培養(yǎng)基的滅菌課件

第五章培養(yǎng)基及設(shè)備的滅菌第一節(jié)培養(yǎng)基滅菌的目的、要求和方法第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎(chǔ)第三節(jié)培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì)培養(yǎng)基滅菌的要求和方法1，培養(yǎng)基滅菌的定義是指從培養(yǎng)基中殺滅有生活能力的細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)體及其孢子，或從中將其除去。工業(yè)規(guī)模的液體培養(yǎng)基滅菌，殺滅雜菌比除去雜菌更為常用。2，滅菌與消毒的區(qū)別滅菌：用物理或化學(xué)方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物，包括營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌芽孢和孢子消毒：用物理或化學(xué)方法殺死物料、容器、器皿內(nèi)外的病源微生物。培養(yǎng)基滅菌的目的、要求和方法工業(yè)上具體措施

1）使用的培養(yǎng)基和設(shè)備須經(jīng)滅菌；

2）好氧培養(yǎng)中使用的空氣應(yīng)經(jīng)除菌處理；

3）設(shè)備應(yīng)嚴(yán)密，發(fā)酵罐維持正壓環(huán)境；

4）培養(yǎng)過(guò)程中加入的物料應(yīng)經(jīng)過(guò)滅菌；

5）使用無(wú)污染的純粹種子。培養(yǎng)基滅菌的目的、要求和方法培養(yǎng)基滅菌的要求達(dá)到要求的無(wú)菌程度（10-3）盡量減少營(yíng)養(yǎng)成分的破壞，在滅菌過(guò)程中，培養(yǎng)基組分的破壞，是由兩個(gè)基本類(lèi)型的反應(yīng)引起的：培養(yǎng)基中不同營(yíng)養(yǎng)成分間的相互作用；對(duì)熱不穩(wěn)定的組分如氨基酸和維生素等的分解。主要滅菌方法滅菌的方法化學(xué)法化學(xué)藥品滅菌法物理法干熱滅菌法熱滅菌法射線(xiàn)滅菌法干熱滅菌法：將金屬制品或清潔玻璃器皿放入電熱烘箱內(nèi)，在150～170℃下維持1～2h后，即可達(dá)到徹底滅菌的目的。

在這種條件下，可使細(xì)胞膜破壞、蛋白質(zhì)變性、原生質(zhì)干燥，以及各種細(xì)胞成分發(fā)生氧化。灼燒：是一種最徹底的干熱滅菌方法，但它只能用于接種環(huán)、接種針等少數(shù)對(duì)象的滅菌。主要滅菌方法濕熱滅菌法，多數(shù)細(xì)菌和真菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞在60℃左右處理5～10min后即可殺死；酵母菌和真菌的孢子用80℃以上的溫度處理才能殺死；而細(xì)菌的芽孢一般要在120℃下處理15min才能殺死。巴氏消毒法（pasteurization）：目的是殺死其中無(wú)芽孢的病原菌（如牛奶中的結(jié)核桿菌或沙門(mén)氏菌），而又不影響它們的風(fēng)味。巴氏消毒法是一種低溫消毒法.主要滅菌方法常規(guī)加壓滅菌法：盛有適量水的加壓蒸汽滅菌鍋加熱煮沸，徹底驅(qū)盡后將鍋密閉，再繼續(xù)加熱至121℃（壓力為1kg／cm2或15磅／英寸2），時(shí)間維持15～20分鐘，也可采用在較低的溫度（115℃，即0.7kg／cm2或10磅／英寸2）下維持35分鐘的方法。適合于一切微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)療保健機(jī)構(gòu)或發(fā)酵工廠中對(duì)培養(yǎng)基及多種器材、物料的滅菌。連續(xù)加壓滅菌法：在發(fā)酵行業(yè)里也稱(chēng)“連消法”。此法只在大規(guī)模的發(fā)酵工廠中作培養(yǎng)基滅菌用。將培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外連續(xù)不斷地進(jìn)行加熱、維持和冷卻，然后才進(jìn)入發(fā)酵罐。培養(yǎng)基一般在135～140℃下處理5～15秒鐘。主要滅菌方法高溫對(duì)培養(yǎng)基成分的影響：

