生化儀器中的空白定標和質控

生化儀器中的空白定標和質控第1頁/共45頁第二，標準液的吸光度與試劑空白的吸光度一定要準確。吸光度受儀器狀況、試劑狀況的影響，如果您的儀器相當穩(wěn)定，試劑是影響K值的一個主要因素。如何確定K值是正確的？一般我們用質控血清來檢查，最好是兩種水平的質控來檢查，如果質控結果很好，可以說K值是準確的，用這個K值計算出來病人的結果也是準確的，所以K值非常關鍵。K值的真面目：K值實際上代表了斜率，截距代表試劑空白，試劑空白每天都在變化，所以K值的穩(wěn)定性決定您的儀器與試劑，如果儀器與試劑都十分穩(wěn)定，那K值也很穩(wěn)定。多長時間定一次標合適？這要看您試劑的穩(wěn)定性，質控結果不好，有些項目做試劑空白可以解決，有些項目要做兩點定標。酶的項目如何確定K值：一是計算出來的理論K值；K=(TV×1000)/(SV×L×ε)二是用有酶項目的定標液得出K值：目前各公司可以提供多項目的定標液，不僅有底物類的項目，也有酶類的項目。第2頁/共45頁生化檢驗中的各種空白概念1、試劑空白：由于生化測試測量的吸光度為相對吸光度，所以從理論上說，所有終點法的測試都需要把試劑本身的吸光度扣除。試劑本身的吸光度就是試劑空白。測量方法是按照正常測試的試劑和樣本量第3頁/共45頁把樣本換成蒸餾水來測量。在傳統(tǒng)手工方法中,每次測定都要做至少三個管:測定管、標準管、空白管。其中空白管是試劑加蒸餾水，測出來也就是試劑空白。因為操作環(huán)境、儀器狀態(tài)、試劑穩(wěn)定性等變異，所以要求每次都要測定試劑空白，稱為實時試劑空白。在全自動分析儀上，大體上是模擬手工操作。但許多全自動分析儀為追求速度，在設計上采用一些折中方法來測定試劑空白。以日立全系列生化儀為例。該系列分析儀是做不了實時試劑空白，因為它們全是先加入樣本后加試劑，為了折中，只好在定標時做一個試劑空白，保存起來，需要扣除試劑空白時再減這個預先保存的值。這種做法，對于比較穩(wěn)定的試劑來講，對結第4頁/共45頁果影響不大。通俗的講，日立的儀器工作流程中首先是將標本加入到比色杯中，然后依次加入R1試劑、R2試劑，所以試劑空白在每個測定項目曲線中是無法看到的。但是7600從CALIBRATION中是可以看到的，S1ABS就是代表試劑空白吸光度，在CALIBRATION畫面里的下方找到ReactionMonitor（反應監(jiān)察），其中STD(1)就是代表試劑空白反應曲線.為了減小誤差，日立儀器會連續(xù)做兩次測定，所以你看到FIRST和SECOND兩條，計算時是取他們的平均值。做試劑空白目的之一就是觀察試劑是否穩(wěn)定，積極采取措施糾正。對于日立的這種試劑空白測定很多儀器都采用這種方法，也叫做試劑空白校準。總的說來，自動生化儀上的試劑空白一般表現(xiàn)為零點吸光度，該吸光度是通過校準確立的。第5頁/共45頁2、樣本空白：由于溶血、脂血、黃疸等情況，會導致樣本本身的吸光度對測試結果造成影響。所以對樣本本身吸光度的測量，即樣本空白，可以去除這方面的影響。測量方法是按照正常測試的試劑和樣本量，把試劑換成蒸餾水或生理鹽水來進行測量。自動生化儀上，很難界定樣本空白。與消除樣本空白有關的大約有如下幾點:a).在雙試劑測定時，加入試劑1和樣品后的吸光度可一定程度上扣除樣本空白，所以有單試劑不能扣除樣本空白的說法。b).現(xiàn)在優(yōu)質的試劑的抗干擾能力都比較強，比如有些雙試劑，R1加入后先和樣本孵育一段時間，將血紅蛋白、脂肪第6頁/共45頁膽紅素等反應掉，再加入R2開始測定反應。在一定范圍內都可以消除樣本空白。c).現(xiàn)代全自動生化儀大多采用雙波長測定.雙波長測定的原則是根據(jù)干擾組分和待測物質吸收光譜的峰形特征，選擇兩個波長和，使干擾組分在這兩個波長處的吸光系數(shù)相等，而使待測物質在兩波長處的吸光系數(shù)有顯著差別。以兩波長分別測定分析溶液的吸光度，以兩個吸光度值之差(△A)計算。這也可以扣除一部分樣本空白.d).有些儀器,例如日立系列,有專門的“血清信息”功能的設置。做法都是單獨占用一個空白通道來計算，這也叫做樣品空白校準。3、水空白：比色杯在加入水以后的吸光度。水空白的意義主要是對光路系統(tǒng)進行檢查和校正，如光源，比色杯等，同時在計算中起到消除“杯差”的作用。日立7060中的CellBlank（杯空白）測定的就是水空白。第7頁/共45頁全面質量控制的內容全面質量控制的內容主要包括分析前、分析中、分析后這三個主要過程的質控。只有認真的檢測和控制這三個過程中各個環(huán)節(jié)可能出現(xiàn)的誤差，才能保證最后檢測結果的準確性，才能達到我們的質量要求。第8頁/共45頁（一）分析前質控人員培訓實驗室的設置（水、電、相關設備、用具等）實驗儀器的質量保證

