10基因工程-基因文庫的構建課件

第六部分基因文庫的構建一、基因文庫的概述二、基因組DNA文庫的構建三、cDNA文庫的構建1、基因文庫(genelibrary)概念是指將某種生物的全部基因組的遺傳信息貯存在可以長期保存的穩(wěn)定的重組體中，以備需要時能夠隨時應用它分離所需要的目的基因，這種保存基因遺傳信息的材料，就稱為基因文庫又稱DNA文庫?；蛭膸煊赏庠碊NA片段、載體和宿主細胞組成。一、基因文庫的概述2、基因文庫的分類基因組DNA：提取的染色體基因組DNA。如果要研究的是控制基因表達的調控序列，或是在mRNA中不存在的某種特定序列，有關這類的信息就只能從染色體基因組DNA中獲得。cDNA：mRNA反轉錄成的cDNA。如果研究的目標是弄清一種蛋白質的氨基酸順序，可以根據(jù)克隆的cDNA分子的核苷酸序列直接推導出來。基因組文庫（genomiclibrary）含有全部基因。cDNA文庫（cDNAlibrary）含有全部蛋白質編碼的結構基因。(1)基因組文庫(Genomiclibrary)是指將某種生物體的全部基因組DNA用限制性內切酶或機械力量切割成一定長度范圍的DNA片段，再與合適的載體在體外重組并轉化相應的宿主細胞獲得的所有陽性菌落，這個群體就稱為該生物基因組文庫。目的是分離有用的目的基因和保存某種生物的全部基因?；蚪M文庫根據(jù)DNA來源分為：核基因組文庫、葉綠體基因組文庫、線粒體基因組文庫?？寺⊥庠碊NA片段的切割主要采用機械斷裂或限制性部分酶解兩種方法，其基本原則：①DNA片段之間存在部分重疊序列。②DNA片段大小均一。(2)cDNA文庫(cDNAlibrary)：是指將某種生物體某一發(fā)育時期所轉錄的全部mRNA經(jīng)反轉錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。cDNA(complementaryDNA，互補DNA)：是由生物的某一特定器官或特定發(fā)育時期細胞內的mRNA經(jīng)體外反轉錄后形成的互補DNA。基因組文庫與cDNA文庫的最大區(qū)別：基因組文庫含有而cDNA文庫不含有非轉錄的基因組序列。2023/4/1863、構建基因文庫的基本方法將特定生物體的因組DNA或cDNA分解成適當大小的DNA片段,然后分別與克隆載體連接成重組DNA分子。通過轉化或轉導的方法將帶有不同DNA片段的重組DNA分子導入受體細胞，獲得一套包含特定生物體所有DNA序列的克隆。二、基因組文庫的構建(一)基因組文庫的類型根據(jù)所選用的載體可以分為：質粒文庫、噬菌體文庫、粘粒文庫、人工染色體文庫（細菌人工染色體文庫、酵母人工染色體文庫等）。（三）基因組DNA文庫的質量標準除了盡可能高的完備性外，一個理想的基因組DNA文庫應具備下列條件：重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分隔克隆。克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以利于克隆排序?？寺∑我子趶妮d體分子上完整卸下。重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選?！?四)基因組文庫構建的一般步驟

①載體的選擇和制備。②高純度、大分子量基因組DNA的提取。③基因組DNA的部分酶切與分級分離。④載體與DNA片段的連接。⑤轉化或侵染宿主細胞。⑥篩選鑒定基因組及保存。

