液相色譜的基礎(chǔ)知識及應(yīng)用

Contents液相色譜法發(fā)展史與分類1色譜方法基本原理2345樣品分析方法的建立液相色譜的維護(hù)及注意事項(xiàng)軟件的簡單介紹及示范現(xiàn)在是1頁\一共有55頁\編輯于星期三1液相色譜發(fā)展歷史與分類1.1色譜的起源(1903)Chromatography色譜M.S.Tswett現(xiàn)在是2頁\一共有55頁\編輯于星期三IUPACdefinitionofchromatography(1993): Chromatographyisaphysicalmethodofseparationinwhichthecomponentstobeseparatedaredistributedbetweentwophases,oneofwhichisstationarywhiletheothermovesinadefinitedirection.固定相（stationaryphase）：在色譜分離中固定不動、對樣品產(chǎn)生保留的一相。流動相（mobilephase）：帶動樣品向前移動的另一相。色譜法：是一種物理化學(xué)分離方法，它利用不同組分與兩相（固定相和流動相）之間的作用力（分配、吸附、離子交換等）的差別，樣品在兩相中做相對移動時，各組分在兩相間進(jìn)行多次平衡，使不同物質(zhì)達(dá)到相互分離。1.2

色譜的定義現(xiàn)在是3頁\一共有55頁\編輯于星期三1.3色譜的發(fā)展歷程現(xiàn)在是4頁\一共有55頁\編輯于星期三現(xiàn)在是5頁\一共有55頁\編輯于星期三1.4色譜中的分離過程定性定量串聯(lián)應(yīng)用樣品純化成分分析分離現(xiàn)在是6頁\一共有55頁\編輯于星期三色譜中的分離過程咖啡流動相固定相利用混合物中各組份在不同的兩相中溶解、分配、吸附等化學(xué)作用性能的差異,當(dāng)兩相作相對運(yùn)動時,使各組分在兩相中反復(fù)多次受到上述各作用力而達(dá)到相互分離現(xiàn)在是7頁\一共有55頁\編輯于星期三1.5色譜的分類按流動相的物態(tài)分:–氣相色譜(GasChromatography,GC)：用氣體作為流動相(又叫載氣)–液相色譜(LiquidChromatography,LC)：用液體作為流動相(又叫洗脫劑)按固定相的形態(tài)分:–平面色譜紙色譜薄層色譜

–柱色譜按流動相和固定相的相對極性–正相色譜(NormalPhaseChromatography)

固定相的極性大于流動相–反相色譜(ReversedPhaseChromatography)

固定相的極性小于流動相現(xiàn)在是8頁\一共有55頁\編輯于星期三HPLC與

GC的應(yīng)用差異現(xiàn)在是9頁\一共有55頁\編輯于星期三HPLC與

GC的應(yīng)用差異揮發(fā)非揮發(fā)疏水性親水性糖環(huán)氧化合物多氯聯(lián)苯脂肪酸甲酯芳香酯C2/C5碳?xì)浠衔餆o機(jī)離子氨基酸糖類衍生物香精油聚合物單體甘油三酸酯磷脂亞硝胺有機(jī)磷殺蟲劑酒精多環(huán)芳烴芳族胺脂溶性維生素抗體天然食用色素類黃酮抗生素腈類抗氧化劑乙二醇脂肪酸磺胺類揮發(fā)性羧酸醛酮類甘草膦合成食用色素苯酚黃曲霉毒素酶糖醇現(xiàn)在是10頁\一共有55頁\編輯于星期三2.色譜方法基本原理色譜的主要理論熱力學(xué)理論以相的平衡觀點(diǎn)研究色譜過程

塔板理論為代表

(Martin&Synge)動力學(xué)理論以動力學(xué)觀點(diǎn)研究各種動力學(xué)因素對色譜峰的影響

VanDeemter方程為代表MartinSynge現(xiàn)在是11頁\一共有55頁\編輯于星期三

分離的原理樣品組分在固定相和流動相之間的分配

流動相帶動樣品經(jīng)過色譜柱

不同組分與固定相之間相互作用的強(qiáng)度不同

不同組分在固定相上移動速度不同，

形成分離分配系數(shù)

