細(xì)胞篩選個(gè)人

細(xì)胞精選一嘌呤霉素(一)確立最優(yōu)精選濃度當(dāng)用于精選特定細(xì)胞的嘌呤霉素合適濃度未知時(shí)，需進(jìn)行滴定，或擬定針對(duì)那種細(xì)胞的嘌呤霉素殺菌曲線。一般而言，嘌呤霉素濃度范圍在2-10微克/毫升時(shí)是足以殺滅大多數(shù)未轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。培養(yǎng)待轉(zhuǎn)染（而不是轉(zhuǎn)染后）的細(xì)胞。（精選的目的是殺滅未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)遠(yuǎn)的細(xì)胞（一般在鋪滿培養(yǎng)器皿底部的70%~80%時(shí)），用新鮮無抗無血清的培養(yǎng)基制成1.5×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。向96孔培養(yǎng)板中加細(xì)胞懸液，每孔100微升（使每孔細(xì)胞數(shù)在1.5×104個(gè)），爾后向每孔加新鮮無抗無血清的培養(yǎng)基合適，培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)過夜。（這樣做是為了保證在固定細(xì)胞密度下確立最正確G418藥物精選濃度。）4.第二天用嘌呤霉素濃度分別為0,2,4,6,8,10微克/毫升的新鮮無抗無血清培養(yǎng)基溶液代替各孔中的舊的培養(yǎng)基。（每個(gè)濃度可用兩個(gè)復(fù)孔，相當(dāng)于每個(gè)濃度測(cè)定三次）。（注意：對(duì)于多數(shù)細(xì)胞種類而言，過分的嘌呤霉素能引起好多非必需的表型的反應(yīng)。）每日檢查細(xì)胞活力，依照細(xì)胞活力，每三天(即每隔兩天)更換含嘌呤霉素的新鮮無抗無血清培養(yǎng)基溶液一次。如細(xì)胞生長(zhǎng)過快，能夠縮短換液時(shí)間（每隔一天）。在正常的實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程時(shí)，一種細(xì)胞最優(yōu)精選濃度的確馬上間隨細(xì)胞的生長(zhǎng)率和一般生計(jì)時(shí)間而定，大概需3到14天。在所需時(shí)間此后，嘌呤霉素的以致所有細(xì)胞死亡的最小濃度就是應(yīng)該用于該細(xì)胞和該實(shí)驗(yàn)的濃度。最優(yōu)濃度為在3-5天內(nèi)殺死所有細(xì)胞的濃度。(二)轉(zhuǎn)染細(xì)胞第一天：在60mm培養(yǎng)皿內(nèi)種植細(xì)胞，細(xì)胞密度為能使第二天細(xì)胞交融能達(dá)到70%-80%的密度，CO2孵箱過夜培養(yǎng)。第二天：準(zhǔn)備3ml無抗生素?zé)o血清培養(yǎng)基，加入Polybrene使其終濃度為8μg/ml。將已經(jīng)制備的病毒顆粒0.5ml加至上述培養(yǎng)基，輕吹混勻。去除60mm培養(yǎng)皿內(nèi)的舊的培養(yǎng)基，加入含病毒培養(yǎng)基。（Polybrene能夠增加病毒感染的效率，可是，有時(shí)Polybrene對(duì)細(xì)胞有毒性。這時(shí)，能夠用ProtamineSulfate代替Polybrene）(三)精選細(xì)胞病毒感染后24小時(shí)，能夠換用含最優(yōu)濃度puromycin的培養(yǎng)基。若是病毒對(duì)細(xì)胞有毒性，能夠減少感染時(shí)間至4-6小時(shí)，爾后換用新鮮培養(yǎng)基，24-48小時(shí)后換加含最優(yōu)濃度puromycin的培養(yǎng)基。最好成立一個(gè)比較皿，不加病毒液，加入Ploybrene，觀察Polybrene可否對(duì)細(xì)胞有毒性；若是Polybrene沒有毒性，還可以夠加入puromycin，作為puromycin可否有效的比較。今后每隔一天換用新鮮含puromycin的無抗生素?zé)o血清培養(yǎng)基，以代替含大量死細(xì)胞的培養(yǎng)基。直到抗性群落能被鑒別出（一般是在精選后10到12天）。待抗性細(xì)胞長(zhǎng)滿今后，細(xì)胞轉(zhuǎn)入10cm培養(yǎng)皿，同時(shí)，留一部分細(xì)胞在原來的60mm平皿內(nèi)。60mm平皿內(nèi)細(xì)胞長(zhǎng)滿后，收獲細(xì)胞，在蛋白或mRNA水平判斷基因敲低效率。10cm培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)胞待長(zhǎng)滿后傳代，第一每種牢固細(xì)胞系凍存4-5支細(xì)胞，待基因敲低判斷清楚后，解凍凍存細(xì)胞，進(jìn)行表型觀察解析。平時(shí)情況下，由于慢病毒為復(fù)制弊端型病毒，受感染的細(xì)胞不能夠產(chǎn)生新的病毒，因此從加入病毒顆粒開始，經(jīng)過5-6次換液后，培養(yǎng)基內(nèi)已不存在病毒顆粒，能夠移至一般細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)研究。G418(一)確立最優(yōu)精選濃度由于每種細(xì)胞對(duì)G418的敏感性不相同，而且不相同的廠家生產(chǎn)的相同濃度的G418的活性不盡相同，因此在精選從前，必然要確立G418的最正確精選濃度。G418的配制：取1gG418溶于1ml1mol/L的HEPES液，加蒸餾水定容至10ml（使G418終濃度為0.1g/ml,HEPES終濃度為100mmol/L），過濾消毒，4度保存。HEPES的化學(xué)全稱為羥乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’-ethanesulfanicacid），分子量238.31，是一種氫離子緩沖劑，能較長(zhǎng)時(shí)間的控制溶液的pH處于恒定的范圍，而對(duì)細(xì)胞無毒性作用。1mol/LHEPES的簡(jiǎn)單配置：HEPES23．83g，溶解于80ml的雙蒸水中，用10mol/L的NaOH調(diào)治pH至，定容至100ml，0.22um小濾器過濾。HEPES使用終濃度為10-50mmol/L。制備精選培養(yǎng)基：在100ug/ml～1000ug/ml范圍內(nèi)按0ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、300ug/ml、400ug/ml，500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml、800ug/ml，900ug/ml、1000ug/ml濃度用無抗無血清培養(yǎng)基稀釋G418制成精選培養(yǎng)基。心得：由于特點(diǎn)明確的細(xì)胞系G418的最正確用量還是比較牢固的，因此有時(shí)不需要在這么大范圍內(nèi)進(jìn)行精選。比方說你要轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，現(xiàn)在我告訴你我測(cè)試過NIH3T3細(xì)胞對(duì)G418的敏感性，我用的精選濃度是200ug/ml。這時(shí)你就可以做150ug/ml、200ug/ml、300ug/ml三個(gè)濃度進(jìn)行精選。培養(yǎng)待轉(zhuǎn)染（而不是轉(zhuǎn)染后）的細(xì)胞。（精選的目的是殺滅未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)遠(yuǎn)的細(xì)胞（一般在鋪滿培養(yǎng)器皿底部的70%~80%時(shí)），用新鮮無抗無血清的培養(yǎng)基制成1×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。向96孔培養(yǎng)板中加細(xì)胞懸液，每孔100微升（使每孔細(xì)胞數(shù)在1×103個(gè)），爾后向每孔加新鮮無抗無血清的培養(yǎng)基合適，培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。（這樣做是為了保證在固定細(xì)胞密度下確立最正確G418藥物精選濃度。）會(huì)合度：實(shí)質(zhì)上就是指細(xì)胞占培養(yǎng)表面的比率，若是細(xì)胞鋪滿了整個(gè)容器，我們就認(rèn)為它們100%會(huì)合，也就是會(huì)合度100%。會(huì)合度對(duì)G418精選結(jié)果的影響很大，一般精選時(shí)會(huì)合度不宜高出50%！培養(yǎng)6小時(shí)左右開始加藥。加精選培養(yǎng)基精選:吸除培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基，PBS沖洗一次，每孔中加入不相同濃度的精選培養(yǎng)基合適。換液：每日檢查細(xì)胞活力，依照細(xì)胞活力和培養(yǎng)基的顏色，每三天(即每隔兩天)更換精選培養(yǎng)基一次。如細(xì)胞生長(zhǎng)過快，能夠縮短換液時(shí)間（每隔一天）。有死細(xì)胞勤換液，能夠減少對(duì)存活細(xì)胞的影響。確立最正確精選濃度：在正常的實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程時(shí)，一種細(xì)胞最優(yōu)精選濃度的確馬上間隨細(xì)胞的生長(zhǎng)率和一般生計(jì)時(shí)間而定，在精選小G418濃度即為最正確精選濃度。

