第四章微生物的遺傳變異

第四章微生物的遺傳變異第1頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)微生物的遺傳一、遺傳和變異的物質(zhì)基礎(chǔ)——DNA生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是什么？答案是DNA。親代將各種遺傳性狀通過DNA傳遞給子代，子代獲得DNA后形成一定的蛋白質(zhì)，將遺傳特性表現(xiàn)出來。第2頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二什么方法最終證明了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA呢？1.格里菲斯經(jīng)典轉(zhuǎn)化實驗（1928）及埃弗里、麥克勞德、麥卡蒂等人的轉(zhuǎn)化補充實驗（1941）。2.赫西和蔡斯大腸桿菌T2噬菌體感染大腸桿菌實驗。（1952）3.植物病毒拆分重建，F(xiàn)raenkel-Conrat（1956）（一）三個經(jīng)典轉(zhuǎn)化實驗第3頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二格里菲斯經(jīng)典轉(zhuǎn)化實驗（1928）——肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗R型菌（粗糙、無毒性）S型菌（光滑、有毒性）多糖類莢膜第4頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二將R型活菌注入小鼠體內(nèi)一段時間后第5頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二將S型活菌注入小鼠體內(nèi)一段時間后第6頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二將殺死的S型菌注入小鼠體內(nèi)一段時間后第7頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二將R型活菌與殺死的S型菌注入小鼠體內(nèi)一段時間后細(xì)菌發(fā)生轉(zhuǎn)化，性狀的轉(zhuǎn)化可以遺傳。第8頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二DNA蛋白質(zhì)多糖RNADNA是遺傳物質(zhì)（二）引起R型肺炎球菌轉(zhuǎn)化結(jié)果第9頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二二、遺傳物質(zhì)——DNA（一）DNA的結(jié)構(gòu)

1953年，Watson、Crick提出DNA的雙螺旋模型，為合理解釋遺傳物質(zhì)的各種功能奠定了基礎(chǔ)。

Watson—Crick模型是右手螺旋，堿基的平面對DNA分子的中軸是垂直的。第10頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二DNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)（1）脫氧核糖堿基磷酸AGCT基本單位－脫氧核苷酸第11頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二DNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)（2）A腺嘌呤脫氧核苷酸G鳥嘌呤脫氧核苷酸C胞嘧啶脫氧核苷酸T

胸腺嘧啶脫氧核苷酸脫氧核苷酸的種類第12頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二DNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)（3）連接

ATGCATGC第13頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二第14頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二（二）基因基因是一切生物體內(nèi)儲存遺傳信息的、有自我復(fù)制能力的遺傳功能單位。是ＤＮＡ分子上一個具有特定堿基順序，即核苷酸順序的片斷?；蚴蔷哂泄潭ǖ钠瘘c和終點的核苷酸或密碼的線性序列。第15頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二三、遺傳物質(zhì)的存在狀態(tài)(一)在真核生物中的存在狀態(tài)

1、染色體染色體DNA的分子量真核生物大于原核生物。真核生物的染色體為線狀結(jié)構(gòu)。DNA和組蛋白等蛋白結(jié)合。DNA中存在大量的不編碼DNA序列(如內(nèi)含子)。

