腫瘤生物治療進(jìn)展

腫瘤生物治療進(jìn)展第1頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二一、腫瘤生物治療概念的演變手術(shù)治療、放射治療（放療）、化學(xué)治療（化療）是應(yīng)用機(jī)械、物理和化學(xué)的原理來治療腫瘤.

生物治療是應(yīng)用生物大分子（細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)和肽）或調(diào)節(jié)生物反應(yīng)的小分子化合物來治療腫瘤。第2頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二1894,WilliamB.Coley,紐約外科醫(yī)生一位廣泛擴(kuò)散的肉瘤患者，其腫瘤部位發(fā)生鏈球菌感染腫瘤完全消退是否是由于鏈球菌感染而導(dǎo)致腫瘤消退呢？January12,1862–April16,1936Astory第3頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二Coley采取了大膽的行動(dòng)!注射活的鏈球菌治療沒有治愈希望的、不能手術(shù)的肉瘤患者腫瘤完全消退!第4頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二滅活的鏈球菌和變形桿菌的混合物（Coley毒素）對1000患者治療，約40%的到明顯的治療效果Coley與他的女兒Dr.HelenColeyNauts利用細(xì)菌成分活化免疫系統(tǒng)，可以誘導(dǎo)部分晚期腫瘤患者的持續(xù)緩解!!!Coley是腫瘤生物治療的鼻祖第5頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二現(xiàn)代腫瘤生物治療起始于1986年美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)干擾素上市?？共《究鼓[瘤第6頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二腫瘤的發(fā)生癌基因突變/抑癌基因缺失或基因表達(dá)調(diào)控失常，腫瘤細(xì)胞的信號通路與正常細(xì)胞的信號通路存在一定的差異。第7頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二

生物治療借助腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間的差異，以核酸、蛋白、細(xì)胞和小分子化合物為治療介質(zhì)，以腫瘤特異性信號通路為主要作用靶點(diǎn)，發(fā)展腫瘤選擇性強(qiáng)、毒副反應(yīng)低、高治療指數(shù)的治療技術(shù)和藥物。第8頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二有足夠的臨床證據(jù)表明，生物治療不僅能治療臨床可見的腫瘤，而且能延長腫瘤患者的生存期，改善預(yù)后。這種治療水平保障了生物治療成為繼手術(shù)、放療、化療之后的第四種腫瘤治療策略。第9頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二二、生物治療技術(shù)和藥物分類目前已用于臨床的生物治療技術(shù)和藥物主要包括：

細(xì)胞因子單克隆抗體免疫效應(yīng)細(xì)胞免疫刺激劑基因藥物和免疫毒素作用于特定分子靶點(diǎn)的非細(xì)胞毒性小分子藥物第10頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二三、免疫系統(tǒng)在抗腫瘤中的作用細(xì)菌：結(jié)核菌葡萄球菌真菌病毒：流感脊髓灰質(zhì)炎寄生蟲：絳蟲瘧原蟲蠕蟲攻擊防御第11頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二免疫系統(tǒng)---人體的防御體系清除細(xì)菌、病毒、外來異物；消除體內(nèi)衰老細(xì)胞以及發(fā)生突變的細(xì)胞(有的突變細(xì)胞會變成癌細(xì)胞)。對于健康的人來說，其免疫系統(tǒng)的強(qiáng)大足以及時(shí)清除突變的癌細(xì)胞。第12頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二機(jī)體免疫系統(tǒng)和癌細(xì)胞相互作用的結(jié)果決定了癌癥的最終演變。清除期平衡期逃逸期第13頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二對于癌癥病人來說，普遍存在免疫系統(tǒng)低下，不能有效地識別、殺滅癌癥細(xì)胞;另一方面，癌癥細(xì)胞的大量增殖會進(jìn)一步抑患者的免疫功能，而且癌癥細(xì)胞有多種機(jī)制來逃脫免疫細(xì)胞的識別與殺傷。第14頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二1.什么是免疫？我們生存在一個(gè)充滿復(fù)雜感染源的、敵對的世界里，我們的機(jī)體可以利用許多機(jī)制來防御外來微生物的侵襲，保護(hù)機(jī)體健康，這種防御能力被稱為免疫。

