分子生物學(xué)許曉東6課件

6分子生物學(xué)研究方法（下）——基因功能研究技術(shù)6.1基因表達(dá)研究技術(shù)基因表達(dá)系列分析技術(shù)RNA的選擇性剪接技術(shù)原位雜交技術(shù)基因定點(diǎn)突變技術(shù)6.1.1基因表達(dá)系列分析技術(shù)SAGE（serialanalysisofgeneexpression）是以DNA序列測定為基礎(chǔ)分析全基因組表達(dá)模式的技術(shù)。任何長度超過9-10個堿基的核苷酸片段都可能代表一種特異性的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，因此，根據(jù)某個序列占總標(biāo)簽數(shù)的比例可分析所對應(yīng)基因的表達(dá)頻率。

LongSAGE技術(shù)。標(biāo)簽來自轉(zhuǎn)錄物3’端一段21bp的序列，可以進(jìn)行快速分析并與基因組序列數(shù)據(jù)相匹配。其原理與ShortSAGE方法類似，只是用了不同的IIS類標(biāo)簽酶（MmeI），并將程序做了相應(yīng)修改。6.1.2RNA的選擇性剪接技術(shù)RNA的選擇性剪接是指用不同的剪接方式從一個mRNA前體產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體的過程?？煞譃椋浩胶饧羟?、5’選擇性剪切、3’選擇性剪切、外顯子遺漏型剪切及相互排斥性剪切。常用RT-PCR法研究某個基因是否存在選擇性剪切。果蠅Dscam基因可以通過可變剪接產(chǎn)生38000多種可能的mRNA異構(gòu)體選擇性剪切的不同類型a.平衡剪切b.5’選擇性剪切c.3’選擇性剪切d.外顯子遺漏型剪切e.相互排斥性剪切RT-PCR檢測5個擬南芥轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因的選擇性剪切6.1.3原位雜交技術(shù)原位雜交（insituhybridization,ISH）是用標(biāo)記的核酸探針，經(jīng)放射自顯影或非放射檢測體系，在組織、細(xì)胞、間期核及染色體上對核酸進(jìn)行定位和相對定量研究的一種手段，分為RNA和染色體原位雜交兩大類。RNA原位雜交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）標(biāo)記的特異性探針與被固定的組織切片反應(yīng)，若細(xì)胞中存在與探針互補(bǔ)的mRNA分子，兩者雜交產(chǎn)生雙鏈RNA，可通過放射性標(biāo)記或經(jīng)酶促免疫顯色，對該基因的表達(dá)產(chǎn)物做出定性定量分析。熒光原位雜交（FISH）首先對寡核苷酸探針做特殊的修飾和標(biāo)記，然后用原位雜交法與靶染色體或DNA上特定的序列結(jié)合，再通過與熒光素分子相耦聯(lián)的單克隆抗體來確定該DNA序列在染色體上的位置。mRNA的互補(bǔ)鏈，雜交信號集中于纖維細(xì)胞中。負(fù)對照，mRNA的同義鏈,無雜交信號。正對照，UBQ10雜交信號遍布于整個胚珠。原位雜交技術(shù)檢測棉花纖維特異基因的表達(dá)6.1.4基因定點(diǎn)突變技術(shù)通過改變基因特定位點(diǎn)核苷酸序列來改變所編碼的氨基酸序列，用于研究某個（些）氨基酸殘基對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、催化活性以及結(jié)合配體能力的影響，也可用于改造DNA調(diào)控元件特征序列、修飾表達(dá)載體、引入新的酶切位點(diǎn)等。目前，主要采用兩種PCR方法，重疊延伸技術(shù)和大引物誘變法，在基因序列中進(jìn)行定點(diǎn)突變。寡核苷酸介導(dǎo)的DNA突變技術(shù)大引物誘變法6.2基因敲除技術(shù)6.2.1基本原理經(jīng)典遺傳學(xué)（Forwardgenetics）是從一個突變體的表型出發(fā)，研究其基因型，進(jìn)而找出該基因的編碼序列?，F(xiàn)代遺傳學(xué)（Reversegenetics，反向遺傳學(xué)）首先從基因序列出發(fā)，推測其表現(xiàn)型，進(jìn)而推導(dǎo)出該基因的功能?；蚯贸╣eneknock-out）又稱基因打靶，通過外源DNA與染色體DNA之間的同源重組，進(jìn)行精確的定點(diǎn)修飾和基因改造，具有專一性強(qiáng)、染色體DNA可與目的片段共同穩(wěn)定遺傳等特點(diǎn)。用取代型（a）或插入型（b）載體進(jìn)行完全基因敲除實(shí)驗(yàn)正負(fù)篩選法（PNS法）篩選已發(fā)生同源重組的細(xì)胞HSV-tk:HerpesSimplexVirusThymidineKinase6.2.2高等動物基因敲除技術(shù)真核生物基因敲除的技術(shù)路線主要包括構(gòu)建重組基因載體，用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞純系中，使外源DNA與胚胎干細(xì)胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中并得以表達(dá)。