(yǎng)基一次性加入反應器內(nèi)進行培養(yǎng)，此后細胞不斷增長，產(chǎn)物不斷形成和積累，最后將培養(yǎng)基連同細胞一并取出，培養(yǎng)結束。3、流加培養(yǎng)：在分批培養(yǎng)的基礎上間斷地或連續(xù)地補加培養(yǎng)基。4、半連續(xù)培養(yǎng)：當細胞和培養(yǎng)基一起加入反應器后，在細胞增長和產(chǎn)物形成過程中，每間隔一段時間，取出部分培養(yǎng)物或細胞，然后補充同樣數(shù)量的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。5、連續(xù)培養(yǎng)：連續(xù)性加入新鮮的培養(yǎng)基，同時取出相同量的舊培養(yǎng)基和細胞。6、灌流培養(yǎng)：當細胞和培養(yǎng)基一起加入反應器后，在細胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時不斷地補充新鮮培養(yǎng)基。通常用于被固定后的細胞培養(yǎng)。第7頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二原代培養(yǎng)：從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞為原代細胞。培養(yǎng)的第1代細胞與傳10代以內(nèi)的細胞稱為原代細胞培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：將原代細胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。特殊的概念：永生化細胞：正常細胞的生長代謝處于增殖、分化、衰老及凋亡的動態(tài)平衡，體外增殖是有限的，培養(yǎng)細胞生命的自然極限稱為海弗利克極限。細胞內(nèi)控制這一系列過程的是一個龐大復雜的細胞調(diào)節(jié)網(wǎng)絡，其中任何一個環(huán)節(jié)發(fā)生錯誤，都有可能觸發(fā)細胞內(nèi)相互關聯(lián)的一系列信號分子的表達和功能異常，使細胞跨越海弗利克極限，獲得不死性，發(fā)生永生化。細胞系：指原代細胞培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后所繁殖的細胞群體。無限細胞系：細胞永生性也稱不死性，即細胞獲持久性增殖能力，這樣的細胞群體稱無限細胞系，也稱連續(xù)細胞系。有限細胞系：初代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細胞系的生存期限有限，為有限細胞系。原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)第8頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二細胞懸液10代細胞50代細胞無限傳代原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)多數(shù)組織細胞固定在表面生長和分裂。隨細胞增多，細胞就會停止分裂增殖遺傳物質(zhì)改變遺傳物質(zhì)未改變?nèi)斯ふT導癌化第9頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二細胞傳代及培養(yǎng)方法第10頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二取動物組織塊用胰蛋白酶處理分散成單個細胞通常選用幼齡動物組織或胚胎細胞（細胞分化程度低，增殖能力強，更易于培養(yǎng)）動物貼壁細胞培養(yǎng)過程第11頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二1、棄掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液；2、加入0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個瓶底為準），靜置2-10min（顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測）。3、吸去胰蛋白酶液，加入一定量的培養(yǎng)液(以能覆蓋整個瓶底為準）。4、用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復吹打瓶壁細胞，形成細胞懸液。5、吸取細胞懸液，300g離心2-5min，用新鮮的培養(yǎng)基重懸制備細胞懸液；6、分瓶接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，加適量新鮮培養(yǎng)液。7、培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。貼壁細胞傳代培養(yǎng)方法-胰酶消化法胰蛋白酶的消化功能：胰蛋白酶的作用是使細胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細胞離散。不同的組織或者細胞對胰酶的作用反應不一樣。胰酶分散細胞的活性還與其濃度、溫度和作用時間有關，在pH為8.0、溫度為37℃時，胰酶溶液的作用能力最強。使用胰酶時，應把握好濃度、溫度和時間，以免消化過度造成細胞損傷。第12頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二植物懸浮細胞培養(yǎng)過程第13頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二1懸浮生長細胞傳代：離心法傳代：離心（300-500g/min）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。2半懸浮生長細胞傳代（Hela細胞）：此類細胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使紉胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。懸浮型細胞傳代培養(yǎng)方法-離心法第14頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二植物組織培養(yǎng)和動物細胞培養(yǎng)的比較比較項目植物組織培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)原理細胞的全能性細胞增殖培養(yǎng)基性質(zhì)固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基特有成分蔗糖、植物激素葡萄糖、動物血清培養(yǎng)結果完整的植物體細胞群體培養(yǎng)目的快速繁殖、培育無病毒植株等獲得細胞或細胞分泌蛋白等第15頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二正常細胞生命期是指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間，包括原代培養(yǎng)期、傳代培養(yǎng)期及衰退期。1、原代期：也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1-4周。細胞呈活躍移動，可見細胞分裂，但不旺盛。與體內(nèi)原組織在形態(tài)結構和功能活動上相似性大。2、傳代期：體內(nèi)細胞生長在動態(tài)平衡環(huán)境中，生存空間和營養(yǎng)是有限的。當細胞增殖達到一定密度后，則需要分離出一部分細胞和更新營養(yǎng)液，否則將影響細胞的繼續(xù)生存，這一過程叫傳代。傳代期在細胞全生命期中的持續(xù)時間最長，細胞增殖旺盛。3、衰退期：此期細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。第16頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二體外培養(yǎng)細胞“一代”生存期細胞“一代”系指從細胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習慣說法，它與細胞世代或倍增一代非同一含義。如某一細胞系為第153代細胞，即指該細胞系已傳代153次。它與細胞世代或倍增不同；在細胞一代中，細胞能倍增3～6次。細胞“一代”生存期包含潛伏期、指數(shù)增生期、停滯期和衰退期。第17頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二1、潛伏期（1）游離：懸浮，胞質(zhì)回縮,全部細胞變?yōu)閳A球形，約10分鐘至4小時。（2）吸附：貼附底物，一般24小時內(nèi)貼壁，細胞株平均在10分鐘至4小時后貼壁。（3）潛伏：可有運動活動，基本無增殖,少見分裂相，一般為6～24小時。2．指數(shù)增生期細胞增值最旺盛的階段，細胞分裂相增多，群體均一是理想的實驗用細胞。指數(shù)增生期細胞分裂相數(shù)量可作為判定細胞生長旺盛與否的一個重要標志。指數(shù)增長期末期會出現(xiàn)接觸抑制和密度抑制現(xiàn)象。3．停滯期細胞數(shù)量達飽和密度后，細胞遂停止增殖，進入停滯期。細胞數(shù)量不再增加，故也稱平臺期（Plateau）。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡。第18頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二潛伏期指數(shù)生長期停滯期第19頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二影響潛伏期長短的因素：1、細胞種類傳代培養(yǎng)的細胞之潛伏期比原代培養(yǎng)的細胞短。傳代培養(yǎng)期的細胞6-24h，原代24-96h或更長。連續(xù)細胞系