第15頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二免疫的類型天然免疫反應(yīng)：先天就具備的對某種病原體的免疫力,具有遺傳性，是機(jī)體抵御病原體侵襲的第一道防線；

獲得性免疫反應(yīng)：后天獲得、具有針對性、具有免疫記憶性。

第16頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二2.免疫系統(tǒng)的組成免疫器官：骨髓、胸腺、脾臟、淋巴結(jié)、扁桃體、小腸集合淋巴結(jié)、闌尾等；免疫組織：消化道、

呼吸道粘膜內(nèi)存在的許多無被膜的淋巴組織；免疫細(xì)胞：淋巴細(xì)胞、單核吞噬細(xì)胞等免疫分子：補(bǔ)體、免疫球蛋白、細(xì)胞因子等第17頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二3.免疫系統(tǒng)分布第18頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二免疫系統(tǒng)功能功能生理性(有利)病理性(不利)免疫防御防御病原微生物侵害超敏反應(yīng)/免疫缺陷免疫自穩(wěn)清除損傷或衰老的細(xì)胞自身免疫病免疫監(jiān)視清除復(fù)制錯(cuò)誤/突變細(xì)胞細(xì)胞癌變/持續(xù)感染第19頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二4.發(fā)揮免疫應(yīng)答的成員？免疫細(xì)胞免疫分子第20頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二天然免疫系統(tǒng)：肥大細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、中性/嗜堿性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞；特異性免疫細(xì)胞：T細(xì)胞、B細(xì)胞第21頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二對細(xì)胞殘片及病原體進(jìn)行噬菌（即吞噬以及消化），并激活淋巴細(xì)胞或其它免疫細(xì)胞，令其對病原體作出反應(yīng)。在抗腫瘤免疫中，巨噬細(xì)胞具有抗原遞呈功能，參與調(diào)節(jié)T細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答。作為清道夫細(xì)胞清除機(jī)體死亡細(xì)胞和細(xì)胞碎片。巨噬細(xì)胞（M）第22頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二在不同組織中其名稱不同細(xì)胞名稱位置肺泡巨噬細(xì)胞肺泡組織細(xì)胞結(jié)締組織庫佛氏細(xì)胞肝神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)組織上皮樣細(xì)胞肉芽腫蝕骨細(xì)胞骨竇內(nèi)皮細(xì)胞脾系膜細(xì)胞腎第23頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二粒細(xì)胞:

中性粒細(xì)胞-吞噬并殺滅病原微生物；嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞-抵抗寄生蟲，與過敏反應(yīng)有關(guān)。顆粒中含有多種酶和毒性蛋白，在細(xì)胞活化時(shí)釋放并殺滅病原體。第24頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二DC細(xì)胞攝取病原體后變?yōu)槌墒斓腄C細(xì)胞初始T細(xì)胞活化的T細(xì)胞DC是天然免疫和獲得性免疫應(yīng)答之間的橋梁

樹突狀細(xì)胞(DC)第25頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二天然免疫獲得性免疫DCDC是天然免疫和獲得性免疫應(yīng)答之間的橋梁

第26頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二淋巴細(xì)胞:

TBNK獲得性免疫天然免疫第27頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二紅細(xì)胞淋巴細(xì)胞:小,無特征HE染色電鏡觀察無功能活性---初始淋巴細(xì)胞

遇到抗原后,成為活化的淋巴細(xì)胞,并進(jìn)一步分化為全功能的淋巴細(xì)胞,即效應(yīng)淋巴細(xì)胞。

第28頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二B淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞)T淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)B-細(xì)胞受體(BCR)抗體-免疫球蛋白膜型免疫球蛋白T-細(xì)胞受體(TCR)殺傷活化調(diào)節(jié)獲得性免疫細(xì)胞記憶性T細(xì)胞記憶性B細(xì)胞第29頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二活化殺傷病毒或胞內(nèi)病原體感染的細(xì)胞---CD8+T細(xì)胞輔助性T細(xì)胞為其它細(xì)胞的活化和功能提供必須的信號---CD4+T細(xì)胞調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制其它淋巴細(xì)胞的活性并協(xié)助控制免疫應(yīng)答效應(yīng)性T細(xì)胞調(diào)節(jié)殺傷第30頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二自然殺傷細(xì)胞