顯微注射命中率較高，技術(shù)難度相對大些。電穿孔法命中率比顯微注射低，操作使用方便。胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了哺乳動物基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)?；虿东@法原理示意圖6.2.3植物基因敲除技術(shù)T-DNA插入失活技術(shù)是目前在植物中使用最為廣泛的基因敲除手段。利用根癌農(nóng)桿菌T-DNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，將帶有報(bào)告基因的DNA序列整合到基因組DNA上，如果這段DNA插入到目的基因內(nèi)部或附近，就會影響該基因的表達(dá)，從而使該基因“失活”6.3.1酵母單雜交系統(tǒng)真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子具有組件式結(jié)構(gòu)（modular）特征，這些蛋白往往由兩個或兩個以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域，其中DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（bindingdomain，BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activationdomain，AD）是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必須的。酵母單雜交系統(tǒng)是研究DNA-蛋白質(zhì)之間相互作用的技術(shù)。（酵母雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間相互作用的技術(shù)。）將已知順式作用元件構(gòu)建到最基本啟動子（Pmin）的上游，把報(bào)告基因連接到Pmin下游。將編碼待測轉(zhuǎn)錄因子cDNA與已知酵母轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AD）融合表達(dá)載體導(dǎo)入酵母細(xì)胞，該基因產(chǎn)物如果能夠與順式作用元件相結(jié)合，就能激活Pmin啟動子，使報(bào)告基因得到表達(dá)。酵母單雜交的基本原理示意圖從擬南芥cDNA文庫中篩選與順式元件DRE結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子示意圖。6.3.2酵母雙雜交系統(tǒng)6.3.3體外蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)FarWestern印跡技術(shù)GST融合蛋白沉降技術(shù)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)等離子表面共振技術(shù)免疫共沉淀技術(shù)優(yōu)點(diǎn)為：（1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；（2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響；（3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。缺點(diǎn)為：（1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用；（2）兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；6.3.4細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用研究——熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（FRET）FRET熒光能量轉(zhuǎn)移有三個基本條件：給體與受體在合適的距離（1～10nm）；給體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有一定的重疊（這是能量匹配的條件）；給體與受體的偶極具有一定的空間取向（這是偶極-偶極耦合作用的條件）。6.3.5RNAi技術(shù)及其應(yīng)用RNAi（RNAinterference）技術(shù)利用雙鏈小RNA高效、特異性降解細(xì)胞內(nèi)同源mRNA從而阻斷靶基因表達(dá)，使細(xì)胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。