生物化學(xué)技術(shù)原理及應(yīng)用

生物化學(xué)技術(shù)原理及應(yīng)用第1頁(yè)/共61頁(yè)生命大分子物質(zhì)通常是指：動(dòng)物、植物和微生物在進(jìn)行新陳代謝時(shí)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(包括酶)和核酸等有機(jī)化合物的總稱。

生命科學(xué)研究將進(jìn)入后基因組時(shí)代。分離純化和測(cè)試分析蛋白質(zhì)技術(shù)顯得十分重要。

本章將以蛋白質(zhì)和核酸為主線討論其制備的一般過(guò)程，即材料的選擇與處理、測(cè)定方法的確立、有效成分的抽提、粗品的純化和純品的鑒定(這部分移至后面的章節(jié)介紹)等步驟。

第2頁(yè)/共61頁(yè)第一節(jié)

材料的選擇與處理

一、材料的選擇

A.有效成分是指欲純化的某種單一的生命大分子物質(zhì)。而有效成分以外的其他物質(zhì)則統(tǒng)稱雜質(zhì)。

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B.有效成分在材料中存在的特點(diǎn)有效成分的含量一般較少如胰臟中胰島素的含量小于其鮮重的百萬(wàn)分之一。有效成分穩(wěn)定性較差大多數(shù)對(duì)酸、堿、高溫和高濃度有機(jī)溶劑等因子較敏感，易被微生物分解變質(zhì)。選用的材料不同，有效成分的含量就不同；選用的材料即使相同，但是部位或生長(zhǎng)期不同，有效成分的含量也不盡相同。

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C.材料選擇應(yīng)遵循的原則有效成分含量多、穩(wěn)定性好來(lái)源豐富、保持新鮮提取工藝簡(jiǎn)單有綜合利用價(jià)值等

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二、材料的處理

選擇到合適的材料后，應(yīng)及時(shí)使用，或采用冰凍或干燥等方法處理。同時(shí)還應(yīng)將易于去掉的非需物質(zhì)除去。

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1動(dòng)物臟器

(1)冰凍

應(yīng)在很短時(shí)間內(nèi)置-10℃冰庫(kù)(可短期保存)或-70℃低溫冰箱(數(shù)月不變質(zhì))貯存。脫脂脂肪容易氧化酸敗，導(dǎo)致原料變質(zhì)，而且還會(huì)影響純化操作和制品得率。一般脫脂的方法有：

A.人工剝?nèi)ヅK器外的脂肪組織；

B.浸泡在脂溶性的有機(jī)溶劑(如丙酮、乙醚)中脫脂；

C.采用快速加熱(50℃左右)、快速冷卻的方法，使熔化的油滴冷卻后凝聚成油塊而被除去；

D.利用油脂分離器使油脂與水溶液得以分離。第7頁(yè)/共61頁(yè)(2)干燥

A.丙酮液中脫水，干燥后磨粉貯存?zhèn)溆茫?/p>

B.在沸水中蒸煮處理，烘干后能長(zhǎng)期保存。第8頁(yè)/共61頁(yè)

2植物組織

A.葉片用水洗凈即可使用；或在l0h內(nèi)置-4～-30℃冰箱貯藏備用。

B.植物種子需泡脹或粉碎才可使用。

材料含油脂較多時(shí)，要進(jìn)行脫脂處理。

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3微生物

為制備生命大分子物質(zhì)的主要材料之一。

用離心法收集到的上清液，可用于制備胞外酶和某些輔基等有效成分；可置低溫下短時(shí)間貯存。

收集到的菌體，經(jīng)破細(xì)胞處理后則可從中提取其他有效成分；或制成凍干粉，在4℃保存(數(shù)月不會(huì)變質(zhì))。第10頁(yè)/共61頁(yè)第二節(jié)

確立測(cè)定方法

一、目的與要求

測(cè)定哪些材料含有目標(biāo)有效成分？哪些材料含量豐富？提純過(guò)程純度是否逐漸增加？要確立專一、準(zhǔn)確、靈敏和簡(jiǎn)便的測(cè)定方法。因?yàn)椋河行С煞衷谠牧现泻枯^低；底物要專一性的。第11頁(yè)/共61頁(yè)二、常用的測(cè)定方法