（Naturalkillercells，NK）形態(tài)比T、B細(xì)胞大，胞質(zhì)中有特殊的顆粒，含有毒性蛋白,不需要特異性免疫刺激，即能夠在體外殺傷某些腫瘤細(xì)胞系。是天然免疫的重要成員,在獲得性免疫應(yīng)答之前對控制病毒感染非常重要；在外周血單個(gè)核細(xì)胞中占10%-15%，淋巴結(jié)和組織中較少。第31頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二不表達(dá)抗原特異性受體，也不形成免疫記憶。第32頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二NK細(xì)胞是機(jī)體早期抗病毒的重要成員第33頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二四、抗腫瘤免疫機(jī)制免疫細(xì)胞如何發(fā)揮抗腫瘤作用？第34頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二免疫系統(tǒng)識別“自我”與“非我”腫瘤細(xì)胞表達(dá)腫瘤抗原第35頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二1.什么是腫瘤抗原？腫瘤特異性抗原(TSA):僅在腫瘤細(xì)胞上表達(dá);腫瘤相關(guān)性抗原(TAA):在某些腫瘤細(xì)胞上表達(dá)，也在某些正常細(xì)胞上表達(dá)。泛指在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中新出現(xiàn)或過度表達(dá)的抗原物質(zhì)。第36頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二機(jī)體產(chǎn)生腫瘤抗原的可能機(jī)制為：①基因突變；②細(xì)胞癌變過程中使原本不表達(dá)的基因被激活；③抗原合成過程的某些環(huán)節(jié)發(fā)生異常（如糖基化異常導(dǎo)致蛋白質(zhì)特殊降解產(chǎn)物的產(chǎn)生）；④胚胎時(shí)期抗原或分化抗原的異常、異位表達(dá)；⑤某些基因產(chǎn)物尤其是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的過度表達(dá)；⑥外源性基因（如病毒基因）的表達(dá)。

第37頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二1．感應(yīng)階段：

1）抗原遞呈細(xì)胞（APC）對外源性抗原的加工、處理、遞呈2）T細(xì)胞對抗原的識別2.反應(yīng)階段3.效應(yīng)階段2.獲得性細(xì)胞免疫應(yīng)答的基本過程第38頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二APC感應(yīng)階段反應(yīng)階段效應(yīng)階段抗原遞呈細(xì)胞CD8+T第39頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二抗原遞呈功能MHC限制性APCAPC第40頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二B細(xì)胞漿細(xì)胞（產(chǎn)生抗體）T細(xì)胞細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）輔助性T細(xì)胞(Th)感染部位滯留在淋巴組織中活化B細(xì)胞骨髓產(chǎn)生抗體釋放到血液中效應(yīng)細(xì)胞第41頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二CTL細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答可直接殺傷腫瘤細(xì)胞;Th細(xì)胞可以活化免疫系統(tǒng)的其它成分，在控制具有免疫原性腫瘤細(xì)胞的生長中起重要的作用。第42頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二（1）CTL殺傷靶細(xì)胞的機(jī)制靶細(xì)胞CTL循環(huán)凋亡解離CTL胞外分泌顆粒CTL與靶細(xì)胞結(jié)合CTL細(xì)胞質(zhì)重排第43頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二(2)體液免疫體液免疫為B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，B細(xì)胞受抗原刺激后活化、增殖、分化，形成漿細(xì)胞并分泌抗體，由于主要是血清或血漿中的抗體發(fā)揮免疫效應(yīng)，故稱為體液免疫。第44頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二抗體的抗腫瘤機(jī)制?第45頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二A.激活補(bǔ)體系統(tǒng)溶解腫瘤細(xì)胞第46頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二跨膜孔道第47頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二B.抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)第48頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二C.抗體的調(diào)理作用腫瘤細(xì)胞巨噬細(xì)胞抗體與腫瘤細(xì)胞表面的相應(yīng)抗原結(jié)合溶酶體被調(diào)理的腫瘤細(xì)胞結(jié)合到M的FcR上，并被M吞噬形成吞噬體吞噬溶酶體形成，殺傷腫瘤細(xì)胞抗體第49頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二D.抗體的封閉作用細(xì)胞惡變后其表面可過表達(dá)某些受體，這些受體與其相應(yīng)的配體結(jié)合后可刺激腫瘤細(xì)胞生長。針對這些受體的抗體可通過封閉腫瘤細(xì)胞表面的受體阻礙其功能，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。第50頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二E.抗體改變腫瘤細(xì)胞的粘附特性