主要滅菌方法消除高溫有害影響的措施采用特殊加熱滅菌法；含易破壞成分的培養(yǎng)基應(yīng)與其他成分分別滅菌后再合并，或者進(jìn)行低壓滅菌；對(duì)含Ca2+或Fe3+的培養(yǎng)基與磷酸鹽先分別滅菌，再混合，避免產(chǎn)生磷酸鹽沉淀。主要滅菌方法濕熱滅菌相關(guān)定義殺死微生物的極限溫度稱(chēng)為致死溫度。在致死溫度下，殺死全部微生物所需的時(shí)間稱(chēng)為致死時(shí)間；在致死溫度以上，溫度愈高，致死時(shí)間愈短。微生物的熱阻：是指微生物在某一特定條件（主要是溫度和加熱方式）下的致死時(shí)間。相對(duì)熱阻是指某一微生物在某條件下的致死時(shí)間與另一微生物在相同條件下的致死時(shí)間的比值。主要滅菌方法各種微生物對(duì)濕熱的相對(duì)熱阻微生物相對(duì)熱阻營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和酵母1.0細(xì)菌芽孢3×106霉菌孢子2~10病毒和噬菌體1~5主要滅菌方法培養(yǎng)基成分對(duì)滅菌的影響油脂，糖類(lèi)及一定濃度的蛋白質(zhì)可增加微生物的耐熱性，另一些物質(zhì)，如高濃度的鹽類(lèi)，色素等可削弱其耐熱性。培養(yǎng)基的物理狀態(tài)對(duì)滅菌的影響培養(yǎng)基中微生物數(shù)量對(duì)滅菌的影響培養(yǎng)基中氫離子濃度對(duì)滅菌的影響培養(yǎng)基中氫離子濃度直接影響滅菌的效果。培養(yǎng)基的酸堿度越大，所需殺滅微生物的溫度越低。主要滅菌方法濕熱滅菌的優(yōu)點(diǎn)蒸汽來(lái)源容易，操作費(fèi)用低，本身無(wú)毒；蒸汽有強(qiáng)的穿透力，滅菌易于徹底；蒸汽有很大的潛熱；操作方便，易管理。濕熱滅菌的理論基礎(chǔ)培養(yǎng)基濕熱滅菌需解決的工程問(wèn)題將培養(yǎng)基中的雜菌總數(shù)N0殺滅到可以接受的總數(shù)N（10-3），需要多高的溫度、多長(zhǎng)的時(shí)間為合理。滅菌溫度和時(shí)間的確定取決于：雜菌孢子的熱滅死動(dòng)力學(xué)反應(yīng)器的形式和操作方式培養(yǎng)基中有效成分受熱破壞的可接受范圍第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎(chǔ)二、微生物的熱死滅動(dòng)力學(xué)方程實(shí)驗(yàn)證明，微生物營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的均相熱死滅動(dòng)力學(xué)符合化學(xué)反應(yīng)的一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，即：N：任一時(shí)刻的活細(xì)菌濃度（個(gè)/L）

t：時(shí)間（min）K：比熱死速率常數(shù)（min-1）第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎(chǔ)細(xì)菌孢子的熱殺滅動(dòng)力學(xué)與營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的有所不同。它表現(xiàn)為非對(duì)數(shù)的死亡動(dòng)力學(xué)。這可能與孢子壁的化學(xué)成分及結(jié)構(gòu)有關(guān)。但當(dāng)溫度超過(guò)120?C時(shí)，熱阻極強(qiáng)的嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子的熱殺滅動(dòng)力學(xué)也接近對(duì)數(shù)死亡動(dòng)力學(xué)即符合一級(jí)反應(yīng)規(guī)律。第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎(chǔ)三、溫度對(duì)K的影響微生物的熱死滅動(dòng)力學(xué)接近一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)它的比熱死滅速率常數(shù)K與滅菌溫度T的關(guān)系可用阿累尼烏斯方程表征