1.光譜法2.電化學(xué)法3.生物活性檢測(cè)法4.免疫分析法5.生物傳感器第12頁(yè)/共61頁(yè)1光譜法(1)吸收光譜法[①直接測(cè)定法；②比色法](2)熒光法(3)濁度法特點(diǎn)：測(cè)定時(shí)所需的樣品量較少，但往往能產(chǎn)生比較高的消光值；且操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)迅速、靈敏；結(jié)果也較準(zhǔn)確，

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(1)吸收光譜法

直接測(cè)定法、比色法

①直接測(cè)定法將待測(cè)物(如核酸、蛋白質(zhì))配制成一定濃度的溶液后，移至相應(yīng)波長(zhǎng)的分光光度計(jì)中，即可從測(cè)定的消光值換算出待測(cè)物的含量。

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A.測(cè)定核酸含量

構(gòu)成核酸的堿基組分是分光光度計(jì)測(cè)定核酸含量的依據(jù)。

在測(cè)定過(guò)程中，DNA或RNA溶液濃度的增加或降低，會(huì)使其在波長(zhǎng)260nm的消光值(A260)隨之增加或降低，二者之間成正比關(guān)系。第15頁(yè)/共61頁(yè)

通常1個(gè)A260值分別相當(dāng)于雙鏈DNA50μg／ml單鏈DNA37μg／ml單鏈RNA40μg／ml

用A260／A280比值可確定DNA和RNA的純度：純DNA比值為1.8純RNA的比值為2.0當(dāng)此比值分別小于1.8和2.0時(shí)，表明樣品中已污染了蛋白質(zhì)或酚類等物質(zhì)。

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B.測(cè)定蛋白質(zhì)的含量及純度

蛋白質(zhì)(包括酶和肽)溶液的A280值主要是由構(gòu)成蛋白質(zhì)組分的色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)的消光值決定的，胱氨酸的貢獻(xiàn)很小。第17頁(yè)/共61頁(yè)

②比色法將待測(cè)物(如蛋白質(zhì)、核酸、糖類)與相關(guān)試劑(見(jiàn)表1-2)或酶的底物作用后，根據(jù)呈現(xiàn)的顏色或形成的產(chǎn)物特性，移至相應(yīng)波長(zhǎng)的分光光計(jì)中，即可從測(cè)定的消光值換算出待測(cè)物的含量。

例如：

鄰苯二酚(在275nm有吸收峰)+鄰苯二酚-2,3-雙加氧酶

黃色的α-羥基粘康酸半醛(在375nm有吸收峰)

通過(guò)檢測(cè)375nm消光值的升高即可換算出所用酶的活力。

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還可用不同消光值之間的比值鑒定某些物質(zhì)的純度

例如

純細(xì)胞色素c還原型A550／氧化型A280比值為1.25~

1.28。假如比值過(guò)高或過(guò)低，就表明細(xì)胞色素C中污染了雜質(zhì)。

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(2)熒光法

特點(diǎn)：熒光法的精確性、重復(fù)性和靈敏度比吸收光譜法好。當(dāng)分析物含量低、用吸收光譜法不能檢測(cè)時(shí)，改用熒光法卻能求得滿意結(jié)果。

如：NAD(菸酰胺腺嘌呤二核苷酸)（輔酶Ⅰ）NADP(菸酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)（輔酶Ⅱ）由于NADH2和NADPH2發(fā)熒光，用于偶聯(lián)NADH2(或NADPH2)的氧化或NAD(或NADP)的還原反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行熒光測(cè)定。

第20頁(yè)/共61頁(yè)例子：

谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活力測(cè)定采用與蘋果酸脫氫酶（MDH)相偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行。天冬氨酸+α-酮戊二酸GOT

草酰乙酸+谷氨酸

草酰乙酸+NADH+H+

MDH

L-蘋果酸+NAD+每生成1分子草酰乙酸就消耗1分子NADH，這樣GOT活力就可通過(guò)測(cè)定NADH在340nm消光值的下降來(lái)求得。

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(3)濁度法極稀的懸浮液可采用此法測(cè)定，即測(cè)定懸浮液在不被吸收的波長(zhǎng)下表觀的消光值。