抗體與腫瘤細(xì)胞膜表面的抗原結(jié)合后，可干擾腫瘤細(xì)胞的粘附特性，阻止其克隆形成及與血管內(nèi)皮的粘附，從而有助于控制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。第51頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二抗腫瘤抗體雖然能夠通過上述幾種方式發(fā)揮作用，但一般認(rèn)為，體液免疫在抗腫瘤免疫中只處于從屬地位。細(xì)胞免疫在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用第52頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二3.天然免疫應(yīng)答（1）自然殺傷細(xì)胞（NK）NK是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，對于抗腫瘤、抗病毒感染非常重要。第53頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二NK細(xì)胞抗腫瘤機(jī)制A.釋放毒性顆粒:NK細(xì)胞含有毒性酶，穿孔蛋白-穿孔素，穿透細(xì)胞膜并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。NK靶細(xì)胞第54頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二B.細(xì)胞因子介導(dǎo)的腫瘤抑制作用:活化的NK細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子,如IFN-,TNF-/,GM-CSF,IL-12。干擾素(IFN-)抑制細(xì)胞增生，引起多種腫瘤細(xì)胞凋亡,抗腫瘤新生血管形成，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，是巨噬細(xì)胞主要的活化因子。第55頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二C.抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)第56頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二（2）巨噬細(xì)胞（M)活化的M與腫瘤細(xì)胞結(jié)合后通過溶酶體酶等直接殺傷腫瘤細(xì)胞；第57頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二活化的M還可分泌TNF、NO等細(xì)胞毒性因子而間接殺傷腫瘤細(xì)胞；抗原遞呈作用殺傷腫瘤分泌細(xì)胞因子IL-1IL-6TNF-IL-8GM-CSF酶溶菌酶酸性水解酶賴氨酸酶酯酶膠原蛋白酶彈性纖維蛋白酶前列腺素補(bǔ)體成分纖維蛋白結(jié)合蛋白凝血因子其它因子第58頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二M還可通過ADCC殺傷腫瘤細(xì)胞巨噬細(xì)胞活化的巨噬細(xì)胞第59頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二作為遞呈抗原的APC，活化T細(xì)胞；抗原T細(xì)胞受體T淋巴細(xì)胞抗原遞呈細(xì)胞（M）抗原肽T淋巴細(xì)胞T細(xì)胞受體MHC-抗原肽復(fù)合物第60頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二五、過繼性免疫效應(yīng)細(xì)胞治療過繼性免疫效應(yīng)細(xì)胞治療（Adoptivecellularimmunotherapy，ACI）是轉(zhuǎn)輸體外培養(yǎng)、修飾的效應(yīng)細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞和其它免疫細(xì)胞，治療疾病。細(xì)胞治療可以被認(rèn)為是利用自體或異體細(xì)胞，替換、修復(fù)或增強(qiáng)受損傷組織的或系統(tǒng)的生物功能的一種策略。第61頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二第62頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二ACI治療腫瘤：具有抗腫瘤活性的免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)輸給腫瘤患者，清除術(shù)后和化療后的殘留腫瘤細(xì)胞；