KDXmXsKD1=[Xs]/[Xm]YmYsKD2=[Ys]/[Ym]

流動相固定相現(xiàn)在是12頁\一共有55頁\編輯于星期三

樣品組分的分離進(jìn)樣、分配、移動、流出、分離KD2<KD1，所以Y先流出來現(xiàn)在是13頁\一共有55頁\編輯于星期三分配系數(shù)K分配系數(shù)與組分、流動相和固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)，也與溫度、壓力有關(guān)。在條件（流動相、固定相、溫度和壓力等）一定，樣品濃度很低時（Cs、Cm很?。r，K只取決于組分的性質(zhì)，而與濃度無關(guān)。這只是理想狀態(tài)下的色譜條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰；在許多情況下，隨著濃度的增大，K減小，這時色譜峰為拖尾峰；而有時隨著溶質(zhì)濃度增大，K也增大，這時色譜峰為前延峰。因此，只有盡可能減少進(jìn)樣量，使組分在柱內(nèi)濃度降低，K恒定時，才能獲得正常峰。在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中滯留時間長，后流出色譜柱；K值小的組分則滯留時間短，先流出色譜柱?；旌衔镏懈鹘M分的分配系數(shù)相差越大，越容易分離，因此混合物中各組分的分配系數(shù)不同是色譜分離的前提。在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動相的性質(zhì)影響。實(shí)踐中主要靠調(diào)整流動相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數(shù)差異及適宜的保留時間，達(dá)到分離的目的?，F(xiàn)在是14頁\一共有55頁\編輯于星期三樣品組分分離情況A.樣品與色譜柱固定相無任何作用

三種樣品在

t0時間流出，

無保留無保留時間B.樣品組分保留時間一致與色譜柱作用力相同

C.樣品組分保留時間不一致

樣品各組分與色譜柱作用力不同

D.實(shí)際分離狀況高斯分布曲線現(xiàn)在是15頁\一共有55頁\編輯于星期三

色譜出峰形狀實(shí)際出峰形狀為高斯分布曲線(Gaussiancurve)樣品的擴(kuò)散效應(yīng)無擴(kuò)散樣品擴(kuò)散現(xiàn)在是16頁\一共有55頁\編輯于星期三

分離度

分離度（Resolution)兩個相鄰峰的分離程度。以兩個組份保留值之差與其平均半峰寬值的比來表示：R=?時兩峰認(rèn)為已分開?現(xiàn)在是17頁\一共有55頁\編輯于星期三

不同分離度

R相鄰兩吸收峰分離度R=1.0,98%,

基線分離R=1.5,99.7%R＞=1.5時，完全分離（中國藥典規(guī)定）兩色譜峰被視為分開現(xiàn)在是18頁\一共有55頁\編輯于星期三

分離度R的數(shù)學(xué)表達(dá)分離度R的基本公式k’:容量因子(capacityfactor)反映吸收峰的保留特性:選擇因子(selectivityfactor)反映相鄰兩色譜峰的分離程度

——色譜過程熱力學(xué)因素N:理論塔板數(shù)，反映色譜柱的分離效率

(columnefficiency)——色譜過程動力學(xué)因素有關(guān)R=1/4Nxxk'1+k'-1柱效選擇因子容量因子現(xiàn)在是19頁\一共有55頁\編輯于星期三