②基因組DNA的制備為了最大限度保證基因在克隆過程中的完整性，用于基因組文庫構建的DNA在分離純化操作中應盡量避免過度的斷裂。制備的DNA分子量越大（至少是插入片斷大小的3－5倍），文庫的重組率和完備性也就越高。用常規(guī)方法制備的染色體DNA的長度一般在100kb左右如果先將細胞固定在低融點凝膠中，然后置入含有SDS蛋白酶K、RNaseA的緩沖液中浸泡，可獲得>100kb大小的DNA片段。AAAA③基因組DNA的切割用于基因組文庫構建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和限制性內切酶部分酶切兩種方法，其目的是：①保證DNA片段之間存在部分重疊區(qū)。②保證DNA片段大小均一。超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭。部分酶切法一般選用4堿基識別序列的限制性內切酶，如：Sau3A或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機連為一體！?。、茌d體與DNA片段的連接在基因組文庫的構建過程中，大量體系連接前先使用小體系連接來尋找最佳比例！方法一：粘末端連接方法二：人工接頭法⑤轉化或侵染宿主細胞在基因組文庫的構建過程中，最好選擇轉化效率高的。進口感受態(tài)細胞和質量穩(wěn)定的進口包裝蛋白?。嫿ɑ蚪M文庫應注意的問題構建一個文庫，插入DNA和載體DNA的質量是成功與否的關鍵?；蚪MDNA應當非常純以適應DNA的酶解，而且基因組DNA也應足夠大（最好超過200kb）以獲得兩個末端的消化產物。不論是載體DNA還是靶DNA不含外源片段是一個基本條件。污染少量探針順序或載體的基因組DNA將引起很大麻煩，這是因為在篩選過程中它們將被鑒定為所要的克隆。部分消化產品應當是一組覆蓋整個基因組的隨機片段。識別4個堿基的限制酶要比識別6個堿基酶能產生更隨機的插入片段。部分消化所產生的片段應能連接到設定的載體上。限制酶和部分消化過程應事先檢查。一些批次的酶質量不夠高而導致產生的DNA片段末端不能有效地連接。如果預期結果沒有出現(xiàn)，檢查限制酶和DNA濃度及純度。在考慮把λ噬菌體臂和插入DNA片段連接過程中有兩個重要參數(shù)：λ噬菌臂和潛在插入片段的比例、基因組DNA的濃度和純度。大約10pgλ噬菌臂和4μgDNA能產生有效地包裝。對一個典型的基因組要產生一個可表達文庫，重組子數(shù)一般要大于1×106~6×l06。包裝抽提物的包裝效率貯存于液氮中可保持1年多。而在-70℃中只能保存幾星期，而且包裝效率還會降低。由于包裝抽提物的質量是一個關鍵性因素，商業(yè)性包裝抽提物，例如Gigapack（Stratagene），都已有商售。這種包裝提取物質量高，且在體外包裝λ噬菌體DNA和插入片段過程能產生大量的噬菌斑。2、酶切片段與載體連接⑴酶切片段及分離、純化基因組的不完全酶切①根據(jù)實驗需要選擇合適的限制性內切酶—四個識別位點的限制酶出現(xiàn)的幾率:1/256—六個識別位點的限制酶出現(xiàn)的幾率:1/1024②分離目的酶切片段大小的確定—克隆單個基因：<10kb—克隆基因族：<20kb③DNA不完全酶切條件的確定—確定限制酶用量，改變酶切時間—固定酶切時間，改變限制酶的用量DNA的不完全酶切酶切片段回收低熔點瓊脂糖回收目的片段試劑盒回收目的片段⑵酶切片段與克隆載體連接克隆載體的選擇：質粒載體可承載15kbDNA左右片段載體可承載25kbDNA左右片段Cosmid