(6-24h)比有限細胞系與正常細胞系的潛伏期短。2、接種的細胞密度密度越大、數(shù)量越多，細胞群體越容易適應體外環(huán)境，潛伏期就短。相反，即便是在很小的培養(yǎng)空間內(nèi)，如接種的細胞數(shù)量不夠大，潛伏期仍會較長3、培養(yǎng)條件培養(yǎng)液、pH、底物、污染,有毒

第20頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二誘導轉(zhuǎn)化有限系無限系第21頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二練習：動物細胞培養(yǎng)與植物細胞培養(yǎng)的重要區(qū)別在于（）

A.培養(yǎng)基不同；

B.動物細胞培養(yǎng)不需要在無菌條件下進行；

C.動物細胞可以傳代培養(yǎng)，而植物細胞不能；

D.動物細胞能夠大量培養(yǎng)，而植物細胞只能培養(yǎng)成植株。作業(yè)：1、原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)的區(qū)別？2、傳代培養(yǎng)細胞的特點？3、簡述動物細胞培養(yǎng)過程？4、動物細胞培養(yǎng)的條件？5、離體培養(yǎng)的動物細胞分為那些類型及各自特點？第22頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二第四節(jié)細胞代謝與調(diào)控1、糖代謝與脂肪代謝的相互關系2、糖代謝與蛋白質(zhì)代謝的相互關系3、脂肪代謝與蛋白質(zhì)代謝的相互關系4、核酸和其他物質(zhì)代謝的相互關系第23頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二一、糖代謝與脂肪代謝的相互關系延胡索酸琥珀酸蘋果酸草酰乙酸3-磷酸甘油三羧酸循環(huán)甘油乙酰CoA三酰甘油脂肪酸