A：頻率因子（min-1）ΔE：活化能（J/mol）

R：通用氣體常數(shù)[J/（mol.k）]第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎(chǔ)細(xì)菌孢子熱死滅反應(yīng)的ΔE很高，而某些有效成分熱破壞反應(yīng)的ΔE較低。將溫度提高到一定程度，會(huì)加速細(xì)菌孢子的死滅速度，縮短滅菌時(shí)間，由于有效成分的ΔE很低，溫度的提高也會(huì)增大其破壞速度，但幅度較小。由于滅菌時(shí)間的顯著縮短，有效成分的破壞反而減少受熱物質(zhì)ΔE（J/mol）維生素B1296232維生素B1鹽酸鹽92048嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子283257肉毒梭菌孢子343088枯草桿菌孢子317984第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎(chǔ)溫度上升，滅菌速率常數(shù)增加的倍數(shù)大于培養(yǎng)基成分破壞的速率常數(shù)倍數(shù)。將溫度提高到一定程度，會(huì)加速細(xì)菌孢子的死滅速度，縮短滅菌時(shí)間，由于有效成分的E’很低，溫度的提高只能稍微增大其破壞速度，但由于滅菌時(shí)間的顯著縮短，有效成分的破壞反而減少.因此，培養(yǎng)基滅菌宜采用“高溫短時(shí)間”滅菌。第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎(chǔ)1/T

lnK第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎(chǔ)滅菌時(shí)溫度從T1T2時(shí)：第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎(chǔ)殺滅細(xì)菌芽孢的活化能E大于維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)破壞的活化能E`(即E>E`)第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎(chǔ)ΔEBS=67000×4.184（J/mol）ΔEVB=22000×4.184（J/mol）將滅菌溫度從105?C提高到127?CKVB從0.02（min-1）提高到0.06（min-1

）KBS從0.12（min-1）提高到40.0（min-1

）嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子和維生素B1的lnK-1/T圖第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎(chǔ)嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子死滅程度為N/N0=10-16時(shí)，滅菌溫度對(duì)維生素B1破壞的影響滅菌溫度（?C）達(dá)到滅菌程度的時(shí)間（min）維生素B1的損失（%）10084399.9911075891207.6271300.851101400.10731500.0151第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎(chǔ)第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎(chǔ)殺菌鍋內(nèi)滅菌培養(yǎng)基及物品滅菌所需壓強(qiáng)0,098MPa,固體培養(yǎng)基維持20-30min，液體培養(yǎng)基維持15-20min，玻璃器皿及用具維持30-60min。種子罐、發(fā)醉罐、計(jì)量罐、補(bǔ)料鑲等的空罐滅菌及管道滅菌

通入蒸汽，使罐內(nèi)蒸汽壓強(qiáng)達(dá)0.147MPa，維持45min。滅菌過(guò)程中從閥門(mén)、邊閥排出空氣，并使蒸汽達(dá)到所有死角。滅菌完畢，關(guān)閉蒸汽后，待罐內(nèi)壓力低于空氣過(guò)濾器壓力時(shí)，通人無(wú)菌空氣保持罐壓0,098MPa

空氣總過(guò)濾器和分過(guò)濾器滅菌從過(guò)濾器上部通入蒸汽，并從上、下排氣口排氣，維持壓強(qiáng)0.174MPa，滅菌完畢，通入壓縮空氣吹干。

種子培養(yǎng)基實(shí)罐滅菌從夾層通人燕汽間接加熱至80℃，再?gòu)娜庸?、進(jìn)風(fēng)管、接種管通人蒸汽直接加熱同時(shí)關(guān)閉夾層蒸汽進(jìn)口閥門(mén)，升溫到121℃，維待30min，谷氨酸發(fā)酵的種子培養(yǎng)基實(shí)罐滅菌為110℃,維持l0min