載體可承載45kbDNA左右片段3、重組DNA轉化受體細胞⑴根據(jù)克隆載體的性質選擇合適的受體細胞常見的宿主細胞：DH5、HB101、JM101、JM109⑵重組質粒轉化受體細胞1）轉化法(transformation)2）轉染法(transfection)3）轉導法(transduction)②保存單個克隆子于含有甘油的培養(yǎng)基中方法：從平板上挑選單個克隆子接種于合適的含抗生素的培養(yǎng)基中，菌體生長到一定濃度后，加入終濃度為25%的甘油，于-80℃保存。缺點：需保存的克隆子數(shù)過多，工作量大。⑵基因組文庫的篩選表型篩選法：表達性狀易于鑒別，如互補篩選?？剐院Y選法：如二氫葉酸還原酶可以使三甲芐。二氨嘧啶降解，而該化學物可抑制大腸桿菌生長。分子雜交法：利用分子探針對文庫進行篩選。免疫篩選法：利用多肽等作為抗原進行原位雜交篩選。PCR篩選法：根據(jù)保守序列合成引物,擴增特異性片段。(八)用λ噬菌體載體構建基因組文庫的步驟①準備載體DNA(如置換型λ噬菌體載體)，用適當?shù)南拗菩詢惹泻怂崦赶⒎蛛x得到載體的左右兩臂。②純化真核細胞高分子質量DNA，并用適當?shù)南拗菩詢惹泻怂崦覆糠窒?。③分離適當大小的基因組DNA片段(20-24kb)。④連接載體與外源DNA。⑤連接產物體外包裝及感染。⑥基因組文庫的擴增?；蚪M文庫限制性內切酶基因組DNA基因重組轉化細菌體外包裝三、cDNA文庫構建真核生物基因組大，結構復雜，含有大量的非編碼區(qū)、內含子和重復序列等，直接利用基因文庫很難分離得到目的基因。即使分離到DNA片段，也要同cDNA序列進行比較。mRNA是基因轉錄加工后的產物，且只在特定組織器官和發(fā)育時期表達。因此，從cDNA克隆文庫分離基因更具優(yōu)勢。此外，mRNA決定了功能蛋白質的初始肽鏈的翻譯，可以用來研究蛋白質的功能。(一)cDNA文庫的特征從cDNA文庫獲得的是已經(jīng)過剪接、去除了內含子的cDNA,它不含真核基因的間隔序列及調控區(qū),只反映mRNA的分子結構，并不是真正意義上的基因。cDNA文庫僅包含某種組織或細胞正在表達的基因。基因總量少，顯然比基因組DNA文庫小得多，很容易從中篩選克隆得到細胞特異表達基因。cDNA文庫是有時效性的，文庫構建時的信息供體是某一時空條件下的細胞總mRNA，它是在轉錄水平上反映該生物在某一特定發(fā)育時期，某一特定組織(或器官)在某種環(huán)境條件下的基因表達情況并不能包括該生物有機體的全部基因，不同物種、不同組織的cDNA文庫不同。(二)cDNA文庫的用途cDNA文庫可作為研究功能基因組學的基本手段。cDNA便于克隆和大量表達,因此可以從cDNA文庫中篩選到所需的目的基因,并直接用于該目的基因的表達。cDNA文庫也可用于保護瀕危珍稀生物資源，提供構建分子標記連鎖圖譜的所用探針，可用于分離全長基因，進而開展基因功能的研究。cDNA在研究具體某類特定細胞中基因組的表達狀態(tài)及表達基因的功能鑒定方面具有特殊的優(yōu)勢，在個體發(fā)育、細胞分化、細胞周期調控、細胞衰老和死亡調控等生命現(xiàn)象的研究中具有廣泛的應用價值。(三)cDNA文庫構建的步驟細胞總RNA的提取和mRNA的分離第一鏈cDNA合成第二鏈cDNA合成雙鏈cDNA的分級分離雙鏈cDNA克隆進質?；蚴删w載體并導入宿主中繁殖重組體的篩選與鑒定1、細胞總RNA的提取和mRNA的分離mRNA的來源:選用mRNA含量高的組織材料，或通過藥物等方法提高mRNA的含量。mRNA的制備:動物細胞或植物細胞mRNA的制備mRNA完整性的檢測哺乳動物mRNA長度為500-8000bp，大部分mRNA位于1.5-2.0kb之間。mRNA的提取全長mRNA具有一個polyA的3’末端，可以被用于mRNA的分離?？梢杂霉丫劾w維素柱，選擇性地吸附mRNA。2、第一鏈cDNA的合成oligo(dT)引導的DNA合成法：利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20個脫氧胸腺嘧啶核苷組成的oligo(dT)短片段，由反轉錄酶合成cDNA第一鏈缺點：因為逆轉錄酶無法到達mRNA分子的5’末端，必須從3’末端開始合成cDNA。