第四節(jié)植物數(shù)量性狀圖位克隆方法

第四節(jié)植物數(shù)量性狀圖位克隆方法第1頁，共30頁，2023年，2月20日，星期二數(shù)量性狀變異的遺傳基礎(chǔ)生物自然群體在形態(tài)、生理、行為和抗性等性狀上存在極大的變異，表現(xiàn)為數(shù)量性狀遺傳。數(shù)量性狀涉及多個(gè)位點(diǎn)，每一位點(diǎn)的效應(yīng)微小，存在等位基因的變異，等位基因的效應(yīng)通過每個(gè)個(gè)體所處的環(huán)境表現(xiàn)出來。P=G+E+G×E當(dāng)前生物學(xué)的一個(gè)重大挑戰(zhàn)是明確數(shù)量性狀變異的遺傳基礎(chǔ)第2頁，共30頁，2023年，2月20日，星期二數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)QuantitativeTraitLocus(QTL)是生物基因組上的某個(gè)區(qū)段，它含有一個(gè)或多個(gè)基因，影響數(shù)量性狀的變異。QTL可以通過多態(tài)性分子標(biāo)記與性狀的連鎖關(guān)系而確定下來，即QTL定位。第3頁，共30頁，2023年，2月20日，星期二QTL初定位

-查找QTL在基因組上的大概位置

初定位的群體：連鎖群體和關(guān)聯(lián)群體：連鎖群體：人工群體，利用雜交過程中產(chǎn)生的重組，通過分子標(biāo)記多態(tài)性與性狀變異的連鎖關(guān)系定位QTL。關(guān)聯(lián)群體：自然群體，利用進(jìn)化或育種過程中所積累的重組和變異，通過基因組中的連鎖不平衡（LD）來確定遺傳多態(tài)性與性狀變異的關(guān)系。缺點(diǎn)：定位結(jié)果很大程度上依賴于群體結(jié)構(gòu)和等位基因頻率。第4頁，共30頁，2023年，2月20日，星期二連鎖群體的基因組結(jié)構(gòu)和QTL初定位連鎖群體：臨時(shí)性分離群體：自交群體（如F2、F3）和回交群體（BC1、BC2）等。永久性分離群體：重組自交系群體(RIL)和加倍單倍體群體(DH)等。在分離群體基礎(chǔ)上篩選的極端個(gè)體群體。第5頁，共30頁，2023年，2月20日，星期二123456789101112123456789101112123456789101112F2RIL表型鑒定以單株或其后代家系為基礎(chǔ)，準(zhǔn)確性不高，不能重復(fù)試驗(yàn)。簡(jiǎn)單，遺傳變異豐富，可以同時(shí)估計(jì)加性和顯性效應(yīng)。后代穩(wěn)定，不發(fā)生分離，鑒定性狀以純合株系為基礎(chǔ)，準(zhǔn)確性高。群體準(zhǔn)備周期長(zhǎng)，只能估計(jì)加性效應(yīng)。早代多次互交，增加重組。第6頁，共30頁，2023年，2月20日，星期二F2群體QTL初定位0/2:homozygousgenotypes1:heterozygousgenotype第7頁，共30頁，2023年，2月20日，星期二關(guān)聯(lián)群體的基因組結(jié)構(gòu)和QTL初定位第8頁，共30頁，2023年，2月20日，星期二關(guān)聯(lián)群體QTL初定位第9頁，共30頁，2023年，2月20日，星期二Diagramofgenomereshufflingbetween25diversefoundersandthecommonparentandtheresulting5000immortalgenotypes.YuJetal.Genetics2008;178:539-551連鎖-關(guān)聯(lián)群體的基因組結(jié)構(gòu)和QTL初定位第10頁，共30頁，2023年，2月20日，星期二PolandJAetal.PNAS2011;108:6893-6898用NAM群體鑒定出了29個(gè)QTL，抗性等位基因用紅色，感病等位基因用綠色。公共親本B73自交系和25個(gè)核心自交系的小斑病抗性第11頁，共30頁，2023年，2月20日，星期二QTL精細(xì)定位