(儀器的精度、波長的準確度)檢測方法的選擇和評價（重復實驗、回收實驗、干擾實驗、方法比較實驗）試劑和標準品的選擇和評價

（線性范圍測定、反應曲線的觀察、穩(wěn)定性實驗）標本準備（血清、血漿、胸腹水等)第9頁/共45頁（二）分析中質控建立項目操作程序標準化的操作規(guī)程（SOP文件）。室內質控和結果分析

對各個項目進行室內質量控制，并對質控結果進行分析與處理。第10頁/共45頁（三）分析后質控審核實驗結果室內質控的數(shù)據(jù)管理參加室間質量評價建立投訴調查與反饋機制第11頁/共45頁二、臨床生化檢驗室內質量控制（一）、概念與意義室內質量控制：指各實驗室為了監(jiān)測和評價本實驗室工作質量，以決定常規(guī)檢驗報告能否發(fā)出，而采取的一系列檢查，控制手段，包括實驗室工作的全過程。意義：是檢測常規(guī)工作中的精密度，并觀察準確度的改變，提高本實驗室常規(guī)工作中天內與天間標本檢測的一致性。第12頁/共45頁要進行室內質量控制就必須要有指示物對各項目的質量進行指示和判斷，來說明質量好壞的情況，指示物就是我們需要的控制物（也稱質控物）。

控制物定義（也稱質控物）：含有被檢測的化學成份，用于監(jiān)測實驗室的精密度和準確度的一種指示血清（溶液）稱之為控制物。

標準品定義（參考物）：是指它的一種或幾種物理或化學性質已經(jīng)充分被確定，被用于校準儀器或證實一種測定方法的物質。第13頁/共45頁2質控品應具備的特性人血清基質，因它的基質效應小.無傳染性.添加劑和調制物的數(shù)量盡可能少.瓶間變異小，（1）酶類項目瓶CV應小于2％，其它分析物CV％應小于l％（2）某些不穩(wěn)定成分(如膽紅素、ALP等)在復溶后前4小時的變異應小于2％.（3）凍干品其復溶后，2～8℃環(huán)境中穩(wěn)定不少于24h，－20℃環(huán)境中穩(wěn)定不少于20天，到實驗室后的有效期應在1年以上.第14頁/共45頁室內質控血清濃度水平要求１、三級以上醫(yī)院的臨床實驗室，定量測定每批(不超過24小時)至少使用兩個濃度水平的質控血清。２、二級、一級醫(yī)院臨床實驗室，至少使用一個濃度水平(醫(yī)學決定水平)的質控血清。３、醫(yī)學決定水平：是指某項待測物的含量，圍繞該濃度的升高或降低，對確定疾病的診斷或治療起幫助甚至關鍵的作用。第15頁/共45頁統(tǒng)計學的基本概念１、精密度：測定值與均值之間的差值情況稱為精密度，差值越大精密度越差，反之越好。