RNAi的命名來源于安德魯·法爾1998年在《自然》雜志上的論文。研究發(fā)現(xiàn)，雙鏈RNA是RNAi的觸發(fā)物，引發(fā)與之互補(bǔ)的單鏈RNA（ssRNA,single-strandedRNA）的降解。經(jīng)過Dicer（一種具有RNAaseIII活性的核酸酶）的加工，細(xì)胞中較長的雙鏈RNA（30個核苷酸以上）首先被降解形成21～25個核苷酸的小分子干擾核糖核酸（siRNA，shortinterferingRNA），并有效定位目標(biāo)mRNA。siRNA特征：5‘磷酸、3’羥基，兩條鏈3‘末端有兩個堿基的突出。RNA干擾現(xiàn)象是1990年由約根森（Jorgensen）研究小組在研究查爾酮合成酶對花青素合成速度的影響時，為得到顏色更深的矮牽牛花而過量表達(dá)查爾酮合成酶，結(jié)果意外得到了白色和白紫雜色的矮牽?；?，并且過量表達(dá)查爾酮合成酶的矮牽?；ㄖ胁闋柾铣擅傅臐舛缺日０珷颗；ㄖ械臐舛鹊?0倍。約根森推測外源轉(zhuǎn)入的編碼查爾酮合成酶的基因同時抑制了花中內(nèi)源查爾酮合成酶基因的表達(dá)。RNAi作用機(jī)制示意圖（RISC:RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體）6.4基因芯片及數(shù)據(jù)分析基因芯片（DNAchip），又稱DNA微陣列（DNAmicroarray）技術(shù)是能同時監(jiān)測大量靶基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)手段，從而迅速準(zhǔn)確地在基因組水平上闡述不同生物組織或細(xì)胞中各種轉(zhuǎn)錄本的變化規(guī)律。6.5利用酵母鑒定靶基因功能6.5.1酵母的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)簡介釀酒酵母有穩(wěn)定的單倍體和二倍體細(xì)胞。酵母細(xì)胞有三種交配型：MATa,MATα,MATa/α.兩種不同生殖型的酵母（MATa,MATα）可以通過酵母接合的形式，形成二倍體傳代。MATa/α是二倍體。野生酵母是原養(yǎng)型的。6.5.2酵母基因轉(zhuǎn)化與形狀互補(bǔ)“一步置換法”制備酵母缺失突變體的流程圖“兩步置換法”制備酵母缺失突變體的流程圖6.5.3外源基因在酵母中的功能鑒定將棉花的ω-6脂肪酸脫氫酶轉(zhuǎn)入酵母中……酵母的生理生化特性決定了它適合于動植物基因功能的研究。6.6其他分子生物學(xué)技術(shù)凝膠滯緩實(shí)驗(yàn)噬菌體展示技術(shù)蛋白質(zhì)磷酸化分析技術(shù)6.6.1凝膠滯緩實(shí)驗(yàn)?zāi)z滯緩試驗(yàn)（gelretardationassay），又叫作DNA遷移率變動試驗(yàn)（DNAmobilityshiftassay），是用于體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。在凝膠電泳中，由于電場的作用，裸露的DNA朝正電極移動的距離與其分子量的對數(shù)成反比。如果此時DNA分子與某種蛋白質(zhì)相結(jié)合，那么，由于分子量增大，它在凝膠中的遷移作用便會受到阻滯，在特定電壓和時間內(nèi)朝正電極移動的距離也就相應(yīng)縮短了。擬南芥轉(zhuǎn)錄因子與不同DNA元件有不同的結(jié)合能力。6.6.2噬菌體展示技術(shù)噬菌體可被分為溶菌周期和溶源周期兩種不同的類型。在溶菌周期，噬菌體將其感染的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)變成為噬菌體的“制造廠”，產(chǎn)生出大量的子代噬菌體顆粒。實(shí)驗(yàn)室常將只具有溶菌生長周期的噬菌體叫作烈性噬菌體。溶源生長周期是指噬菌體DNA被整合到宿主細(xì)胞染色體DNA上，成為它的一個組成部分，感染過程中不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒。具有這種溶源周期的噬菌體被稱為溫和噬菌體。原理將編碼“誘餌”蛋白的DNA片段插入噬菌體基因組，并使之與噬菌體外殼蛋白編碼基因相融合。重組噬菌體侵染宿主細(xì)菌后，復(fù)制形成大量帶有雜合外殼蛋白的噬菌體顆粒，直接用于捕獲靶蛋白庫中與“誘餌”相互作用的蛋白質(zhì)。噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用LightChain15aalinkerheavychainTAGPIIIamberPhagemidscanalloweithersolubleexpressionofrecombinantproteininbacteria,ortheproductionofthefusionprote