10～14天內(nèi)能夠殺死所有細(xì)胞的最在第一輪就精選出最正確G418濃度的可能性不大，最有可能的是出現(xiàn)這種情況：用某一濃度G418的量在精選14天后還不能夠殺死細(xì)胞，而用下一個(gè)梯度的G418的量在10天前就看不到活細(xì)胞了。若是是400ug/ml不能夠殺死細(xì)胞，而800ug/ml在第5天就把所有細(xì)胞都?xì)⑺懒?，則能夠再用

500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml

進(jìn)一步精選，以確立最正確精選濃度。(二)轉(zhuǎn)染細(xì)胞第一天：在60mm培養(yǎng)皿內(nèi)種植細(xì)胞，細(xì)胞密度為能使第二天細(xì)胞交融能達(dá)到70%-80%的密度，CO2孵箱過夜培養(yǎng)。2.第二天：準(zhǔn)備3ml無抗生素?zé)o血清培養(yǎng)基，加入Polybrene，終濃度為8μg/ml。將已經(jīng)制備的病毒顆粒0.5ml加至上述培養(yǎng)基，輕吹混勻。去除60mm培養(yǎng)皿內(nèi)的舊的培養(yǎng)基，加入含病毒培養(yǎng)基。（Polybrene能夠增加病毒感染的效率，可是，有時(shí)Polybrene對(duì)細(xì)胞有毒性。這時(shí)，能夠用ProtamineSulfate代替Polybrene）3.轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24小時(shí)也許更長(zhǎng)，到細(xì)胞增加湊近70％會(huì)合時(shí)按1：4密度傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度增至50％～70％會(huì)合時(shí)開始精選。(三)精選細(xì)胞加G418：去掉培養(yǎng)液，PBS洗一次，加入按最正確精選濃度配制好的G418精選培養(yǎng)基（無抗無血清）(實(shí)質(zhì)應(yīng)用時(shí)能夠比最正確精選濃度高一級(jí)別)。換液：依照培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3~5天更換一次精選培養(yǎng)基。當(dāng)有大量細(xì)胞死亡時(shí)，能夠把G418濃度減半保持精選。精選10～14天后，可見有抗性的克隆出現(xiàn)，停藥用完好培養(yǎng)基培養(yǎng)。待其逐漸增大后，挑出單克隆：制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞到1個(gè)/10ul。在96孔板中加入培養(yǎng)基150ul/孔，再加入細(xì)胞懸液10ul/孔。待其逐漸增大后轉(zhuǎn)入到48孔中增殖。單克隆判斷