淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗

淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗第1頁/共31頁細胞培養(yǎng)概述細胞培養(yǎng)（cellculture）：從體內(nèi)取出組織或細胞，在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無菌、適宜溫度和一定營養(yǎng)條件下使其生長，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。細胞培養(yǎng)技術(shù)是生命科學(xué)中常用的研究手段，亦是生命科學(xué)各研究領(lǐng)域的基礎(chǔ)技術(shù)和基本技能。第2頁/共31頁細胞培養(yǎng)實驗的基本要求實驗前準(zhǔn)備：超凈臺紫外線消毒30min；無菌室每周消毒1-2次；所用器材要經(jīng)過嚴格消毒；操作前用消毒液浸泡手或用75%酒精擦拭。第3頁/共31頁實驗中要求：

?一切操作均要在火焰前方進行；瓶口、吸管使用前要經(jīng)過火焰消毒后使用。

?試劑瓶的瓶口應(yīng)斜放在支架上，試劑用后立即封閉瓶口。

?專管專用。?手不要從敞開的瓶口上方經(jīng)過。?換液時，吸取培養(yǎng)基的吸管不要觸及細胞培養(yǎng)瓶瓶口，以免把細胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細胞;

?細胞一旦購置或從別處引入，均應(yīng)及早留種凍存，一旦發(fā)生污染可重新復(fù)蘇培養(yǎng)第4頁/共31頁實驗后要求：關(guān)閉超凈臺風(fēng)機；用酒精紗布擦拭超凈臺臺面，紫外線消毒。第5頁/共31頁細胞培養(yǎng)條件合成培養(yǎng)基：根據(jù)體內(nèi)細胞生存所需的物質(zhì)種類和數(shù)量，用化學(xué)物質(zhì)模擬合成。常用的培養(yǎng)基有RPMI-1640、DMEM、IMDM等。血清：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清?？咕兀阂种瓶赡艽嬖诘募毦兔咕纳L，而不影響細胞的生長。常用青、鏈霉素；慶大霉素等。消化液（培養(yǎng)貼壁細胞用）：0.25%胰蛋白酶、EDTA液pH調(diào)整液NaHCO3溶液：常用濃度為5.6%和7.4%Hepes液：可較長時間保持較強的緩沖作用培養(yǎng)條件：無菌、３７℃、５％ＣＯ２第6頁/共31頁細胞培養(yǎng)基本技術(shù)細胞原代培養(yǎng)：從供體獲取組織細胞的首次培養(yǎng)。原代細胞離體時間短，在一定程度上能反映體內(nèi)的生長特性。適合作藥物測試、細胞分化和轉(zhuǎn)化等實驗研究。細胞傳代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)細胞長到一定密度時，需進行傳代培養(yǎng)。√懸浮生長細胞傳代：離心法√半懸浮生長細胞傳代：直接吹打法√貼壁生長細胞傳代：胰酶消化法第7頁/共31頁細胞的凍存、復(fù)蘇與運輸細胞的凍存10％DMSO（低溫保護劑），20％以上的血清，其余為培養(yǎng)基，細胞數(shù)1×106個-1×107個。二步凍結(jié)法。細胞的復(fù)蘇

從液氮罐中取出的凍存管，迅速投入37℃水浴中充分搖動，使其迅速融化。加入培養(yǎng)液離心后，棄上清，加培養(yǎng)液培養(yǎng)。細胞的運輸

長距離運輸：補充培養(yǎng)液至瓶頸部，保留微量空氣，擰緊瓶蓋；瓶口用膠帶密封，并用棉花包裹作防震、防壓處理。第8頁/共31頁細胞培養(yǎng)常見污染及處理方法細菌污染處理:將污染孔內(nèi)液體棄掉，加入硫酸銅或5mol/LNaOH;重要克隆洗滌數(shù)次后,大劑量聯(lián)用抗生素效果較好;反復(fù)洗滌后注射到小鼠腹腔中(限用于某些細胞)培養(yǎng)液變混濁，pH改變;細胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。第9頁/共31頁處理:應(yīng)用達克寧、咪唑康；處理CO2孵箱真菌污染培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯在細胞之間，有的呈鏈狀排列;細胞生長變慢，最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。第10頁/共31頁支原體污染難發(fā)現(xiàn),難去除;預(yù)防為主新一代支原體抗生素可殺滅支原體一般過濾除菌無法去除，光鏡下難以看清形態(tài)結(jié)構(gòu);能在偏堿條件下生存;對青霉素有抗藥性;多吸附于細胞表面或散在于細胞之間;多數(shù)細胞污染后無明顯變化如果發(fā)現(xiàn)破碎的細胞甚多，培養(yǎng)細胞需要頻繁改善營養(yǎng)環(huán)境才能支持長期傳代培養(yǎng)時，應(yīng)該懷疑支原體污染第11頁/共31頁掃描電鏡法顯示支原體，附于細胞表面眾多的圓形顆粒為支原體第12頁/共31頁處理:

更換血清;增加細胞的接種密度，以提高細胞的生存率黑膠蟲污染可以穿過濾膜.低倍鏡下為黑色點狀,高倍鏡下可見黑點游動;培養(yǎng)液一般不受影響;細胞增殖旺盛時可自然消失第13頁/共31頁淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗2010.12.21第14頁/共31頁淋巴細胞在體外培養(yǎng)時，受到刺激劑的刺激后可表現(xiàn)為細胞體積增大、代謝旺盛、蛋白質(zhì)和核酸合成增加，即向淋巴母細胞轉(zhuǎn)化和增殖。此現(xiàn)象稱為淋巴細胞轉(zhuǎn)化現(xiàn)象（簡稱為淋轉(zhuǎn)）。淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的高低可以反映機體的免疫水平，因此可作為測定機體免疫功能的指標(biāo)之一。原理第15頁/共31頁T細胞、B細胞表面具有抗原識別受體和有絲分裂原受體★植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA）可選擇性刺激T細胞增殖；★脂多糖（LPS）可刺激B細胞增殖；第16頁/共31頁作用于人和小鼠T/B淋巴細胞的重要絲裂原對T/B淋巴細胞的粗增殖作用人T細胞人B細胞小鼠T細胞小鼠B細胞刀豆蛋白A（ConAn）+_+_植物血凝素（PHA）+_+_美洲商陸（PWM）++++脂多糖（LPS）___+葡萄球菌A蛋白菌體（SAC）___+第17頁/共31頁分離人外周血單個核細胞（PBMC）分離人淋巴細胞(磁珠分離，流式細胞術(shù))淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗實驗流程第18頁/共31頁實驗流程

－－PBMC的分離基本原理：由于血液標(biāo)本中各種細胞比重不同，紅細胞、中性粒細胞比重為1.092，單個核細胞（淋巴細胞和單核細胞）比重為1.075－1.090；Ficoll比重為1.077±0.001。將血液標(biāo)本置于分層上，經(jīng)離心沉淀，比重高的紅細胞、多核白細胞沉于管底，而比重小的淋巴細胞和單核細胞懸浮于血漿和分層液的界面層中。第19頁/共31頁←ＰＢＭＣ←淋巴細胞分離液←紅細胞、粒細胞、血小板←血漿第20頁/共31頁實驗流程

－－淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗基本原理：在特異性抗原刺激下可使相應(yīng)淋巴細胞克隆發(fā)生增殖；有絲分裂原可作為多克隆刺激劑，使相應(yīng)淋巴細胞發(fā)生增殖。第21頁/共31頁形態(tài)計數(shù)法、MTT法、CCK-8法、同位素法。

（一）形態(tài)計數(shù)法：計數(shù)淋巴母細胞的比例，計算轉(zhuǎn)化百分率。

（二）MTT法：MTT是一種噻唑鹽?；罴毎麅?nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶以MTT為底物，形成藍色的甲臜（Formazan）顆粒沉積于細胞內(nèi)或細胞周圍，經(jīng)ＤＭＳＯ溶解后為紫色溶液，可用酶標(biāo)測定儀測定OD570的值。實驗流程

－－結(jié)果觀察第22頁/共31頁（四）3H-TdR摻入法：3H-TdR即胸腺嘧啶核苷，是DNA合成的前體。加入細胞培養(yǎng)液中后被細胞攝取作為DNA合成的原料。細胞合成的DNA越多，則所摻入的3H-TdR就越多。該方法與MTT比較，靈敏度高、準(zhǔn)確性好。（三）CCK-8(CellCountingKit-8)法:原理同ＭＴＴ法。是ＭＴＴ的升級替代產(chǎn)品，可被還原成橙黃色的甲臜，且為水溶性。本方法重復(fù)性好，靈敏度高，對細胞的毒性低。

實驗流程

－－結(jié)果觀察第23頁/共31頁第24頁/共31頁取靜脈血3ml,用PBS（吸管1）稀釋1倍（滴管1）（共6ml）將稀釋好的靜脈血沿管壁緩慢加入到淋巴細胞分離液（3ml）的上方（滴管1）,2000rpm,20min將滴管（滴管2）插入到白膜層，吸取單個核細胞層，轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入PBS（吸管1）至5ml,1500rpm,10min.棄上清，再洗滌細胞1次（吸管1）（滴管2）.離心之前計數(shù)細胞棄上清,加入完全培養(yǎng)基（吸管2）,重懸細胞（滴管2）.將細胞濃度調(diào)整為2*106個/ml.將細胞加入96孔板（加樣槍）,100ul/孔A組：加入不同濃度的ConA,100ul/孔.每個濃度為2復(fù)孔.留2個孔僅加入培養(yǎng)基，作為空白對照.

B組：加入100ulConA(10ug/ml),則終濃度為5ug/ml.4復(fù)孔.設(shè)空白對照.實驗步驟第25頁/共31頁A組：置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)66h,加入MTT溶液20ul/孔,繼續(xù)培養(yǎng)6hr后,去掉上清,加入DMSO100ul/孔,棄分混勻,測OD570nm值.

B組：置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)66h，制備流式標(biāo)本，上機檢測第26頁/共31頁細胞數(shù)/ml＝4大格中細胞總數(shù)4×104

×稀釋倍數(shù)第27頁/共31頁ConA的倍比稀釋10ug/ml5ug/ml2.5ug/ml450μL440μL220μL220μLOriginalsampletubetube1tube2220μLConA20ug/ml250ul加250