糖原（或淀粉）1，6-二磷酸果糖磷酸二羥丙酮磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸合成植物或微生物特有氧化糖異生糖酵解乙醛酸循環(huán)第24頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二二、糖代謝與蛋白質(zhì)代謝的相互關系草酰乙酸乙酰CoA檸檬酸α-酮戊二酸

糖原（或淀粉）1，6-二磷酸果糖磷酸二羥丙酮磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸糖酵解甘油丙氨酸天冬氨酸谷氨酸脫氨基琥珀酸乙醛酸途徑三羧酸途徑糖異生第25頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二三、脂肪代謝與蛋白質(zhì)代謝的相互關系氨基酸碳架氨基酸3-磷酸甘油甘油乙酰CoA三酰甘油脂肪酸合成氧化磷酸二羥丙酮磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸第26頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二四、核酸和其他物質(zhì)代謝的相互關系甘氨酸天冬氨酸谷氨酰胺一碳單位合成嘌呤合成嘧啶核酸核苷酸ATPGTPCTPUTP磷酸核糖ADP+GiGDP+GiCDP+GiUDP+Gi雙糖或多糖磷酸戊糖途徑葡萄糖能量和磷酸基團的供應單糖的轉(zhuǎn)變和多糖的合成參與卵磷脂的合成給蛋白質(zhì)合成提供能量第27頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二代謝調(diào)控總論代謝調(diào)節(jié)的三級水平：細胞/酶水平調(diào)節(jié)激素水平調(diào)節(jié)神經(jīng)水平調(diào)節(jié)多細胞整體水平調(diào)節(jié)代謝物通過影響細胞內(nèi)酶活力和酶合成量的變化，改變合成或分解代謝過程的速度內(nèi)分泌腺所分泌的激素通過體液輸送到一定組織，作用于靶細胞，改變酶活性而調(diào)節(jié)代謝反應的方向和速度。CNS的控制下，通過神經(jīng)遞質(zhì)對效應器發(fā)生直接影響，或者改變激素的分泌。第28頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二酶水平調(diào)節(jié)酶活性調(diào)節(jié)（酶結構調(diào)節(jié)）變（別）構調(diào)節(jié)快速調(diào)節(jié)（微調(diào)）酶合成的誘導與阻遏長期調(diào)節(jié)（粗調(diào)節(jié)）酶含量調(diào)節(jié)（基因表達水平調(diào)節(jié)）化學修飾調(diào)節(jié)酶的降解細胞/酶水平調(diào)節(jié)第29頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二酶活性調(diào)節(jié)---變構調(diào)節(jié)別構效應物別構激活劑——別構激活（正反饋）——增加活性別構抑制劑——別構抑制（負反饋）——降低活性某些代謝物能與變構酶分子上的變構部位特異性結合，使酶的分子構象發(fā)生改變，從而改變酶的催化活性以及代謝反應的速度。被調(diào)節(jié)的酶稱為變構酶或別構酶使酶發(fā)生變構效應的物質(zhì)，稱為變構效應劑。其中引起酶活性增加的變構效應劑成為變構激活劑；引起酶活性降低的變構效應劑稱為變構抑制劑。第30頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二變構調(diào)節(jié)的生理意義1、代謝終產(chǎn)物反饋抑制反應途徑中的酶，使代謝物不致生成過多。乙酰CoA乙酰CoA羧化酶丙二酰CoA長鏈脂酰CoA2、變構調(diào)節(jié)使能量得以有效利用，不致浪費。3、變構調(diào)節(jié)使不同的代謝途徑相互協(xié)調(diào)。G-6-P糖原磷酸化酶抑制糖的氧化糖原合酶促進糖的儲存檸檬酸6-磷酸果糖激酶抑制糖的氧化乙酰輔酶A羧化酶促進脂酸合成第31頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二第32頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二酶活性調(diào)節(jié)---共價修飾調(diào)節(jié)酶蛋白肽鏈上某些殘基在酶的催化下發(fā)生可逆的共價修飾，從而引起酶活性改變，這種調(diào)節(jié)稱為酶的共價修飾。共價修飾的主要方式：1、磷酸化---去磷酸2、乙?；?/p>

