HPLC樣品前處理技術(shù)課件

高效液相色譜樣品前處理技術(shù)在做樣品之前首先要知道樣品大致情況是純品還是粗品，如果是粗品是哪一類的原料。要了解待測組份的性質(zhì)和化學(xué)結(jié)構(gòu)，才能夠為樣品的前處理和色譜條件的選擇打基礎(chǔ)。上機(jī)分析之前，準(zhǔn)備好樣品、選擇好色譜條件、保證儀器正常運(yùn)行。注：樣品在上機(jī)分析之前一定要過濾流動相要過濾、脫氣在復(fù)雜基體中低濃度有機(jī)化合物的分離和測定是分析化學(xué)所面臨的一個挑戰(zhàn)．雖然分析儀器的自動化程度日益提高，但在發(fā)展分析方法的同時，人們或多或少忽視了樣品的預(yù)處理問題。然而在分析復(fù)雜樣品，如生物樣品、環(huán)境樣品、植物樣品等，為了獲得比較可靠的鑒定結(jié)果,必須花費很多的人力和經(jīng)費，并且由于前處理步驟多，如果前處理不當(dāng)，往往會使全過程的回收率降低，會發(fā)生定性定量錯誤和色譜柱壽命縮短等問題．因此，提高和掌握樣品的前處理技術(shù)是完善檢測全過程的重要環(huán)節(jié)。目前仍沿用溶劑提取、色譜分離或液-液分配等純化方法。

樣品預(yù)處理的內(nèi)容繁多，如液體樣品：直接上機(jī)、稀釋、富集、抽提、離心、過濾后上機(jī)固體樣品：溶解、離心、萃取生物樣品（如，血液、尿液、動物組織及器官等樣品）：預(yù)處理

高效液相色譜分析樣品時沒有統(tǒng)一的前處理方法。必須根據(jù)樣品的種類和待測項目決定前處理方案，但原則上仍應(yīng)考慮幾下操作環(huán)節(jié)：如取樣、試樣的調(diào)制、提取、純化、濃縮等步驟，至于各種具體樣品的前處理可以進(jìn)一步參考有關(guān)資料。

（一）取樣與調(diào)制

固體塊狀樣品的取樣與調(diào)制為了得到較為可靠的結(jié)果，取樣的代表性極為重要。一般取樣操作要點可概括為：第一步隨機(jī)抽樣，抽樣量要根據(jù)樣品數(shù)量而定，第二步再按四分法將試樣縮分到所需的量，第三步再取所需的量。樣品得到后必須進(jìn)行粉碎和混勻，小量樣品可以使用研缽，較多的試樣可使用電動粉碎機(jī)粉碎。粉碎后，應(yīng)通過20一30目篩孔用篩過篩，混合均勻，制得試樣。當(dāng)試樣含水分較多而較難粉碎時，特別是待分析的成分不會因干燥而發(fā)生變化時，需進(jìn)行予干燥。一般將已粉碎的試樣置于60℃烘箱中烘1—2小時，稱取干燥前后的重量，分析維生素類的物質(zhì)時通常不進(jìn)行予干燥。當(dāng)待測成分會因干燥而分解時，只能將原樣進(jìn)行研磨，或加適量溶液研磨，使其成為均勻的分析試樣。水果等樣品可使用研缽。魚肉等樣先用小刀切成小塊后，用絞肉機(jī)絞碎。水果糖等樣，能簡單溶于水或適當(dāng)?shù)娜軇?，可制成溶液，攪拌勻。油脂類也能一次性溶解，使其成為溶液、混勻。牛奶等，因比重不同，溶液上下不均勻，這時可將玻璃管插到底部，在所有的層次取樣，或者用攪拌棒攪勻，取其攪勻的樣品。啤酒、汽水等含碳酸的飲料，在20一25度加熱，完全逐出碳酸后再進(jìn)行分析。貝殼類除去殼，僅將貝肉磨碎。干魚可直接粉碎制備試樣。