第16頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二2、染色體外的DNA

——細(xì)胞器中的DNA真核微生物的染色體外的DNA主要存在細(xì)胞器中。細(xì)胞器包括葉綠體、線粒體等。其DNA分子結(jié)構(gòu)與原核生物的染色體相同，為環(huán)狀。具有獨立的復(fù)制能力。第17頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二(二)原核生物和病毒中的存在狀態(tài)1、染色體DNA細(xì)菌的遺傳物質(zhì)雙鏈環(huán)狀DNA;無組蛋白與其相結(jié)合;與細(xì)胞膜結(jié)合;只有一個復(fù)制啟始位點。病毒中則有DNA或RNA，雙鏈或單鏈，線狀或環(huán)狀。第18頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二2、質(zhì)粒質(zhì)粒（plasmid）：一種獨立于核基因組以外，具有自主復(fù)制能力的小型閉合環(huán)狀dsDNA分子。（1）定義大?。?.5~300kb，僅相當(dāng)于核基因組的1%，攜帶有數(shù)個到數(shù)十個甚至上百個基因。第19頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二可以游離態(tài)形式或附加體（episome）的形式存在；（2）性質(zhì)可轉(zhuǎn)移性；賦于細(xì)菌特殊功能；可消除性；具有自我復(fù)制能力。第20頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二（3）質(zhì)粒的主要種類質(zhì)粒所編碼的功能致育因子（Fertilityfactor，F(xiàn)因子）抗性因子（Resistancefactor，R因子）Col質(zhì)粒（colicinplasmid）Ti質(zhì)粒（tumorinducingplasmid）代謝質(zhì)粒（Metabolicplasmid）第21頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二四、遺傳過程共分成四個階段1.DNA的復(fù)制細(xì)胞將某特定段DNA鏈進行復(fù)制。2.mRNA的轉(zhuǎn)錄DNA雙鏈打開后，以單鏈為模板，按照堿基配對原則復(fù)制RNA。將DNA上的信息轉(zhuǎn)給RNA。第22頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二3.翻譯由tRNA完成。通過反密碼子與mRNA密碼子的互補，tRNA破譯氨基酸的密碼，進而將所需氨基酸送到核糖體處。4.蛋白質(zhì)的合成特定的堿基順序密碼送到核糖體，氨基酸按照順序連接在一起，在酶的作用下形成多肽鏈，進而形成蛋白質(zhì)，最終將遺傳信息表達出來。第23頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二基因突變（genemutation):泛指細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量突然發(fā)生的可遺傳的變化?；蛲蛔儶M義：基因突變（點突變）廣義：基因突變和染色體畸變一、基因突變第二節(jié)微生物的變異第24頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二二、突變類型（一）突變株的表型選擇性突變株營養(yǎng)缺陷型形態(tài)突變型條件致死突變型抗性突變性非選擇性突變株抗原突變型產(chǎn)量突變型（二）突變率：一般基因的自發(fā)突變率為10-6~-9第25頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二（三）突變的特性1、自發(fā)性和不對應(yīng)性2、自發(fā)突變概率低3、獨立性4、穩(wěn)定性5、誘變性6、可逆性第26頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二（一）自發(fā)突變機制背景輻射和環(huán)境因素；微生物自身有害代謝物的誘變效應(yīng)，如過氧化氫；互變異構(gòu)效應(yīng)——酮式至烯醇式。

三、基因突變的機理第27頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二一對堿基被另外的一對堿基置換。轉(zhuǎn)換(transition)：即DNA鏈中的一個嘌呤被嘌呤或嘧啶被嘧啶所置換。顛換(transversion)：即一個嘌呤被嘧啶或嘧啶被嘌呤所置換。（二）誘發(fā)誘變1、堿基的置換第28頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二2、移碼突變誘變劑使DNA分子中的一個或少數(shù)幾個核苷酸的增加或缺失，從而使后面的全部遺傳密碼發(fā)生轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯錯誤。第29頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二轉(zhuǎn)座因子(transposibleelement),跳躍基因(jumpinggene)可在染色體上移動，而且還可從一個染色體跳到另一個染色體，能改變自身位置的一段DNA順序，稱為-，或跳躍基因，或可移動基因。從基因組一個位置轉(zhuǎn)移到另一個位置---即轉(zhuǎn)位。轉(zhuǎn)位因子3、染色體畸變第30頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二四、DNA的損傷及其修復(fù)嘧啶嘧啶二聚體UV1、光復(fù)活作用嘧啶二聚體嘧啶光解酶第31頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二（二）切除修復(fù)（暗修復(fù)）（三）重組修復(fù)

從另外相同或相似的DNA分子上取得相應(yīng)的片段來修復(fù)損傷的DNA。這種修復(fù)DNA的雙鏈要重新排列組合，所以叫重組修復(fù)。（四）SOS修復(fù)——DNA緊急修復(fù)基因。第32頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二基因重組（遺傳重組）：指兩個基因組內(nèi)的遺傳基因，通過一定的途徑轉(zhuǎn)移到一起，形成新的穩(wěn)定基因組的過程。原核生物基因重組：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合和原生質(zhì)體融合。真核生物基因重組：有性雜交.準(zhǔn)性雜交.原生質(zhì)體融合。第三節(jié)微生物的基因重組第33頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二一、原核微生物的基因重組（一）轉(zhuǎn)化（transformation）