例如伴刀豆球蛋白(Concanavalin,ConA)的活力測(cè)定方法之一就是采用此法(A420)。培養(yǎng)液中細(xì)菌生長(zhǎng)的濃度(A600)也可用此法測(cè)定。第22頁(yè)/共61頁(yè)

2電化學(xué)法

有些反應(yīng)過(guò)程會(huì)放出質(zhì)子氫(H+)，可用靈敏的pH計(jì)或NaOH溶液滴定等方法追蹤其變化，從而計(jì)算出欲測(cè)物的含量或活力。

例如：葡萄糖氧化酶能催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，用NaOH溶液滴定該酸的含量，便可求出葡萄糖氧化酶的活力。

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3生物活性檢測(cè)法

大多數(shù)生命物質(zhì)，尤其是一些激素類物質(zhì)，當(dāng)把它們注射入動(dòng)物的特定器官時(shí)，所屬機(jī)體將發(fā)生相應(yīng)的變化，并且二者間有一定的相關(guān)性。根據(jù)這一性質(zhì)設(shè)計(jì)的方法，即可對(duì)生命活性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。如：在某個(gè)動(dòng)物器官中注射某種激素，使器官細(xì)胞加速分裂，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞的數(shù)量變化來(lái)推測(cè)激素的生物活性。第24頁(yè)/共61頁(yè)

4免疫分析法

采用抗體與抗原之間發(fā)生的特異反應(yīng)，并結(jié)合放射性同位素標(biāo)記或酶標(biāo)記，就可對(duì)有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行靈敏的定性或(和)定量分析(詳見(jiàn)第十九章)。

5生物傳感器

用生物傳感器中的敏感膜（具有分子識(shí)別功能的生物活性材料如酶、蛋白、抗體、生物膜和微生物等作為敏感元件）與待測(cè)溶液中的某一物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)，即可通過(guò)顯示器反映出有效成分的數(shù)量(詳見(jiàn)第十七章)。

第25頁(yè)/共61頁(yè)第三節(jié)

細(xì)胞的破碎

細(xì)胞是生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。有效成分可以分泌于細(xì)胞外，也有存在于細(xì)胞內(nèi)的。如淀粉酶和蛋白酶等就是分泌在胞外的培養(yǎng)液中，用適當(dāng)?shù)娜軇┛芍苯犹崛　?/p>

存在于細(xì)胞內(nèi)的酶又有游離酶和結(jié)合酶之分，前者游離在細(xì)胞質(zhì)中，后者則與細(xì)胞器緊密結(jié)合(如氧化還原酶和有機(jī)磷水解酶等)。

第26頁(yè)/共61頁(yè)欲提取存在于細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)時(shí)，必須把細(xì)胞破碎（個(gè)別的則例外如采用Mg2+溶液提取酶蛋白）。動(dòng)物臟器的細(xì)胞膜比較脆弱，極易破損，往往在組織絞碎或提取時(shí)就被破壞了。植物和微生物的細(xì)胞壁較牢固，需要在提取前進(jìn)行專門的破細(xì)胞操作。第27頁(yè)/共61頁(yè)一、機(jī)械破碎1研磨法剪碎的動(dòng)物組織置研缽中，用研磨棒研碎。用勻漿器處理，也能把動(dòng)物細(xì)胞破碎。大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，可用電動(dòng)研磨法。細(xì)菌和組織的細(xì)胞破碎均可用此法。

2組織搗碎器法這是一種劇烈的破碎細(xì)胞方法。搗碎器(8000~10000r/min)處理30~45s，植物和動(dòng)物細(xì)胞能完全破碎。

第28頁(yè)/共61頁(yè)3超聲波法

它是借助聲波的振動(dòng)力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器的有效方法。

4壓榨法

此法是一種溫和、徹底破碎細(xì)胞的方法。用1.77×108～3.54×108Pa的壓力迫使幾十毫升細(xì)胞懸液通過(guò)一個(gè)小孔(<細(xì)胞直徑的孔)，致使其被擠破、壓碎。5凍融法