---脫乙酰3、甲基化

---去甲基4、腺苷化

---脫腺苷5、單價巰基---二硫鍵-OHThrSerTyr酶蛋白H2OPi磷蛋白磷酸酶ATPADP蛋白激酶ThrSerTyr-O-PO32-磷酸化的酶蛋白共價修飾的特點：1、酶蛋白的共價修飾是可逆的酶促反應，在不同酶的作用下，酶蛋白的活性狀態(tài)可互相轉(zhuǎn)變。2、具有放大效應，效率較變構調(diào)節(jié)高。3、磷酸化與脫磷酸是最常見的方式。4、同一個酶可以同時受變構調(diào)節(jié)和化學修飾調(diào)節(jié)。第33頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二第34頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二酶含量調(diào)節(jié)-酶合成的誘導、阻礙和降解DNA轉(zhuǎn)錄初產(chǎn)物RNAmRNA蛋白質(zhì)前體mRNA降解物活性蛋白質(zhì)DNA水平調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后加工的調(diào)節(jié)翻譯調(diào)節(jié)mRNA降解調(diào)節(jié)翻譯后加工的調(diào)節(jié)核細胞質(zhì)DNA水平的調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控翻譯水平的調(diào)控翻譯后水平的調(diào)控第35頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二舉例：乳糖對乳糖操縱子的表達的影響①沒有乳糖存在時，lac操縱子不表達mRNAproteinIDNAZYAOPpol阻遏基因②有乳糖存在時，lac操縱子基因表達mRNAproteinIDNAZYAOPpol第36頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二激素水平調(diào)節(jié)高等生物內(nèi)分泌腺分泌的激素通過體液轉(zhuǎn)運到靶細胞而對代謝進行調(diào)節(jié)。激素激素激素靶細胞受體細胞內(nèi)信號跨膜傳遞細胞內(nèi)的化學反應生物學效應按激素受體在細胞的部位不同，可將激素分為兩大類：1.膜受體激素：膜受體是存在于細胞表面質(zhì)膜上的跨膜糖蛋白。2.胞內(nèi)受體激素：大多數(shù)位于細胞核內(nèi)，有的在胞液中的特異受體結合蛋白。第一信使受體信號第二信使，產(chǎn)生級聯(lián)方法效應。第37頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二第38頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二

E0E1En-1+或-反饋+或-正作用：凡反應物能使代謝過程速度加快者稱為正作用。負作用：凡反應物能使代謝過程速度變慢者稱為負作用。代謝調(diào)控的基本類型前饋S0S1S2Sn1、前饋作用（feedforward）：在代謝途徑中前面的底物對其后某一催化反應的調(diào)節(jié)酶有作用。分為前饋激活和前饋抑制，相當于前饋正作用和前饋負作用。2、反饋作用（feedback）：代謝產(chǎn)物對前面的某一酶有作用。分為反饋激活和反饋抑制，相當于反饋正作用和反饋負作用。第39頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二

丙酮酸激酶前饋激活乙酰CoA羧化酶前饋抑制1、前饋作用G6-P-G6-P-F1,6-2P-F磷酸烯醇丙酮酸(PEP)丙酮酸(1)前饋激活（feedforwardactivation）(2)前饋抑制(feedforwardinhibition)乙酰CoA+CO2+H2O+ATP丙二酸單酰CoA+ADP+Pi第40頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二E1E2E3E4反饋抑制2.反饋作用（1）一價或單價反饋抑制，即直線式反饋控制，只有一個末端代謝產(chǎn)物的途徑。ABCDPE1E2E3E4反饋抑制ABCDP第41頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二b.協(xié)同反饋控制：分支代謝過程中，任何終產(chǎn)物都不能單獨地反饋該途徑，而當所有終產(chǎn)物都過剩時才能協(xié)同地反饋控制該途