-確定QTL在基因組上的準(zhǔn)確位置

在禾谷類作物中，許多影響重要農(nóng)藝性狀的QTL已被定位，相比較而言，克隆到基因卻非常少。一般來講，初定位的QTL置信區(qū)間在10-30cM，包含幾百個(gè)基因。不清楚QTL是對(duì)應(yīng)一個(gè)基因？還是多個(gè)緊密連鎖的基因?如果對(duì)應(yīng)有多個(gè)基因，基因的效應(yīng)相同?還是相反？是否累加?等等必需精細(xì)定位QTL，克隆對(duì)應(yīng)的基因。第12頁，共30頁，2023年，2月20日，星期二QTL是通過統(tǒng)計(jì)分析得到的，定位在染色體某一置信區(qū)間內(nèi)。增加分子標(biāo)記和完善統(tǒng)計(jì)分析軟件，對(duì)置信區(qū)間的縮小并不是很有效。精細(xì)定位，即在QTL初定位基礎(chǔ)上，針對(duì)目標(biāo)區(qū)間構(gòu)建遺傳背景一致的次級(jí)遺傳分離群體，把復(fù)雜性狀QTL界定于更小的基因組區(qū)域內(nèi)。將QTL作為一個(gè)主Mendelian因子來進(jìn)行精細(xì)定位。QTL精細(xì)定位的可行性第13頁，共30頁，2023年，2月20日，星期二QTL精細(xì)定位決定于三個(gè)基本要素：1)高密度標(biāo)記；2)關(guān)鍵重組個(gè)體；3)重組個(gè)體性狀的準(zhǔn)確鑒定。目標(biāo)：QTL--QTG--QTN