容量因子k’測量溶質(zhì)在固定相和流動相中分布的摩爾數(shù)（量）之比

與溫度有關(guān)(GC)與流動相溶劑種類及組成有關(guān)(LC)Injectiont0t’RtR現(xiàn)在是20頁\一共有55頁\編輯于星期三k’決定樣品能進(jìn)入色譜柱固定相的量k’太小，在固定相上保留太短，很快流出，難以確定保留時間

k’太大，在固定相上保留太強(qiáng)，洗脫時間太長，

理想的k’為1～5

現(xiàn)在是21頁\一共有55頁\編輯于星期三

分離效果與

k’值的最優(yōu)化

k’值的優(yōu)化改變?nèi)軇┏煞帧⑻荻葪l件

(洗脫強(qiáng)度)現(xiàn)在是22頁\一共有55頁\編輯于星期三

選擇因子

色譜柱分開兩組份的能力

＞1時兩組分分離表示兩組分在兩相間的平衡分配熱力學(xué)性質(zhì)的差異，即分子間相互作用力的差異。t0t’R1t’R2Injection現(xiàn)在是23頁\一共有55頁\編輯于星期三選擇因子

的影響因素影響

的因素

改變流動相成分，包括改變

pH

值改變柱溫

(在LC不明顯)改變固定相成分使用特殊化學(xué)效應(yīng)現(xiàn)在是24頁\一共有55頁\編輯于星期三理論板數(shù)

N塔板理論熱力學(xué)平衡理論色譜柱效的量化從分餾法技術(shù)衍生而來分離法依組分揮發(fā)性不同而分餾色譜法依組分分配系數(shù)不同而分離分配系數(shù)

K=Cs/Cm理論板數(shù)

N、塔板高度

H柱效隨

N增大和

H減小而增加分配色譜流程模型N=L/H現(xiàn)在是25頁\一共有55頁\編輯于星期三理論塔板數(shù)N

與半峰寬W1/2和保留時間的關(guān)系如下在相同保留時間色譜峰越尖銳，則色譜柱效越高

現(xiàn)在是26頁\一共有55頁\編輯于星期三

分離效能的最優(yōu)化增加容量增加選擇因子增加柱效增加k’值可增加分離度但會增加分析時間改變流動相、固定相成分

增加值可增加分離度但不能因此影響

k’值現(xiàn)在是27頁\一共有55頁\編輯于星期三液相色譜儀設(shè)備概述現(xiàn)在是28頁\一共有55頁\編輯于星期三液相色譜儀器組成溶劑傳輸系統(tǒng)（泵系統(tǒng)）進(jìn)樣系統(tǒng)檢測器工作站組分收集（選項(xiàng)）現(xiàn)在是29頁\一共有55頁\編輯于星期三液相色譜儀器結(jié)構(gòu)組成示意圖流動相儲液瓶單元或多元泵梯度混合器預(yù)柱手動-進(jìn)樣器自動-進(jìn)樣器保護(hù)柱色譜柱柱后反應(yīng)器柱溫箱檢測器餾分收集器積分儀工作站計(jì)算機(jī)接口溫度控制單元樣品制備單元現(xiàn)在是30頁\一共有55頁\編輯于星期三3.樣品分析方法開發(fā)

現(xiàn)在是31頁\一共有55頁\編輯于星期三現(xiàn)在是32頁\一共有55頁\編輯于星期三樣品預(yù)處理樣品預(yù)處理的目的是為了純化樣品。完成純化的方法有:稀釋-

用一種互溶的且比流動相弱的溶劑或流動相本身稀釋樣品過濾-

有不同孔徑的過濾材料.

提示:有的化合物可能吸附在過濾器上，從而影響定量.離心-

可除去樣品中的顆粒物質(zhì).萃取-液液萃取，固相萃取揮發(fā)-采用惰性氣體通過樣品鼓泡或抽真空除去溶劑樣品準(zhǔn)備現(xiàn)在是33頁\一共有55頁\編輯于星期三優(yōu)化概覽優(yōu)化應(yīng)當(dāng)是系統(tǒng)進(jìn)行的，也就是說每個參數(shù)應(yīng)當(dāng)逐步變化.

!!每次運(yùn)行只改變一個參數(shù)!!目標(biāo)是在最短的分析時間內(nèi)獲得最好的分離結(jié)果.