將細(xì)胞置低溫下冰凍一定時(shí)間，然后取出置室溫下(或40℃左右)迅速融化。如此反復(fù)凍融多次，細(xì)胞可在形成冰粒和增高剩余胞液鹽濃度的同時(shí)，發(fā)生溶脹、破碎。

第29頁(yè)/共61頁(yè)二、溶脹和自溶

1溶脹

細(xì)胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液如低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進(jìn)入細(xì)胞，引起細(xì)胞膜發(fā)生脹破的現(xiàn)象稱溶脹。

2自溶

細(xì)胞結(jié)構(gòu)在本身所具有的各種水解酶(如蛋白酶和酯酶等)作用下，發(fā)生溶解的現(xiàn)象稱自溶。

第30頁(yè)/共61頁(yè)三、化學(xué)處理

脂溶性的溶劑可把細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)部分溶解

四、生物酶降解

生物酶(如溶菌酶)有降解細(xì)菌細(xì)胞壁的功能。在用此法處理細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，先是細(xì)胞壁消解，隨之而來(lái)的是因滲透壓差引起的細(xì)胞膜破裂，最后導(dǎo)致細(xì)胞完全破碎。

第31頁(yè)/共61頁(yè)第四節(jié)抽提

一、抽提的含義

抽提通常是指用適當(dāng)?shù)娜軇┖头椒?，從原料中把有效成分分離出來(lái)的過(guò)程。經(jīng)過(guò)處理和破細(xì)胞原材料中的有效成分可用

緩沖液、稀酸、稀堿、或有機(jī)溶劑(如丙酮、乙醇)等抽提；還可用蒸餾水抽提。

第32頁(yè)/共61頁(yè)一般理想的抽提溶液應(yīng)具備下述條件：對(duì)有效成分溶解度大，破壞作用小；對(duì)雜質(zhì)不溶解或溶解度很?。粊?lái)源廣泛、價(jià)格低廉、操作安全等。第33頁(yè)/共61頁(yè)

二、抽提有效成分的影響因子

抽提時(shí)pH值、金屬離子、溶劑的濃度、極性等因子，可明顯影響有效成分的性質(zhì)和數(shù)量。

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1pH值

對(duì)蛋白質(zhì)或酶等具有等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)物質(zhì)，一般選擇抽提液的pH值應(yīng)在偏離等電點(diǎn)的穩(wěn)定范圍內(nèi)。通常：抽提堿性蛋白質(zhì)選用低pH值的溶液；抽提酸性蛋白質(zhì)選用高pH值的溶液；或者用調(diào)至一定pH值的有機(jī)溶劑。第35頁(yè)/共61頁(yè)

2溶劑的極性和離子強(qiáng)度

有些蛋白質(zhì)或酶在極性大、離子強(qiáng)度高的溶液中穩(wěn)定；有些則在極性小、離子強(qiáng)度低的溶液中穩(wěn)定。（1）通常降低極性的方法在水溶液中增加蔗糖或甘油的濃度。若用二甲基亞砜(DMSO)或二甲基甲酰胺代替蔗糖或甘油時(shí)，會(huì)使溶液的極性大大降低。

（2）離子強(qiáng)度等于溶液中各離子濃度（C）與離子電荷數(shù)（Z）平方乘積總和的二分之一。在水溶液中加人中性鹽如KCl、NaCl、NH4Cl和(NH4)2SO4能提高溶液的離子強(qiáng)度。一般來(lái)說(shuō)：

離子強(qiáng)度較低的中性鹽溶液有促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解，保護(hù)蛋白質(zhì)活性的作用；離子強(qiáng)度過(guò)高則會(huì)引起蛋白質(zhì)發(fā)生鹽析作用。

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3水解酶

在抽提、純化蛋白質(zhì)或核酸時(shí)，其效果常常受到本身存在的水解酶的影響。這些酶在與欲抽提的蛋白質(zhì)或核酸接觸時(shí)，一旦條件適宜，就會(huì)發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)或核酸分解，而使實(shí)驗(yàn)失敗。