２、準確度：測定值與真實值之間的差值情況稱為準確度，越接近真值準確度也好，反之就越差。第16頁/共45頁第17頁/共45頁室內質量控制的主要方法常規(guī)質控圖（ｘ±S）法Westgard多規(guī)測質控法6西格瑪質控圖法4.日常標本測定結果均值圖法

第18頁/共45頁常規(guī)質控圖（ｘ±S）法這種方法操作簡單，直觀，易懂，它具有成熟的理論和實際經(jīng)驗，它只需要單一濃度的質控血清就可實現(xiàn)對臨床進行室內質量控制，是目前國內外采用最廣泛的一種常規(guī)室內質量控制的方法。也稱為均值-標準差質控圖法，也稱levey-Jenning質控圖法。第19頁/共45頁①在縱坐標上標出X、X±2SD、X±3SD的標志，橫縱標上標出日期或次數(shù)。②用紅筆劃出X±2SD作為警告線；用藍筆劃出X±3SD作為出控線。這樣稱為一張空OCV或RCV圖。③質控圖上所包括的內容第20頁/共45頁常規(guī)靶值、控制限的確定：一個月結束后,將該月的在控結果與前20個質控測定結果匯集在一起，計算累積X、S、CV,再作為第二個月的IQC的暫定靶值和控制限，觀測第二個月的IQC。以此重復３～５個月建立常規(guī)的靶值、控制限。在計算累積值的時候需去掉超過±3SD的數(shù)據(jù)第21頁/共45頁室內質控的結果分析（1）測定值的分布規(guī)律①95%的測定結果應落在X±2SD范圍內。②不能有連續(xù)5次結果逐漸上升或下降。③不能有連續(xù)5次結果在均值的同一側。④不能有連續(xù)2次結果在X±2SD以外。⑤不能有數(shù)據(jù)落在X±3SD外。

如違反上述規(guī)律時，稱為失控。第22頁/共45頁（２）質控圖的幾種失控表現(xiàn)

①曲線漂移：是由于系統(tǒng)誤差造成，準確度發(fā)生了一次性的向上或向下的改變，這種往往是由于一個突然出現(xiàn)的新的情況引起。如更換質控血清、試劑及操作人員。第23頁/共45頁②趨勢性變化：質控圖趨勢性向下或向上變化。表明檢測的準確度發(fā)生逐漸的變化，這種變化多發(fā)生是由于一個逐漸改變的因素造成的。如試劑的揮發(fā)、吸水、沉淀等。第24頁/共45頁③精密度變化：儀器、試劑或方法學不穩(wěn)定第25頁/共45頁8、失控后處理①迅速回顧，檢查整個操作過程。是否有發(fā)生錯誤的環(huán)節(jié)，包括試劑、方法、波長，以及程序等出現(xiàn)差錯。②如操作步驟均無問題，可重復試驗一次，如有改進，說明誤差很可能操作錯誤所致，標本量，試劑量的錯誤，或波長選擇錯誤所致。③如仍不能更正，可取一份新鮮的控制血清重作。④仍不能解決問題，取一份定值血清重做。⑤仍不能解決，應仔細檢測儀器。⑥仍未得到糾正，試劑、質控血清重新配制和溶解，儀器保養(yǎng)檢修，全部重新查找原因直到問題解決。第26頁/共45頁1、方法：要求在常規(guī)條件，同時測定2份不同濃度的定值質控血清，所含測定物濃度最好分別為醫(yī)學決定水平的上限或下限。Westgard多規(guī)則法第27頁/共45頁2