1、概念：轉(zhuǎn)化（作用）是受體菌直接吸收供體菌的DNA片段而獲得后者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)化因子：起轉(zhuǎn)化作用的供體細(xì)胞DNA片段。第34頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二2、轉(zhuǎn)化的特點1）轉(zhuǎn)化一般只發(fā)生在同一物種或近緣物種之間。目前只在肺炎雙球菌、大腸桿菌、芽抱桿菌屬、嗜血菌屬、假單胞桿菌屬等屬的某些菌種和少數(shù)真菌中發(fā)現(xiàn)。2）受體細(xì)胞只有處于感受態(tài)階段才能吸收供體的DNA（即轉(zhuǎn)化因子）。細(xì)菌處于感受態(tài)是因為其表面有一種吸附DNA的受體。

第35頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二

3、轉(zhuǎn)化過程：可分四步（1）供體DNA片段與受體細(xì)胞表面的膜結(jié)合，其中一條鏈被核酸酶水解，另一條進入細(xì)胞。（2）同源區(qū)內(nèi)發(fā)生基因重組，進入受體菌的一條DNA片段尋找同源區(qū)，在同源區(qū)進行基因重組。（3）基因重組的雜合區(qū)隨同受體DNA一起復(fù)制。（4）重組細(xì)胞分裂，形成一個轉(zhuǎn)化子和一個仍保持受體原來基因型的子代。

第36頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二轉(zhuǎn)化過程第37頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transductlo）

1、概念：以溫和噬菌體為載體，將供體菌的一段DNA轉(zhuǎn)移入受體菌，使受體菌獲得新的性狀。

轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象是辛德爾（N．Zinder）和萊德貝爾格（J．Lederberg）在1952年研究鼠傷寒沙門氏菌重組時發(fā)現(xiàn)的。由于絕大多數(shù)細(xì)菌都有噬菌體，因而轉(zhuǎn)導(dǎo)作用遠(yuǎn)較轉(zhuǎn)化作用普遍。2、分類

普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalizedtransduction）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)（restrictedtransduction）

第38頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二（1）普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalizedtransduction）概念：

通過噬菌體將供體菌任意DNA片段轉(zhuǎn)移至受體菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程

因為錯誤是隨機的，被包裝的DNA可以是供體菌染色體上的任何部分，故稱為普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)。第39頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二（2）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)

概念：前噬菌體兩側(cè)的宿主染色體基因轉(zhuǎn)移給受體菌的過程。

第40頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二（三）接合1、

概念：供體菌（“雄性”）通過性菌毛與受體菌（“雌性”）直接接觸，把F質(zhì)粒傳遞給后者，使后者獲得若干新遺傳性狀的現(xiàn)象。通過接合而獲得新遺傳性狀的受體細(xì)胞稱為接合子。

F+F-有質(zhì)粒,菌毛無質(zhì)粒,菌毛F+菌F–菌第41頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二2、接合的特點：

1）需要供體菌和受體菌的直接接觸；

2）是一種較為低級的有性生殖方式；

3）能發(fā)生接合作用的細(xì)菌大多數(shù)是革蘭氏陰性菌；如大腸桿菌及假單胞菌等。少數(shù)革蘭氏陽性菌，如鏈霉菌屬、諾卡氏菌屬等也能發(fā)生接合作用。

4）接合作用的雄性菌體內(nèi)含有性因子F因子，因而稱為雄性菌株，常用F+表示；雌性菌株缺少F因子，用F-表示。

5）F因子是一種染色體外的環(huán)狀DNA。第42頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二二、真核微生物的基因重組（一）有性雜交(sexualhybridization)

有性雜交指性細(xì)胞間的接合和隨之發(fā)生的染色體重組，并產(chǎn)生新的遺傳型后代的一種育種技術(shù)。

第43頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二（二）準(zhǔn)性雜交(parasexualreproduction)