防止方法（目的是使這些酶喪失活性）：①加入抑制劑(苯甲基磺酰氟化物，PMSF，見(jiàn)表1-3、1-4)，②調(diào)節(jié)抽提液的pH、離子濃度或極性等方法，

第37頁(yè)/共61頁(yè)

4溫度

一般認(rèn)為蛋白質(zhì)或酶制品在低溫(如0℃左右)時(shí)最穩(wěn)定。但有些物質(zhì)對(duì)溫度的要求卻與此不同。

例如：從鳥肝分離出的丙酮酸羧化酶對(duì)低溫敏感，25℃時(shí)才穩(wěn)定。有機(jī)磷農(nóng)藥水解酶，置-10℃時(shí)會(huì)快速失活，移至21℃時(shí)兩天后開始失活，此后每天失活剩余酶的16％。若將其存放在6℃時(shí)失活速度較緩慢，每天約喪失活力0.75％。

第38頁(yè)/共61頁(yè)

5攪拌

攪拌可促使欲抽提物與抽提液之間相互接觸，并能增加溶解度。但是，一般宜采用溫和的攪拌方法，速度太快時(shí)容易產(chǎn)生泡沫，導(dǎo)致某些酶類變性失活。

6氧化

存在氧化劑或氧分子時(shí)，會(huì)使巰基形成分子內(nèi)或分子間的二硫鍵，導(dǎo)致酶(或蛋白質(zhì))失活(或變性)。在抽提液中加入還原劑時(shí)，就可以防止巰基發(fā)生氧化作用，或者延緩某些酶活性的喪失。在有些植物組織或微生物細(xì)胞中含有較多的酚類化合物，加入還原劑可防止褐化。第39頁(yè)/共61頁(yè)7金屬離子蛋白質(zhì)的巰基能和金屬離子如鉛、鐵或銅作用，產(chǎn)生沉淀復(fù)合物。這些金屬離子主要來(lái)源于制備緩沖液的試劑中。解決的辦法:①用無(wú)離子水或重蒸水配制試劑；②在配制的試劑中加入1-3mmol／LEDTA(金屬離子絡(luò)合劑)。

8抽提液與抽提物的比例在抽提時(shí)，抽提液與抽提物的比例一般以5︰1為宜。如抽提液過(guò)多，則有利于有效成分的提取，但不利于純化工序的進(jìn)行。否則反之。

第40頁(yè)/共61頁(yè)第五節(jié)

濃

縮

一般抽提液的體積都比較大，應(yīng)先進(jìn)行濃縮處理。常用的濃縮方法有下面幾種:沉淀法吸附法超過(guò)濾法透析法減壓蒸餾法冰凍干燥法第41頁(yè)/共61頁(yè)

一、沉淀法

在抽提液中加入適量的中性鹽[如(NH4)2S04]或有機(jī)溶劑，使有效成分變?yōu)槌恋?見(jiàn)第二章)。經(jīng)離心分離，獲得有效成分。第42頁(yè)/共61頁(yè)

二、吸附法

將干葡聚糖凝膠G25(或吸水棒)加入抽提液中，兩者比例為1︰5。由于凝膠吸水之故，抽提液的體積可縮小三倍左右，回收蛋白質(zhì)量約80％。第43頁(yè)/共61頁(yè)

三、超過(guò)濾法

把抽提液裝入超過(guò)濾裝置(見(jiàn)圖1-1)，在空氣或氮?dú)?5.05×105Pa)壓力下，使小分子物質(zhì)(包括水分)通過(guò)半透膜(如硝酸纖維素膜)，大分子物質(zhì)留在膜內(nèi)。第44頁(yè)/共61頁(yè)四、透析法

A.把裝抽提液的透析袋埋在吸水力強(qiáng)的聚乙二醇(polyetheyleneglycol，PEG，分子質(zhì)量>20kDa)或甘油中。10ml抽提液可在1h內(nèi)濃縮到幾乎無(wú)水的程度。這種方法的濃縮速度與透析袋的表面積以及PEG的數(shù)量有密切關(guān)系。B.真空透析