常用的質控規(guī)則質控規(guī)則以符號AL表示：(1)A是指超過質控限(L)的質控測定值的個數(shù)(2)L是質控界限。(3)

1

2s質控規(guī)則,A=1,L=2s當質控測定值超過了規(guī)定某規(guī)則要求時，應判該批分析違背此規(guī)則。第28頁/共45頁12s：有1個質控測定值超過X±2s，該規(guī)則稱為“警告規(guī)則”。第29頁/共45頁13s規(guī)則：1個質控測定值超過X±3s質控限。此規(guī)則多由隨機誤差造成第30頁/共45頁22s規(guī)則:2個連續(xù)的質控測定值同時超過X＋2s或X－2s質控限。此規(guī)則主要由系統(tǒng)誤差造成第31頁/共45頁R4s規(guī)則：在同一批內進行兩種不同濃度質控品監(jiān)測時,高濃度測定值與低濃度測定值之間的差值超過4s。此規(guī)則多由隨機誤差造成。第32頁/共45頁41s規(guī)則：4個連續(xù)的質控測定值同時超過X＋1s或X－1s。此規(guī)則主要由系統(tǒng)誤差造成。第33頁/共45頁10x規(guī)則：10個連續(xù)的質控測定值同時落在均值（X）的同一側。此規(guī)則主要由系統(tǒng)誤差造成。第34頁/共45頁Westgard多規(guī)則的主要特點是：①是在Levey-Jennings方法基礎上發(fā)展起來的，因此,它很容易與常用的Levey-Jennings質控圖進行比較并涵括后者的結果；②通過單值質控圖進行簡單的數(shù)據(jù)分析和顯示③具有低的假失控或假報警概率；④當失控時，能確定產(chǎn)生失控的分析誤差的類型，由此可幫助確定失控的原因以尋找解決問題的辦法。第35頁/共45頁最初的Westgard多規(guī)則通常有六個質控規(guī)則，即12s、13s、22s、R4s、41s、10x。其中12s規(guī)則是是一種警告規(guī)則也是Westgard法的啟動規(guī)則，它有助于對質控數(shù)據(jù)的快速判斷。為了表達的方便，通常以“／”符號將各項質控規(guī)則聯(lián)接起來，如13s/22s/R4s／41s／10x。第36頁/共45頁在實踐中13s或R4s規(guī)則常檢出隨機誤差，而22s

、41s

、10x質控規(guī)則檢出系統(tǒng)誤差。第37頁/共45頁第38頁/共45頁IQC中需要注意存在的問題注意的問題：（1）質控血清必須完全溶解和融化后才能使用，同時，（2）必須有準確的加樣器，而且水的質量一定要得到保證。（3）質控血清必須與常規(guī)標本同等對待，不得特殊處理，只有這樣才能真正反映常規(guī)工作的質量。第39頁/共45頁（4）質控血清測得值應及時在質控圖上。確認沒有失控后，再填發(fā)當天的檢驗報告。（5）通過質控圖尋找出現(xiàn)誤差規(guī)律。在失控時查找原因，均需要各方面詳細記錄，才能進行正常分析，因此必須養(yǎng)成良好的實驗記錄習慣。（6）單純依靠質量控制制圖監(jiān)測工作質量是不夠的。特別是對于過失誤差，是無法用統(tǒng)計學方法去發(fā)現(xiàn)的。第40頁/共45頁存在的問題（１）質控標本對質控過程的監(jiān)控不夠，一般只在早晨調機時做一次質控標本。（２）將質控血清反復測定多次，取其結果均值作為當天質控血清的檢測值。因在取均值過程中抵消了大部分隨機誤差，使結果反映出的精密度比實際情況好得多，起不到控制常