有一類不產(chǎn)生有性孢子的絲狀真菌，不經(jīng)過減數(shù)裂就能導(dǎo)致低頻率基因重組并產(chǎn)生重組子生殖過程稱為準(zhǔn)性生殖。

第44頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二（三）原生質(zhì)融合

1、原生質(zhì)融合過程第45頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二2、操作步驟：

（1）加標(biāo)記或選擇具標(biāo)記親株

（2）制備原生質(zhì)體選擇合適的酶系

*制備原生質(zhì)體應(yīng)注意幾個問題:

①菌齡②酶濃度③酶處理時間及溫度

④pH

⑤滲透壓穩(wěn)定劑第46頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二（3）原生質(zhì)體融合

助融方法：化學(xué)：PEG(聚乙二醇)物理方法：激光、高壓脈沖電場第47頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二電融合法的過程

分為兩個階段：第一階段是原生質(zhì)體在電場的作用下，產(chǎn)生極化，排列成串球狀，細(xì)胞間兩兩相互粘連；第二階段是在高壓電場力的作用下，粘連成串的原生質(zhì)體的細(xì)胞膜磷脂雙分子層發(fā)生微團化，使生物膜自然的融合。第48頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二（4）原生質(zhì)體再生

（5）融合子的選擇

①直接法：將融合液涂布于不補充兩親株必須營養(yǎng)物（基礎(chǔ)培養(yǎng)基）或補充有兩種抗藥性標(biāo)記對應(yīng)藥物的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）上，直接篩選出雜合子。

②間接法：將融合液涂布于營養(yǎng)豐富的再生培養(yǎng)基上，使未融合的和融合的都生長出來，然后用影印法接種在對應(yīng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基或選擇培養(yǎng)基上，經(jīng)過對照選出雜合子。第49頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二一、誘變育種(breedingbyinducedmutation)

是通過人工方法處理微生物，使之發(fā)生突變，并運用合理的篩選程序和方法，把適合人類需要的優(yōu)良菌株選育出來的過程。（一）誘變育種的概念第四節(jié)人工構(gòu)建新菌株第50頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二（二）誘變育種的程序

性能測定出發(fā)菌株———→菌種純化———→制備斜面孢子或懸

活菌計數(shù)形態(tài)觀察———→誘變劑處理————→平板涂布————→挑變異

性能初測性能精測菌于平板培養(yǎng)————→斜面?zhèn)鞔糯笤囼灐N保藏并用于生產(chǎn)第51頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二

分為物理誘變劑、化學(xué)誘變劑和生物誘變劑三類：

1、物理誘變劑：物理誘變劑包括非電離輻射的紫外線、激光和離子束，還有能引起電離輻射的x射線、γ射線、快中子、α射線、β射線和超聲波等。

在微生物誘變育種中前四種較常用。

2、化學(xué)誘變劑：有十多種,如亞硝酸、硫酸二乙酯（DES）、亞硝基胍（NTG）、氮芥、乙烯亞胺、5-溴尿嘧啶、吖啶黃等。

對生物有“三致”作用：致突變、致畸變、致癌變。

（二）誘變劑的種類第52頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二（三）出發(fā)菌株的選擇

出發(fā)菌株即用于育種的原始菌株。選擇好出發(fā)菌株，相當(dāng)重要。（四）孢子（或菌體）懸浮液的制備

用生理鹽水或緩沖液來制備。第53頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二（五）性能測定

1、粗測(初篩)

例如：要測定某菌是否產(chǎn)生蛋白酶及其活力大小，可在酪素平板上看有無透明圈及其大小。

2、精測（復(fù)篩）

例如：

1）檸檬酸生產(chǎn)菌黑曲霉的選育:采用微量滴管接種,紙片培養(yǎng)方法,根據(jù)指示劑變色圈直徑的比值進行初篩；

2）蛋白酶生產(chǎn)菌醬油曲霉的選育:根據(jù)酪蛋白培養(yǎng)基上透明圈直徑和菌落直徑的比值進行復(fù)篩；

3）頭孢霉素生產(chǎn)菌的選育:按抑菌圈直徑和菌落直徑的比值進行復(fù)篩。

其結(jié)果與搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量一致，提高了篩選效率。第54頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二二、基因工程