優(yōu)化溶劑強(qiáng)度

流速

溫度

柱長

固定相*優(yōu)化現(xiàn)在是34頁\一共有55頁\編輯于星期三流動相的選擇流動相的選擇原則是：①樣品易溶，且溶解度盡可能大。②化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不損壞柱子。③不妨礙檢測器檢測，紫外波長處無吸收。④粘度低，流動性好。⑤易于從其中回收樣品。⑥無毒或低毒，易于操作。⑦易于制成高純度，即色譜純。⑧廢液易處理，不污染環(huán)境。反相色譜最常用的流動相及其沖洗強(qiáng)度如下：

H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜異丙醇＜四氫呋喃正相色譜常用的流動相及其沖洗強(qiáng)度的順序是：正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜異丙醇現(xiàn)在是35頁\一共有55頁\編輯于星期三系統(tǒng)方法開發(fā))選擇初始色譜柱(直徑,長度,填料粒度）-4.6x250mm,5m使用適當(dāng)?shù)目讖匠跏歼\(yùn)行采用與流動相組成條件一致的pH)優(yōu)化k*(保留)梯度范圍,時間,斜率流動相-很小變化)優(yōu)化回收率樣品的溶解性溫度的作用鍵合相的作用有機(jī)改性劑)優(yōu)化

*

(選擇性)溫度鍵合相pH(最后的手段))優(yōu)化

N(色譜柱條件)流速長度填料粒度現(xiàn)在是36頁\一共有55頁\編輯于星期三分離度與k’,N,和的關(guān)系初始改變k'提高N提高a梯度范圍,斜率流速,填料粒度,柱長溫度、流動相、pH優(yōu)化現(xiàn)在是37頁\一共有55頁\編輯于星期三色譜的定性分析色譜定性分析:

用保留值定性和色譜聯(lián)用技術(shù)（如LC-MS、LC-FTIR)定性利用保留值定性基本依據(jù)：兩個相同的物質(zhì)在相同的色譜條件下應(yīng)該有相同的保留值。但是，相反的結(jié)論卻不成立，即在相同的色譜條件下，具有相同保留值的兩個物質(zhì)不一定是同一個物質(zhì)利用已知物直接對照進(jìn)行定性分析用絕對保留值定性－－一般要求用自動進(jìn)樣用相對保留值定性用已知物增加峰高法定性利用文獻(xiàn)值對照進(jìn)行定性分析－－采用保留指數(shù)(I)現(xiàn)在是38頁\一共有55頁\編輯于星期三檢測器信號響應(yīng)與時間的關(guān)系測量每個峰的保留時間tR1t0tR2timesignal現(xiàn)在是39頁\一共有55頁\編輯于星期三色譜的定量分析檢測器信號響應(yīng)與時間的關(guān)系測量每個峰的峰面積現(xiàn)在是40頁\一共有55頁\編輯于星期三定量分析的基本公式：

Mi–i組分的量；Ai–i組分的峰面積；fi–i組分的校正因子，與檢測器的行為和被測組份的行為有關(guān)。定量分析的依據(jù)是被測組分的量與響應(yīng)信號成正比，但相同含量的物質(zhì)由于物理、化學(xué)性質(zhì)的差別，即使在同一檢測器上產(chǎn)生的信號也不同，直接用響應(yīng)信號定量，必然導(dǎo)致較大誤差。故引入校正因子。校正因子是定量計(jì)算公式中的比例常數(shù)，其物理意義是單位面積所代表的被測組分的量。

現(xiàn)在是41頁\一共有55頁\編輯于星期三1.面積百分法(AreaPercent)2.外標(biāo)法(ExternalStandard)3.內(nèi)標(biāo)法(InternalStandard)4.歸一化法(NormalizedPercent)色譜定量分析方法的種類現(xiàn)在是42頁\一共有55頁\編輯于星期三面積百分法