第45頁(yè)/共61頁(yè)五、減壓蒸餾法當(dāng)真空度較高時(shí)溶液的沸點(diǎn)可控制在30℃以下。這種方法一般適用于常溫下穩(wěn)定性好的物質(zhì)。第46頁(yè)/共61頁(yè)

六、冰凍干燥法

冰凍的抽提液在真空狀態(tài)下，可以由固體直接變?yōu)闅怏w。用此原理進(jìn)行濃縮，有效成分幾乎不會(huì)破壞。凍干機(jī)

凍干機(jī)主要由：低溫干燥箱、真空泵和冷凍機(jī)構(gòu)成。

第47頁(yè)/共61頁(yè)第六節(jié)

純化方案的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)

純化方案：

是指在純化某一物質(zhì)過(guò)程中，將幾種分離方法(如沉淀法、離子交換層析、葡聚糖凝膠等)有機(jī)地互補(bǔ)聯(lián)合、靈活應(yīng)用的總稱。

第48頁(yè)/共61頁(yè)

一、純化方案的設(shè)計(jì)

依據(jù)抽提液中有效成分和雜質(zhì)之間理化性質(zhì)的差異性，從諸多方法中挑選出兩種、兩種以上乃至更多種分離方法組成一個(gè)純化方案。各分離方法的排布：一般地，

先選用粗放、快速、有利于縮小樣品體積和后工序處理的方法；

后選用精確、費(fèi)時(shí)和需樣品量少的方法。第49頁(yè)/共61頁(yè)

二、純化方案的評(píng)價(jià)

對(duì)純化方案的評(píng)價(jià)，實(shí)質(zhì)上是對(duì)組成純化方案的每一種分離方法的評(píng)價(jià)。這種評(píng)價(jià)僅采用理論分析是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，只有經(jīng)過(guò)實(shí)踐檢驗(yàn)才能正確得出。

第50頁(yè)/共61頁(yè)

方法：純化過(guò)程的每一步收集到的溶液要進(jìn)行：有效成分的含量測(cè)定；并計(jì)算：比活力(活力單位數(shù)／毫克蛋白)純化倍數(shù)(每步的比活力／粗抽提液的比活力)收得率[(每步的總活力/粗抽提液總活力）×100％]

視純化倍數(shù)的大小，收得率的高低，就能初步確定每種分離方法的應(yīng)用價(jià)值。第51頁(yè)/共61頁(yè)一般認(rèn)為：凡是在特定實(shí)驗(yàn)中能增大純化倍數(shù)和提高收得率的方法均屬有應(yīng)用價(jià)值的。反之，則應(yīng)用價(jià)值不大，也不宜采用。但是，在純化過(guò)程中，隨著純化倍數(shù)的增大，有效成分的含量卻是逐漸減少，收得率也往往<100％(除非抽提液中存在酶的抑制)。因此，實(shí)踐中對(duì)純化倍數(shù)和收得率的要求是根據(jù)材料來(lái)源的難易而變化的。若材料來(lái)源難，就希望提高收得率；反之，則希望提高純化倍數(shù)(見(jiàn)沉淀法)。

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例子

以從賽氏桿菌(Serratiasp．)提取L-門冬酰胺酶為例，說(shuō)明純化方案與純化倍數(shù)和收得率的關(guān)系(見(jiàn)表1-7)。第53頁(yè)/共61頁(yè)表1-7L-門冬酰胺酶的純化比活力=活力單位數(shù)／毫克蛋白純化倍數(shù)=每步的比活力／粗抽提液的比活力收得率=每步的總活力/粗抽提液總活力×100％步驟總蛋白/g總活力/u比活力（u/mg）純化倍數(shù)收得率/%1.粗抽提液30210000.711002.氯化錳處理7.64150172.02.8723.冰凍融解5.58148722.73.8714.DEAE-纖維0.113502544.563.524素層析5.硫酸銨鹽析0.048336771.7102.0176.羥基磷灰石0.0163133200.0286.015柱層析7.PAGE0.0123100255.0365.015第54頁(yè)/共61頁(yè)此