是指基因水平下的遺傳工程，將某一生物體（供體）的遺傳信息在體外人工與載體相接(重組)，構(gòu)成重組DNA分子，然后轉(zhuǎn)入另一生物(受體)細(xì)胞中，使被引進的外源DNA片段在受體內(nèi)部得以表達和遺傳。第55頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二（一）基因工程技術(shù)的基本過程：

5、篩選出帶有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞1、目的基因DNA片段的準(zhǔn)備2、載體制備

3、含目的基因的DNA片段與載體相連接4、將重組分子送入受體細(xì)胞并于其中受制，擴增。第56頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二DNA重組技術(shù)圖示：第57頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二1973Cohen第一例成功的克隆實驗1978

Genentech公司人胰島素世界上第一種基因工程蛋白藥物；1982

第一個基因工程藥物--重組人胰島素在英、美獲準(zhǔn)使用；1985

第一批轉(zhuǎn)基因家畜（兔、豬和羊），中國轉(zhuǎn)基因魚；

（二）基因工程技術(shù)的成功應(yīng)用第58頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二1993基因工程西紅柿在美國上市；1997

英國羅斯林研究所多莉羊；1999.9

中國獲準(zhǔn)加入人類基因組計劃.負(fù)責(zé)測定人類基因組全部序列的1%；2000.6.26

科學(xué)家公布人類基因組工作草圖；2001.2.11

公布人類基因組基本信息。第59頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二（一）常見的菌種退化現(xiàn)象：1、菌落和細(xì)胞形態(tài)改變例如某些放線菌或霉菌在斜面上多次傳代后，產(chǎn)生“光禿”型，出現(xiàn)生長不齊或不產(chǎn)生孢子的退化。這種退化是不利于生產(chǎn)的。2、生產(chǎn)性能的下降：例如發(fā)酵菌株的發(fā)酵能力下降，代謝產(chǎn)物減少等，都是明顯的退化。3、對生長環(huán)境的適應(yīng)能力減弱：例如抗噬菌體菌株變?yōu)槊舾芯?，原來能利用某種物質(zhì)的能力降低等。

三、菌種的退化與保藏第60頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二（二）菌種退化的原因1．有關(guān)基因的自發(fā)突變2．育種后未經(jīng)很好的分離純化3．培養(yǎng)條件的改變4．污染雜菌

（三）防止退化的措施（復(fù)壯）

1.控制傳代次數(shù)，降低自發(fā)突變的幾率;2.創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件;3.利用不易衰退的細(xì)胞傳代;

4.采用有效的保藏方法;5.經(jīng)常進行分離純化。

第61頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二（四）菌種的保藏1、菌種保藏的基本原理

根據(jù)微生物的生理、生化特點，選用優(yōu)良菌株,最好是它們的休眠體,人工地創(chuàng)造適合于休眠的環(huán)境條件,即干燥、低溫、缺氧等,使微生物的代謝活動處于最低的狀態(tài)但又不至于死亡,從而達到保藏的目的。

2、菌種保藏的常用方法

一種好的菌種保藏方法，首先應(yīng)能長期保持菌種原有優(yōu)良性狀不發(fā)生變異，同時也應(yīng)考慮到方法本身的簡便和經(jīng)濟。第62頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二2、菌種保藏的常用方法

（1）斜面冰箱保藏法

將菌種接在適當(dāng)?shù)男泵嫔?，待其生長豐滿后，可放在4℃冰箱中保藏。此法一般可保藏3個月左右。各類菌種均可用此法進行保藏。

（2）半固體穿刺保藏法將菌種接入半固體直立柱中，然后進行培養(yǎng)。待長好后，放入4℃冰箱中保藏。此法可保藏半年左右，它適用于細(xì)菌、酵母的菌種保藏。第63頁，共67頁，2023年，2月20日，星期二3、石蠟油封存法將無菌石蠟油加入到上述保藏的菌種中，使菌種與空氣隔絕，則保藏效果更佳，一般可保藏三年左右。根據(jù)同樣的道理，用滅菌的橡皮塞代替原來的棉花塞，效果也是好的。