（二）提取方法

提取方法：液-液萃取液-固萃取超聲波萃取微波萃取膜技術(shù)：微滲透超濾膜技術(shù)一般親水性溶劑應(yīng)用于提取親水性化物，而疏水性溶劑最適宜提取脂溶性和油溶性化臺物。欲分析物質(zhì)在溶劑中的溶解度是選擇最適宜溶劑時的另一個重要因素。不同類型的樣品需要不同的溶劑。一般用水溶性溶劑提取含水量高的樣品。而用乙腈提取脂溶性或油溶性樣品。氯仿和二氯甲烷是提取干性材料的最適宜溶劑。如果有多種溶劑都適用于提取，那么應(yīng)該首先選用毒性最小的溶劑以保護(hù)分析人員的身體健康。在控制監(jiān)測中，當(dāng)被測成份和樣品類型已知時，理論上可選擇最合適的溶劑。根據(jù)樣品類型和被測成份種類使用不同方法進(jìn)行提取。在實際工作中最廣泛使用的提取溶劑有：二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙腈、乙酸乙脂、苯、乙醇、甲醇、石油醚、已烷等或它們的混合劑。在此基礎(chǔ)上可以得知有廣泛適用性的使用方案(溶劑／樣品／化合物基體)液-液萃取最早被用于樣品的預(yù)處理，這一方法可把有機(jī)化合物直接萃取到與水不相溶的有機(jī)相中，在一定溫度下，溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑分配時，平衡濃度之比為一常數(shù)，這一常數(shù)稱為分配常數(shù)。只有中性分子才能被萃取，兩相中溶質(zhì)總濃度之比為分配系數(shù)，溶質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)與選用的萃取溶劑、水相的pH和有機(jī)溶劑與水相的體積比值相關(guān)。液-液萃取盡可能選用溶質(zhì)有較大溶解度的有機(jī)溶劑，如果溶質(zhì)的萃取回收率較低，可通過連續(xù)多次萃取提高回收率，通常采用過量的有機(jī)溶劑來萃取，以節(jié)省時間。1.1、萃取溶劑的選擇被測化合物的相對疏水性將決定萃取溶劑的選擇，用于液-液萃取的有機(jī)溶劑必須滿足：（1）沸點低，以便可以在完成液-液萃取后很快可將有機(jī)溶劑揮發(fā)；（2）溶劑的粘度低，以使與樣品基本相混合，下表是按溶劑極性排序的一些常用液-液萃取溶劑，表中有機(jī)溶劑在水中的溶解度是一個重要的因素，溶劑在水中的溶解度對萃取液中的共萃取干擾物質(zhì)的含量有重要的影響，一般來說，萃取的有機(jī)溶劑極性越小，萃取的選擇性越好，因此，選擇液-液萃取的有機(jī)溶劑在能溶解樣品的前提下，極性應(yīng)盡可能低。表：一些常用液-液萃取有機(jī)溶劑的物理化學(xué)性質(zhì)

溶劑沸點（℃）溶劑極性（р）在水中的溶解度（%）正己烷690〈0．01環(huán)己烷8100．01氯仿614．40．82二氯甲烷403．41．30乙醚356．04乙酸乙酯774．38．081.3液-液萃取其他操作因素的控制液-液萃取并不能對所有的化合物。強(qiáng)極性化合物取得良好的萃取，如有機(jī)酸或有機(jī)堿，可以在水相中加入適當(dāng)?shù)姆措姾呻x子對試劑，達(dá)到液-液萃取強(qiáng)有機(jī)酸或有機(jī)堿的目的，又如金屬離子，通過在水相中加入鰲和劑與金屬離子形成疏水性的絡(luò)合物達(dá)到萃取金屬離子的效果。（二）液-固萃取

液-液萃取有許多局限，如：需要大量互不相溶的溶劑；樣品處理步驟復(fù)雜；樣品回收率和重復(fù)性不理想；處理過程中乳狀液的生成；溶劑蒸發(fā)時，樣品降解所至的樣品損失。液-固萃取方法采取高效、高選擇性的固定相，液-固萃取主要用于樣品分析前凈化和或富集，凈化操作是樣品分析中最重要的步驟之一。因為在提取操作之后，提取物中既有被測成份又有別的干擾物或共萃物。這些物質(zhì)可由下列化合物組成：探發(fā)性物質(zhì)、胺類、酚類、有機(jī)酸類．糖類、油脂、葉綠素和其他有色物質(zhì)等。

固相萃取的影響因素

固相萃取一般有四個基本步驟：固定相活化；樣品上柱；淋洗；分析物洗脫?；罨哪康氖莿?chuàng)造一個與樣品溶劑相溶的環(huán)境并除去柱內(nèi)所有的雜質(zhì)，通常需要兩種溶劑來完成，第一個溶劑（初溶劑）用于凈化固定相，第二個溶劑（終溶劑）用于建立一個合適的固定相環(huán)境使樣品分析物得到適當(dāng)?shù)谋Ａ?。每一活化溶劑用量約1—2ml/100mg固定相。淋洗分析物得到保留后，通常需要淋洗固定相以洗掉不需要的樣品組分;淋洗溶劑的洗脫強(qiáng)度是略強(qiáng)于或等于上樣溶劑，淋洗溶劑必須盡量地弱，以洗掉多的干擾組分，但不能強(qiáng)到可以把所有分析物都洗掉的程度;溶劑的體積為0.5-0.8mL/100mg固定相，淋洗步驟也能確保粘壁在樣品都進(jìn)入固定相。

洗脫淋洗后再將分析物從固定相上洗脫下來。洗脫溶劑的體積為0.5-0.8mL/100mg固定相，溶劑必須認(rèn)真選擇。溶劑太強(qiáng)，一些不要的組分將被洗出來，溶劑太弱，就需要更多的洗脫液。在溶劑選擇上還有幾點值得注意，有時在上樣、淋洗和洗脫時一個溶劑太強(qiáng)，另一個溶劑太弱，可以把兩者混合，通過改變它們的比例來滿足要求。另一值得注意的問題是溶劑的互溶性，后一種流過柱床的溶劑必須與