預(yù)防復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，根治腫瘤；毒副作用低，特異性高；是聯(lián)合治療腫瘤的重要部分。第63頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二I.非特異性免疫細(xì)胞NK細(xì)胞巨噬細(xì)胞DCsLAKsCIKsTLR激動(dòng)劑刺激免疫細(xì)胞II.抗原特異性T細(xì)胞CTLTILACI的類型：第64頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二I.非特異性免疫細(xì)胞第65頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二1.NK細(xì)胞用于過繼轉(zhuǎn)輸?shù)?6頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二Science.2011,7;331(6013):44–49.NK細(xì)胞被認(rèn)為是抗腫瘤免疫的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞

第67頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二腫瘤可以發(fā)展多種機(jī)制逃逸NK細(xì)胞的攻擊或者誘導(dǎo)NK細(xì)胞功能缺陷

NK細(xì)胞在腫瘤患者中功能低下JBiomedicineandBiotechnology,2011免疫監(jiān)視功能缺陷免疫抑制第68頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二Systemadministration細(xì)胞因子自體NK細(xì)胞(IL-2,IL-12,IL-15,IL-18,IL-21,typeIIFNs，免疫調(diào)節(jié)藥物

)體內(nèi)活化NK細(xì)胞治療腫瘤的策略

抗體(anti-HER-2MAb;anti-CD20MAb;anti-EGFRMab)InfusionADCC第69頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二NATUREIMMUNOLOGY2008,9(5):486In1980第70頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二Table2ClinicaltrialsusingstrategiestomodulateNKcellfunctions(continued)第71頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二Table2ClinicaltrialsusingstrategiestomodulateNKcellfunctions(continued)Rituximab:anti-CD20;Trastuzumab:anti-HER2;Daclizumab:anti-IL-2Ra第72頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二Exvivo自體NK細(xì)胞單倍體相合的NK細(xì)胞細(xì)胞因子(IL-2,IL-12,IL-15,IL-18,IL-21,type-1IFNs，免疫調(diào)節(jié)藥物

)通過細(xì)胞因子刺激,腫瘤患者的本身的NK細(xì)胞難于有效回復(fù)抗腫瘤功能

自身免疫細(xì)胞在體外活化第73頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二NK細(xì)胞的臨床應(yīng)用(1)原代NK細(xì)胞通過免疫磁珠的方法純健康供體NK細(xì)胞,這些NK細(xì)胞具有正常的細(xì)胞表面標(biāo)志、胞內(nèi)細(xì)胞因子、穿孔素和顆粒酶B。第74頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二供者患者第75頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二過繼轉(zhuǎn)輸原代NK細(xì)胞原代NK細(xì)胞在體外擴(kuò)增和活化13-21天,大大提高轉(zhuǎn)移的腎細(xì)胞癌患者的臨床反應(yīng)。第76頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二NK細(xì)胞在外周血中的比例低(10–15%)，不能持續(xù)增殖；產(chǎn)生高純度的、大量的自體或異基因活化NK細(xì)胞非常難，并費(fèi)時(shí)、費(fèi)力；每個(gè)患者或者供者的NK的差異性對臨床常規(guī)治療帶來困難。

障礙/困難第77頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二YT,

NK-YS,HANK-1,NK-92,NKL,KHYG-1，NKG(2)NK細(xì)胞系JapanEBV-positiveWesterncountriesChina第78頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二NK-92cellsNK-92cell:CD56brightCD16-高效廣譜抗腫瘤作用，表達(dá)大量活化型受體；高水平表達(dá)與細(xì)胞凋亡途徑有關(guān)的分子及細(xì)胞毒效應(yīng)分子；對惡性黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、白血病淋巴瘤等都具有高效的殺傷活性。第79頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二NK-92細(xì)胞容易大量擴(kuò)增，適合標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)，已經(jīng)用于臨床試驗(yàn)，是目前最強(qiáng)的、適于臨床應(yīng)用的NK細(xì)胞系。第80頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二NKcelllineInstrumentCulturemediumCytokineinmediumStartingcellnumberCultureTime(days)HarvestedcellnumberViabilityNK-921-LVuelifeculturebag

