熒光定量PCR技術(shù)講座20110525XYY課件

實時熒光定量PCR

(RealtimeQuantitativePCR)RealtimeQuantitativePCRPCR：

偉大的天才發(fā)明UseofLSDSynthesisandself-testingofnovelpsychoactivesubstancesBeliefinastrologyPCR：理想與現(xiàn)實起點定量終點定量起點定量檢測：

--起點量是樣本中未經(jīng)PCR放大之前的模板量--具有重現(xiàn)性，誤差小--“加入了500個拷貝”終點定量檢測：-終點產(chǎn)物量經(jīng)過PCR放大的DNA量--不恒定，誤差大--“生成了500，0000，0000個拷貝”Real-timePCR:

檢測原理非特異性熒光標(biāo)記：

SYBRGreenI特異性熒光標(biāo)記：水解探針：

TaqMan非水解探針：Molecularbeacon

RQReporterQuencherRQ5’3’5’3’SGSGSGSG5’3’5’3’SGSGSGSGEmissionExcitationSYBRGreenI是一種與雙鏈DNA小溝結(jié)合的熒光染料。SYBRGreenI只與雙鏈DNA結(jié)合才能發(fā)出熒光。熒光信號的強度與反應(yīng)體系中所有雙鏈DNA分子成正比。SYBRGreenI工作原理

Taqman工作原理

在退火過程中，探針與靶序列結(jié)合探針被Taq酶的5’-3’

外切酶活性剪切成片斷游離報告基團發(fā)出熒光在延伸過程中，探針部分與靶序列分離熒光信號強度與結(jié)合探針的DNA分子成正比。Real-timePCR

應(yīng)用基因表達分析--相對定量：基因表達量的差異--絕對定量：樣本中核酸的量（拷貝數(shù)、微克）基因型分析--SNP檢測等位基因檢測甲基化檢測

基因表達分析檢測

testsample處理樣本targetgene目的基因referencegene內(nèi)參基因totalRNAcDNAtotalRNAcDNAcalibratorsample對照樣本targetgene目的基因referencegene內(nèi)參基因qPCRqPCR以各自樣本中內(nèi)參基因為標(biāo)桿，比較兩樣本中目的基因的相對豐度。數(shù)據(jù)分析基因表達分析檢測內(nèi)參基因(housekeepinggene)選擇樣本處理與RNA提取–cDNA–qPCRHousekeepingGene

康為產(chǎn)品不同豐度：高豐度

ACTB、GAPDH中等豐度

beta2M低豐度

HPRT1不同物種：人、大鼠、小鼠、豬、牛、羊、雞、斑馬魚、甘蔗等基因表達分析檢測樣本處理與RNA提取–cDNA–qPCR內(nèi)參基因(housekeepinggene)選擇樣本處理與RNA提取外界刺激

–

10分鐘

–

可檢測的表達改變樣品離開定義環(huán)境–

2分鐘內(nèi)

–固定、裂解細胞RNA樣本保存液Trizol超純RNA提取試劑盒RNA的評價與鑒定

-完整性

-純度小心DNA污染！-使用DNaseⅠ-引物設(shè)計

-以RNA作PCR陰性對照

CW0580

CW0592

CW0581

CW2090A

逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄引物選擇下游應(yīng)用：是否檢測其它基因？AbundantRNA的干擾：mRNAortotalRNA？檢測靈敏度是否足夠？逆轉(zhuǎn)錄酶SuperRT逆轉(zhuǎn)錄酶（RNaseH-）HiFi-MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（RNaseH-）引物特異性反應(yīng)效率OligodT中低Randomhexmer低中Specificprimer高高

CW0741

CW0743總原則與普通PCR相同：避免引物二聚體，避免二級結(jié)構(gòu)擴增片段長度（80–300bp)推薦做跨intron設(shè)計引物設(shè)計原則EXON1EXON2INTRON2DNAEXON1EXON2RNA反應(yīng)條件優(yōu)化內(nèi)參基因–

目的基因

--擴增曲線：Ct值--融解曲線：單一特異性產(chǎn)物--標(biāo)準曲線：擴增效率盡量高，目的基因盡可能接近內(nèi)參基因反應(yīng)條件優(yōu)化融解曲線分析--單一特異性產(chǎn)物

將溫度對熒光強度的變化求導(dǎo)

圖2Effciencyslope內(nèi)參基因100%-3.32目的基因Primer278%-4.00

圖1Effciencyslope內(nèi)參基因100%-3.32目的基因Primer195.36%-3.43標(biāo)準曲線分析--擴增效率盡量高--目的基因盡可能接近內(nèi)參基因

10%以內(nèi)反應(yīng)條件優(yōu)化MasterMix的應(yīng)用--熱啟動酶化學(xué)修飾，常溫下完全沒有聚合酶活性，熱復(fù)活需95℃10分鐘

--GoldStar、HotStar非化學(xué)修飾（Oligo修飾、抗體修飾、Mg2+螯合物）熱復(fù)活僅需95℃幾十秒--FastStar--Buffer反應(yīng)增強劑

--減少引物二聚體，進一步提高反應(yīng)特異性

--對于復(fù)雜模板，提高反應(yīng)效率穩(wěn)定劑--dNTP

誤差控制使用Mastermix配置預(yù)混體系設(shè)置生物學(xué)重復(fù)（不同個體）技術(shù)性重復(fù)（復(fù)孔）陰性對照

熒光定量PCR體系2-ΔΔCt法滿足條件：1）內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的擴增效率接近-正負10%2）內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的擴增效率基本為90%-110%

相對定量數(shù)據(jù)分析1、目標(biāo)基因的CT值-內(nèi)參基因的CT值2、待測樣本的ΔCT值-對照樣本的ΔCT值3、計算表達水平比率：2–ΔΔCT=表達量的比值2-△△Ct

法

目的基因內(nèi)參基因目的基因-內(nèi)參基因△Ct待測樣本-對照樣本△△Ct倍數(shù)值fold2-△△Ct

對照樣本30.48523.6256.8601待測樣本27.02522.664.365-2.4955.63728熒光定量產(chǎn)品--染料法

某其它品牌

康為UltraSYBR-cDNA用內(nèi)參actin引物進行擴增，產(chǎn)物片段100bp。-模板濃度進行10倍稀釋，稀釋6個梯度。

康為世紀產(chǎn)品RNA--Trizol--超純RNA提取試劑盒--動物組織RNA--植物RNA--血液RNA--病毒RNA

逆轉(zhuǎn)錄--SuperRT/HiFi-MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶--cDNA第一鏈合成試劑盒--RT-PCR一步法、兩步法試劑盒熒光定量PCR--UltraSYBRMixture--FastSYBRMixture--GoldStarTaqmanMixturePCR--GoldStarDNAPolymerase--Taq/EsTaqDNAPolymerase--Taq/EsTaqMasterMixqPCR反應(yīng)優(yōu)化

外包服務(wù)Housekeepinggene–引物序列？反應(yīng)條件？目標(biāo)基因–引物序列？反應(yīng)條件？選擇試劑，摸索條件，優(yōu)化參數(shù)–兩個月？CoWin解決方案一：Primerassay客戶指定：物種，housekeepinggene，目標(biāo)基因客戶得到：經(jīng)實驗優(yōu)化、驗證過的引物，反應(yīng)條件參數(shù)，Ma