對于大分子量的較長的mRNA分子無法達到5’末端。cDNA第一鏈的合成隨機引物引導的cDNA合成法：根據(jù)許多可能的序列，合成出6-10個核苷酸長的寡核苷酸短片段（混合物），作為合成第一鏈cDNA的引物。在應用這種混合引物的情況下，cDNA的合成可以從mRNA模板的許多位點同時發(fā)生，而不僅僅從3’末端的oligo(dT)引物一處開始。比較容易合成特長的mRNA分子的5‘端序列隨機引物cDNA合成的方法不適合構建cDNA文庫，一般用于克隆特定mRNA的5'末端，如RT-PCR和5'-RACE。3、第二鏈cDNA的合成cDNA第二鏈的合成就是將上一步形成的mRNA-cDNA雜合雙鏈變成互補雙鏈cDNA的過程。cDNA第二鏈的合成的方法大致4種：

自身引導合成法、置換合成法、引導合成法、引物－銜接頭合成法。自身引導合成法：獲得的單鏈cDNA3’端會形成發(fā)夾結構，以此作為第二鏈合成的引物，在Klenow酶或反轉錄酶的作用下，合成cDNA的第二鏈。缺點：S1核酸酶切割cDNA的發(fā)夾狀結構時，會導致對應于mRNA5’端的地方的序列出現(xiàn)缺失和重排。S1核酸酶的純度不夠時，會偶爾破壞合成的雙鏈cDNA分子。自身合成法：獲得的雙鏈cDNA5’端會有幾對堿基缺失。置換合成法：cDNA第一鏈合成反應的產物cDNAmRNA不經(jīng)變性直接與RNA酶H和大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ混合，此時RNA酶H在雜合雙鏈的mRNA鏈上產生缺口（內切作用）并形成部分cDNA單鏈區(qū)（外切作用）DNA聚合酶Ⅰ則以殘存的mRNA作為引物合成cDNA第二鏈，最后用T4DNA連接酶修復缺口。用這種方法獲得的cDNA雙鏈分子含有殘留的一小段RNA，但這并不影響后續(xù)的克隆操作。優(yōu)點：cDNA雙鏈合成效率高，操作簡捷無需對第一鏈合成產物進行額外的變性處理，更重要的是避免了cDNA雙鏈分子末端的缺損。置換合成法引物合成法：在第一鏈合成完畢后，變性殘留的mRNA，用末端脫氧核苷酰轉移酶在cDNA游離的3’羥基上添加同聚物（dC）末端，然后將之與人工合成的oligodG退火，形成引物結構，在Klenow酶的作用下合成第二條cDNA鏈。引導合成法：獲得的雙鏈cDNA能保留完整的5’端序列引物-銜接頭法4、雙鏈cDNA的分級分離mRNA通過反轉錄形成cDNA，在插入到克隆載體前，通過瓊脂糖凝膠電泳，將不同大小的cDNA分子分離開來。優(yōu)點：避免了分離過程中mRNA被污染的RNA酶降解增加了獲得全長cDNA克隆的概率。獲得更準確的分級分離效果（分子量）。5、雙鏈cDNA克隆進質?；蚴删w載體并導入宿主中繁殖cDNA末端的處理由于大片段的平末端連接效率非常低，因此為了避免用平末端與載體連接，對雙鏈cDNA的末端進行加工是十分必要的。方法：添加特異性核酸接頭以形成適合于克隆的黏性末端。末端轉移酶—可以向cDNA末端加上與克隆載體末端互補的尾部。6、利用PCR技術構建cDNA文庫能夠從極其有限的起始材料中構建cDNA文庫。以總RNA為模板合成cDNA，無需mRNA的純化，不僅簡化操作，而且避免了低豐度信息分子的丟失。能夠提高cDNA文庫的完整性，獲得那些低水平表達的基因的cDNA克隆。此法對植物基因功能的研究，如對某種外界因素作用后或不同發(fā)育階段基因表達變化的研究尤為適用。1、基因組文庫的優(yōu)點基因組文庫的優(yōu)點：基因組文庫可以含有基因組的編碼序列和間隔序列，用于研究基因編碼序列和編碼區(qū)外側調控序列的