Taqman探針設(shè)計要領(lǐng)課件

定量——

絕對標準曲線方法標準品：純化的質(zhì)粒dsDNA，體外轉(zhuǎn)錄的RNA

準確配制標準系列并且注意其穩(wěn)定性，最好分裝后保存于-80℃

熒光材料：雜交探針、水解探針或SYBRGreenI不可以使用DNA作為標準品對RNA進行定量應(yīng)用于定量病毒荷載量等定量——

相對標準曲線方法指在測定目的基因的同時測定某一內(nèi)對照基因，用一系列已知外參物做標準曲線，根據(jù)該標準曲線得到目的基因和內(nèi)對照基因的量，再將目的基因的同內(nèi)對照基因的比值作為定量的最后結(jié)果標準品：含有目標基因的DNA或RNA一般選用看家基因校正常選擇看家基因GAPDH、β-actin、rRNA在假設(shè)樣品逆轉(zhuǎn)錄效率相同的前提下，可以使用DNA的標準曲線對RNA進行定量較常用的一種方法比較Ct法

假設(shè)目的基因與看家基因擴增效率相同，數(shù)學(xué)推導(dǎo)得出目的基因的量=2-ΔΔCt

ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照

2-ΔΔCt表示的是實驗組目的基因的表達相對于對照組的變化倍數(shù)在目的基因與看家基因擴增效率相同的情況下可以直接得到的目的基因相對于管家基因的定量，而不必制作標準曲線

更為簡便省時，也是相當可靠的影響敏感度的因素

反應(yīng)體系中形成的引物二聚體的影響可以用水解探針代替SYBRGreenI，有文獻報導(dǎo)使用水解探針的敏感性要比SYBRGreenI高出10倍?？梢允褂脽釂愚k法或使用特殊處理的Taq酶要盡可能地優(yōu)化引物設(shè)計如果反應(yīng)體系中出現(xiàn)PCR的抑制因素，應(yīng)適當將目的基因的濃度稀釋后再進行擴增。注意避免室溫混合各種試劑，并且在一經(jīng)混合后立即開始進行擴增。循環(huán)數(shù)Mg2＋的濃度

應(yīng)用對各種基因表達進行定量分析基礎(chǔ)研究：不同組織、用藥前后、不同發(fā)育階段基因表達差異的檢測臨床：細菌、病毒、寄生蟲等病原體的檢測

DNA、mRNA病毒荷載量的定量腫瘤相關(guān)基因、腫瘤標志物和腫瘤耐藥基因的檢測食品衛(wèi)生檢疫：轉(zhuǎn)基因食品瘟疫流行地區(qū)進口的食品點突變分析和等位基因分析單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析DNA甲基化檢測如何設(shè)計熒光定量PCR實驗方案根據(jù)擬要研究的基因名稱，在genebank中找到相應(yīng)的基因序列（）采用引物設(shè)計軟件PrimerExpress2.0(Taqman探針或SYBRGreenI，說明見

)和beacondesigns3.0進行引物探針的設(shè)計

軟件可在下載

PCR產(chǎn)物大小在50-150bpTaqMan探針設(shè)計原則保持G-C含量在30-80%之間避免同一堿基重復(fù)過多。特別是G，不可超過4個及以上5’不能是G盡量使探針中的C多于G上述兩條如果不能滿足，則使用互補鏈上的探針對于單探針反應(yīng)，用PrimerExpress軟件計算出來的Tm值應(yīng)當在68-70℃之間，比引物高10℃。長度<30bp引物和探針的設(shè)計原則的重要程度由上往下越來越低如果是設(shè)計SYBRGreenI引物，也要選擇TaqManPrimerandProbedesign并遵守這些規(guī)則，但是只需要合成引物就可以了。為了確保引物和探針的特異性，最好將設(shè)計好的序列在中核實一次，如果發(fā)現(xiàn)由非特異性互補區(qū)，建議重新設(shè)計引物探針。如何設(shè)計熒光定量PCR實驗方案根據(jù)儀器和個人的喜好，確定熒光定量PCR的方法，選擇熒光素的種類合成引物和探針收集樣品、提取RNA或DNA（-80℃保存，避免反復(fù)凍融

）制備標準品（質(zhì)粒、化學(xué)