EX-Vivo10serum-freemedia+aminoacidsand2.5%humanABplasmaIL-2(500IU/ml)(2.5×105/ml)×25ml/bag15-17>1×109/bag≥80%ControlledstirredbioreactorOptimizedclinicl-grademediaIL-2(100~500IU/ml)1×107/bioreactor11-16>1010/bioreactor>95%NKG*WAVEBioreactorα-MEMmedium10%fetalbovineserum+10%horseserumIL-2(100IU/ml)(1×105/ml)×200ml/bag12-14>1010/bag>90%NKLPlatesorFlasksRPMI1640medium10%heat-inactivatedhumanABserumIL-2(100pM)----KHYG-1PlatesorFlasksRPMI1640medium2%humanlow-toxicityABserumIL-2(450IU/ml)----大規(guī)模培養(yǎng)臨床應(yīng)用NK細(xì)胞系第81頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二2.淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞（LAK）1980年,Rosenberg及其同事建立了一種IL-2刺激產(chǎn)生大量的淋巴細(xì)胞的新方法,這些淋巴細(xì)胞可以殺傷新鮮的、沒有培養(yǎng)的、原代轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞。LAK細(xì)胞是細(xì)胞毒性效應(yīng)淋巴細(xì)胞，其細(xì)胞毒活性不受MHC限制，能夠殺傷原代腫瘤細(xì)胞和NK抵抗的腫瘤細(xì)胞系,在功能上與NK細(xì)胞不同。第82頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二LAK細(xì)胞表現(xiàn)出較好的耐受性，以一定的間隔時(shí)間重復(fù)輸注，以保持一定數(shù)量的新鮮的LAK細(xì)胞。1984年,Rosenberg及其同事被FDA批準(zhǔn)，IL-2和LAK用于治療25例腫瘤患者，包括腎細(xì)胞癌、黑色素瘤、肺癌或結(jié)腸癌。第83頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二LAK細(xì)胞的制備：腫瘤患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）在體外擴(kuò)增，IL-2刺激，培養(yǎng)約5天。培養(yǎng)后的LAK是異質(zhì)性的，含有CD3-CD56+,CD3+CD56+和CD3+CD56-細(xì)胞；其中CD3+CD56+T和CD3?CD56+NK細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞殺傷作用。第84頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二臨床研究證明,LAK細(xì)胞對轉(zhuǎn)移性腫瘤如腎細(xì)胞癌和黑色素瘤有一定療效。第85頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二LAK/IL-2的主要限制是其毒性：

全身應(yīng)用IL-2通常是造成副作用的主要原因，包括煩躁,發(fā)熱,寒冷,頭痛,惡心,嘔吐,皮疹,水腫，25%患者可以發(fā)生副反應(yīng)。男性呼吸道窘迫綜合征、肝臟毒性和脈管炎有報(bào)道。第86頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二3.細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK）CIK是通過培養(yǎng)外周血淋巴細(xì)胞(PBL)，培養(yǎng)第一天在培養(yǎng)基中加入IFN-1000u/ml,24小時(shí)后加入抗CD3抗體50ng/ml和IL-2300IU/ml。定期加入IL-2,培養(yǎng)基常規(guī)性換液，培養(yǎng)21–28天。第87頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二患者淋巴細(xì)胞體外患者自體CIK第88頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二CIK細(xì)胞中CD3+CD4+(37.4%)、CD3+CD8+(64.2%);CD3?CD56+NK細(xì)胞含量小(～2%)，培養(yǎng)14天時(shí)，37.7%為CD3+CD8+CD56+的