最簡單的計(jì)算方法樣品中的所有成分對檢測器的響應(yīng)值相同樣品中的所有成分必須完全分離表示樣品中單一組份相對于其他組份的含量

面積%=(AI/ΣA)*100AI=單一色譜峰的面積

ΣA=全部色譜峰的面積之和不要求進(jìn)樣量準(zhǔn)確不適用于選擇性檢測器現(xiàn)在是43頁\一共有55頁\編輯于星期三歸一化法(Normalized%)將樣品中所有組份的含量之和定為100%。計(jì)算其中某一組份百分含量的定量方法：其中：xi－試樣中組份I的百分含量

fi－組份I的校正因子

Ai－組份I的峰面積或峰高現(xiàn)在是44頁\一共有55頁\編輯于星期三歸一化法示例

化合物 峰面積 校正因子 峰面積×校正因子 百分比含量C8 200 1.2 240 240/1708=14.1%C12 230 1.6 368 368/1708=21.5%C16 200 1.8 360 360/1708=21.1%C18 300 1.8 540 540/1708=31.6%C20 100 2.0 200

200/1708=11.7% 1030 1708 100%優(yōu)點(diǎn)：方法簡便，進(jìn)樣量與載氣流速的影響不大缺點(diǎn)：樣品中所有組份必須都能出峰，并且必須知道各自組份的校正因子（校正因子需要由已知的標(biāo)準(zhǔn)品來求得）。歸一化法主要用于氣相色譜的定量測定。且一般只適用于通用型檢測器?，F(xiàn)在是45頁\一共有55頁\編輯于星期三直接峰面積歸一化－－無校正因子法%(NOCalibration)當(dāng)樣品中各組份的校正因子近似相等，如同系物或同分異構(gòu)體，可直接用峰面積歸一化進(jìn)行定量。即簡化為下式：示例：給出了采用校正因子和不用校正因子進(jìn)行歸一化法的定量結(jié)果組份乙苯對二甲苯間二甲苯鄰二甲苯峰面積（Ai）校正因子（fi’）f’*Ai1200.97116751.00751400.961341050.98103校正因子歸一化法定量結(jié)果直接峰面積歸一化定量結(jié)果27.027.217.517.131.331.824.123.9現(xiàn)在是46頁\一共有55頁\編輯于星期三多點(diǎn)校正的定量分析單點(diǎn)校準(zhǔn)峰面積進(jìn)樣量峰面積進(jìn)樣量響應(yīng)值=樣品量unn=峰面積響應(yīng)值峰面積進(jìn)樣量多點(diǎn)校準(zhǔn)現(xiàn)在是47頁\一共有55頁\編輯于星期三外標(biāo)法（ExternalStandard)－又稱校正曲線法在相同分析條件下，比較標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與樣品的色譜峰面積或峰高1.用已知的標(biāo)準(zhǔn)品配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列，在與被測樣品相同的色譜條件下，等體積準(zhǔn)確進(jìn)樣，測量各種濃度的峰高或峰面積，繪制響應(yīng)信號與百分含量的關(guān)系曲線；2.測量樣品的峰面積或峰高，在校正曲線上查出其對應(yīng)的百分含量?，F(xiàn)在是48頁\一共有55頁\編輯于星期三外標(biāo)法定量現(xiàn)在是49頁\一共有55頁\編輯于星期三濃度峰面積標(biāo)準(zhǔn)1127187標(biāo)準(zhǔn)24012845標(biāo)準(zhǔn)38021437標(biāo)準(zhǔn)412027557標(biāo)準(zhǔn)514031440樣品結(jié)果直接在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上讀出，非常簡單，尤其對大量樣品分析時特別適合。要求進(jìn)樣量、色譜分析條件嚴(yán)格不變；容易出現(xiàn)較大誤差?，F(xiàn)在是50頁\一共有55頁\編輯于星期三內(nèi)標(biāo)法(Interna