Locus-Gene-NucleotideQTL精細(xì)定位三要素第14頁，共30頁，2023年，2月20日，星期二QTL精細(xì)定位—標(biāo)記密度基因組大規(guī)模重測(cè)序、SNP芯片、比較基因組學(xué)等保證在目標(biāo)基因區(qū)域獲得高密度的分子標(biāo)記。禾谷類作物的基因組重測(cè)序產(chǎn)生了海量的SNP信息，用于開發(fā)目標(biāo)基因區(qū)域的高密度分子標(biāo)記。玉米的HapMap計(jì)劃(Goreetal.2009)有160萬SNP。水稻中，Huangetal.(2010)檢測(cè)到360萬非冗余的SNP位點(diǎn)，平均9.32SNPs/kb。第15頁，共30頁，2023年，2月20日，星期二QTL精細(xì)定位—關(guān)鍵重組個(gè)體成功的QTL精細(xì)定位依賴于關(guān)鍵重組個(gè)體，也即在目標(biāo)QTL區(qū)域有高頻率的染色體交換發(fā)生。重組頻率在染色體的不同區(qū)域變異很大，產(chǎn)生所謂的重組熱點(diǎn)和重組冷點(diǎn)區(qū)域。如QTL位于重組熱點(diǎn)，就易獲得關(guān)鍵重組個(gè)體；不然就需要很大的分離群體，或連續(xù)多代，或組配多個(gè)組合等方法篩選。染色體不同區(qū)域重組頻率的高低與著絲粒位置、染色體結(jié)構(gòu)、親本在QTL區(qū)域的序列差異等均相關(guān)。第16頁，共30頁，2023年，2月20日，星期二玉米染色體的重組頻率和基因密度分布K.Fengleretal.,inpress,PlantGenome第17頁，共30頁，2023年，2月20日，星期二通過控制群體結(jié)構(gòu)和后代測(cè)定等手段來消除遺傳背景的影響，同時(shí)增加重組機(jī)會(huì)。在目標(biāo)QTL區(qū)間建立高分辨率的分子標(biāo)記圖譜，分析目標(biāo)QTL與標(biāo)記的連鎖關(guān)系。主要采用近等基因系(Near-isogeniclines,NILs),染色體片段代換系(chromosomesegmentsubstitutionlines，CSSLs)或?qū)胂?introgressionline,ILs),及基于重組自交系衍生的雜合自交家系(heterogeneousinbredfamily,HIF)或剩余雜合體(residualheterozygousline,RHL)。QTL精細(xì)定位—性狀的準(zhǔn)確鑒定第18頁，共30頁，2023年，2月20日，星期二利用單QTL-NIL群體的精細(xì)定位。篩選在目標(biāo)QTL區(qū)間具有差異、遺傳背景完全一致的QTL近等基因系(nearisogenicline，NIL)，配組構(gòu)建群體，或者篩選在目標(biāo)區(qū)間呈雜合型、遺傳背景呈純合型的單株，自交建立分離群體，通過對(duì)分離群體單株或單株自交后代測(cè)定，分析表型差異，精細(xì)定位目標(biāo)QTL區(qū)間。Advantage:IdenticalbackgroundDisadvantage：Laborious&LongtimeconsumedQTL精細(xì)定位策略—單QTL-NIL第19頁，共30頁，2023年，2月20日，星期二QTL1fromP1isobtainedbyMASusingP2asarecurrentparent.TheresultingNIL1hasachromosomesegmentthatincludesQTL1,butisotherwiseidenticaltotheP2geneticbackground.第20頁，共30頁，2023年，2月20日，星期二第21頁，共30頁，2023年，2月20日，星期二染色體片段代換系CSSLs，即在受體(供體)親本的遺傳背景中建立供體(受體)親本的“基因文庫”，代換系覆蓋全基因組且相互重疊。由代換系組配的分離群體消除了大部分遺傳背景的干擾及QTL之間的互作，可提高QTL定位的效率和精度，從而可進(jìn)一步縮小QTL區(qū)間。QTL精細(xì)定位策略—CSSLs第22頁，共30頁，2023年，2月20日，星期二CSSL(ChromosomeSegmentSubstitutionLine)第23頁，共30頁，2023年，2月20日，星期二基于重組自交系（RIL）衍生的雜合自交家系(heterogeneousinbredfamily，HIF)或剩余雜合體(residualheterozygousline,RHL)的QTL精細(xì)定位。RIL群體是連續(xù)自交產(chǎn)生的，隨著代數(shù)的增加，染色體上的大多數(shù)位點(diǎn)逐步純合，一般到F5代就只有6.25％的位點(diǎn)處于雜合狀態(tài)。在QTL初定位基礎(chǔ)上，利用分子標(biāo)記從RIL群體中篩選目標(biāo)QTL雜合而背景純合的RHL自交，構(gòu)建類似單QTL-NIL群體。從RIL群體中篩選，時(shí)間短，花費(fèi)少，現(xiàn)在較多地用于QTL精細(xì)定位。QTL精細(xì)定位策略—HIF或RHL第24頁，共30頁，2023年，2月20日，星期二RHL(ResidualHeterozygousLine)第25頁，共30頁，2023年，2月20日，星期二玉米抗病QTL精細(xì)定位中遇到的問題玉米的抗病大多數(shù)屬數(shù)量性狀遺傳，優(yōu)良抗病基因多為稀有基因。因此，分離不同的抗病基因需要組配不同的群體。由于玉米染色體結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，抗病QTL位點(diǎn)的關(guān)鍵重組個(gè)體不易獲得?？共⌒誀钤谀攴?、地點(diǎn)間的變異很大，關(guān)鍵重組個(gè)體的性狀鑒定困難。現(xiàn)有的QTL精細(xì)定位方法不適用第26頁，共30頁，2023年，2月20日，星期二1)Variabilityinsymptomdevelopment

2)DifficultyinphenotypicevaluationGenotypeEnvironmentsGenotypeEnvironmentsPathogenMorphologicalTraitsDiseaseresistance第27頁，共30頁，2023年，2月20日，星期二基于重組個(gè)體后代測(cè)定的連續(xù)精細(xì)定位方法Recurrentparent×F1RecurrentparentMASBC2F1×RecurrentparentBC3F1ProgenyRecurrentparentBC3F1RecombinantsMASBCn+1F1ProgenyBCnF1RecombinantsDonorparentProgenytestingandMAS××F2

QTLanalysisBC1×RecurrentparentRecurrentparent×ProgenytestingandMASCompletionoffinemappingThesequentialQTLfine-mappingprocedureMAS:Marker-assistedselectionProgenytesting:Investigationofbothgenotypeandphenotypeforeachprogeny第28頁，共30頁，2023年，2月20日，星期二R:118S:132R:235S:74ResistantR:166S:139R:177S:133P-value<0.001P-value:0.675SusceptibleProgenyevaluationtodetectaQTLinthed