自然殺傷T(NKT)細(xì)胞，是CIK中最強(qiáng)的細(xì)胞毒性細(xì)胞。與LAK細(xì)胞相比，CIK細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞毒活性更強(qiáng)；CIK細(xì)胞在識別和殺傷靶細(xì)胞時(shí)是非MHC限制性的。第89頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二CIK的第一例臨床試驗(yàn)是在1999年，由Schmidt-Wolf等在德國進(jìn)行，自體CIK細(xì)胞轉(zhuǎn)入IL-2基因，轉(zhuǎn)述給10例腫瘤患者，包括轉(zhuǎn)移性腎癌、結(jié)腸癌和淋巴瘤。其中，1例患濾泡性淋巴瘤者完全緩解。除了3例患者有發(fā)熱的癥狀外，沒有嚴(yán)重的副反應(yīng)。第90頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二一項(xiàng)來自中國的報(bào)道，用CIK輔助治療急性白血病,19例接受1–4個(gè)療程自體CIK細(xì)胞輸注聯(lián)合化療的患者中,73.4%在隨后的4年中維持持續(xù)緩解,只作化療的患者僅為27.3%。作為免疫治療方式,CIK治療腫瘤量較小的患者有效或者作為輔助治療,不適合用于治療腫瘤量較大的患者。第91頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二CIK的機(jī)制:釋放炎癥因子,如IFN,TNF,穿孔素,顆粒酶B殺傷腫瘤細(xì)胞;通過Fas-FasL途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。CIK已經(jīng)成功用于臨床治療胃癌、結(jié)腸癌、淋巴瘤、白血病等。

第92頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二第93頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二II.抗原特異性T細(xì)胞第94頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二T細(xì)胞在抗腫瘤的免疫應(yīng)答中細(xì)胞免疫起著主要作用，特別是CTL，它是抗腫瘤免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，故也應(yīng)是用于過繼免疫治療的最佳細(xì)胞。第95頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二T細(xì)胞活化抗原遞呈細(xì)胞腫瘤細(xì)胞腫瘤抗原腫瘤抗原表達(dá)識別與殺傷腫瘤細(xì)胞抗原的識別與遞呈淋巴結(jié)CD8+T細(xì)胞CD8+T細(xì)胞血液循環(huán)腫瘤血管遷移第96頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二Flood發(fā)現(xiàn)CTL在體內(nèi)聚集到腫瘤部位的能力強(qiáng)于LAK和NK，且能特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞。第97頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二實(shí)驗(yàn)顯示，腫瘤疫苗在體內(nèi)應(yīng)用可增加體內(nèi)的腫瘤特異性CTL的數(shù)量，但到一定水平時(shí)候，體內(nèi)的CTL到達(dá)平穩(wěn)期而不再增加，這主要是由于體內(nèi)存在的特異性及非特異性免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)限制了CTL的擴(kuò)增。所以，利用細(xì)胞因子或免疫刺激劑直接活化腫瘤患者體內(nèi)CTL受到限制。第98頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二在體外培養(yǎng)可突破此調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，大量擴(kuò)增免疫效應(yīng)細(xì)胞。第99頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二轉(zhuǎn)輸抗原特異性T細(xì)胞因?yàn)槟[瘤相關(guān)抗原TAA是“自身”抗原，免疫系統(tǒng)難于識別；腫瘤患者體內(nèi)難于產(chǎn)生對腫瘤應(yīng)答的T細(xì)胞,甚至在體外最佳條件下也難于大規(guī)模培養(yǎng)。第100頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二4.腫瘤浸潤的淋巴細(xì)胞(TIL)1986年,Rosenberg及其同事應(yīng)用TIL在小鼠模型中證明,聯(lián)合自體TIL和環(huán)磷酰胺可以緩解腫瘤轉(zhuǎn)移。之后很快在1988年首次報(bào)道了利用TIL治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤能夠誘導(dǎo)腫瘤緩解。第101頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二如何制備TIL?大約需要5–6周第102頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二TIL增殖:粘附的腫瘤細(xì)胞死亡或被淋巴細(xì)胞殺死而消失生長2–4周鑒定TIL殺傷腫瘤的活性直徑大于2cm的活檢腫瘤組織，剪碎，培養(yǎng)基中快速擴(kuò)增:

抗CD3抗體,IL-2和滅活的同種異體PBMCs飼養(yǎng)細(xì)胞，2周轉(zhuǎn)輸患者挑選應(yīng)答最強(qiáng)的細(xì)胞克隆第103頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二維持TIL的存活，誘導(dǎo)腫瘤消失清除淋巴細(xì)胞，減少與

TIL競爭細(xì)胞因子,如IL-7和IL-15;清除內(nèi)源性Treg.第104頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二

六、TLR配體激活的免疫效應(yīng)細(xì)

什么是TLR？Toll-likereceptor，Toll樣受體。是一類模式識別受體，能夠識別微生物的特異性成分和某些宿主分子，構(gòu)成防御很多病原體的第一道防線，在天然免疫系統(tǒng)中起著決定性的作用。此外，TLR連接天然免疫與獲得性免疫。第105頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二已經(jīng)鑒定的人TLRs有11種細(xì)胞膜內(nèi)體第106頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二TLR1廣泛表達(dá)于單核細(xì)胞、T和B淋巴細(xì)胞、DC細(xì)胞、多形核白細(xì)胞、NK細(xì)胞；TLR2/4/5主要分布于除T、B、NK細(xì)胞以外的免疫細(xì)胞；TLR3主要表達(dá)于未成熟的DC等；TLR7-TLR9主要表達(dá)于單核細(xì)胞、DC細(xì)胞核巨噬細(xì)胞。第107頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二第108頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二TLRs與腫瘤免疫治療第109頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二

腫瘤免疫逃逸的策略12345免疫抑制分子招募Treg共刺激分子缺失促凋亡分子第110頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二通過活化TLRs激活免疫系統(tǒng)，打破腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制狀態(tài)，發(fā)揮抗腫瘤作用。作為腫瘤生物治療的關(guān)鍵問題是打破腫瘤導(dǎo)致的免疫耐受狀態(tài)！第111頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二TLR配體已經(jīng)通過多種途徑應(yīng)用外用乳膏

靜脈注射

口服

瘤內(nèi)注射

皮下注射

第112頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二TLR3,4,7/8和TLR9激動(dòng)劑被列入美國國立癌癥研究所（NCI）免疫治療腫瘤藥物，具有強(qiáng)大的抗腫瘤潛力。第113頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二1.TLR-7激動(dòng)劑(1)天然ssRNA及其衍生物:

通過內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，然后與TLR-7相互作用。TLR7ssRNA：單鏈RNA第114頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二DC產(chǎn)生IL-12和I型IFN活化NK細(xì)胞，產(chǎn)生IFN-并增強(qiáng)細(xì)胞毒作用殺傷腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤生長TLR-7激動(dòng)劑ssRNA機(jī)制:第115頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二(2)合成的TLR7激動(dòng)劑Imiquimod(咪喹莫特):HPV-相關(guān)的皮膚惡性腫瘤

(淺表性基底細(xì)胞癌

sBCC),III期臨床研究表明組織學(xué)清除率為79–82%；癌變前的光線性角化病治療。外用乳膏

第116頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二機(jī)制:誘導(dǎo)細(xì)胞因子如IFN-γ和IL-12產(chǎn)生;增強(qiáng)腫瘤特異性CTLs的活化；活化具有殺傷活性的mDC亞群的活化。第117頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二

有20項(xiàng)臨床試驗(yàn)在進(jìn)行,Imiquimod有做疫苗佐劑的臨床試驗(yàn)有10項(xiàng)。第118頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二PolyI:C(多聚肌苷酸-胞苷酸),合成的病毒dsRNA類似物誘導(dǎo)I型IFNs的產(chǎn)生分子式:(C10H13N4O8P)x.(C9H14N3O8P)x2.TLR3激動(dòng)劑dsRNA：雙鏈RNA第119頁，共135頁，2023年，2月20日，星期二成熟DC,其活化抗原特異性T細(xì)胞的能力增強(qiáng),CD4+T細(xì)胞向Th1方向分化，分泌大