發(fā)酵培養(yǎng)基實(shí)罐滅菌從夾層或盤(pán)管進(jìn)人蒸汽，間接加熱至90℃,關(guān)閉夾層蒸汽，從取樣管、進(jìn)風(fēng)管、放料管三路進(jìn)蒸汽，直接加熱至121℃，維持10min.谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基實(shí)罐滅菌為105℃，維持25min。第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基連續(xù)滅菌一般培養(yǎng)基為130℃,維持5min。谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基為115℃,維持6-8min。發(fā)酵罐需在培養(yǎng)基滅菌之前直接用蒸汽進(jìn)行空罐滅菌?？障蟛荒芰⒓蠢鋮s，先用無(wú)菌空氣保壓，待滅菌的培養(yǎng)基輸人罐內(nèi)后，才可以開(kāi)冷卻系統(tǒng)進(jìn)行冷卻。油罐(消泡劑罐)滅菌一般條件為0.15--0.18MPa·維持60min。補(bǔ)料實(shí)罐滅菌視物料性質(zhì)而定，如糖水為0.1MPa(120℃)，保溫30min;淀粉料液為121℃維持5min。尿素溶液滅菌常用滅菌條件為105℃,維持5min。第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎(chǔ)第三節(jié)培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì)一、無(wú)菌的標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)微生物熱死滅方程，要求滅菌后達(dá)到絕對(duì)無(wú)菌是很難做到的，也是不必要的。因此在工程設(shè)計(jì)中常取N=10-3二、分批滅菌1，分批滅菌的設(shè)計(jì)在發(fā)酵罐中進(jìn)行實(shí)罐滅菌，是典型的分批滅菌。全過(guò)程包括升溫、保溫、降溫三個(gè)過(guò)程第三節(jié)培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì)孢子熱死亡的規(guī)律符合第三節(jié)培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì)二、分批滅菌因?yàn)樯郎?、冷卻階段T是時(shí)間t的函數(shù)，K不是常數(shù)，所以：

式中Kh是保溫階段的孢子比熱死亡速度常數(shù)第三節(jié)培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì)二、分批滅菌分批滅菌中幾種換熱方式的溫度-時(shí)間變化關(guān)系T：介質(zhì)溫度（K）；T0：介質(zhì)初溫（K）；t：時(shí)間（min）；h：蒸汽相對(duì)于介質(zhì)的熱焓（kJ/kg）；s：蒸汽的重量流率（kg/min）M：介質(zhì)重量(kg)；Cp：介質(zhì)比熱[kJ/(kg.K)]；TH：熱源溫度(K)U：總傳熱系數(shù)[kJ/（m2.min.K）]；q：傳熱速率（kJ/min）C’p：冷卻劑比熱；W：冷卻劑流率；TCO：冷卻劑溫度二、分批滅菌第三節(jié)培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì)培養(yǎng)基間歇滅菌過(guò)程中應(yīng)注意的問(wèn)題溫度和壓力的關(guān)系泡沫問(wèn)題投料過(guò)程中，麩皮和豆餅粉等固形物在罐壁上殘留的問(wèn)題滅菌結(jié)束后應(yīng)立即引入無(wú)菌空氣保壓二、分批滅菌第三節(jié)培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì)三、連續(xù)滅菌的設(shè)計(jì)第三節(jié)培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì)三、連續(xù)滅菌的設(shè)計(jì)第三節(jié)培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì)連續(xù)滅菌流程圖第三節(jié)培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì)連續(xù)滅菌主要設(shè)備套管式連消塔第三節(jié)培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì)噴嘴式連消塔連續(xù)滅菌主要設(shè)備第三節(jié)培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì)噴射加熱器連續(xù)滅菌主要設(shè)備第三節(jié)培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì)薄板換熱器第三節(jié)培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì)維持罐噴淋冷卻器連續(xù)滅菌主要設(shè)備第三節(jié)培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì)培養(yǎng)基的滅菌如果是采用連續(xù)滅菌法。則發(fā)酵罐應(yīng)在加入滅菌的培養(yǎng)基前先行單獨(dú)滅菌。通常是用蒸汽加熱發(fā)酵罐的夾套或設(shè)管并從空氣分布管中通入蒸汽，充滿(mǎn)整個(gè)容器后，再?gòu)呐菤夤苤芯従徟懦?。容器?nèi)的蒸汽壓力保持1公斤，20分鐘。在保溫結(jié)束后，關(guān)鍵是隨即通入無(wú)菌空氣，使容器保持正壓，防止形成真空而吸入帶菌的空氣。第三節(jié)培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì)在發(fā)酵過(guò)程中，往往要向發(fā)酵罐中補(bǔ)入各種不同的料液。這些料液都必需經(jīng)過(guò)滅菌。滅菌的方法則視料液的性質(zhì)、體積和補(bǔ)料速率而定。如果補(bǔ)料量較大，而具有連續(xù)性時(shí)，則采用連續(xù)滅菌較為合適。也有利用過(guò)濾法對(duì)另補(bǔ)料液進(jìn)行除菌。補(bǔ)料液的