分子發(fā)光分析法課件

InstrumentalAnalysis

Chapter11

分子發(fā)射光譜法

MolecularLuminescence-Fluorescence

本章內(nèi)容

6.0引言

6.1分子發(fā)光的基本原理

6.2分子熒光定量分析

6.3熒光光譜儀

6.4熒光光譜法的特點(diǎn)及其干擾因素

6.5熒光光譜法在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用分子發(fā)光按激發(fā)的模式分類：光致發(fā)光化學(xué)發(fā)光生物發(fā)光

分子發(fā)光熒光磷光按光子能量分類：斯托克斯熒光(Stokes)：λex<λem反斯托克斯熒光(Antistokes)：λex>λem共振熒光(Resonance)：λex=λem熒光

分子發(fā)光分析：依據(jù)物質(zhì)分子吸收一定的能量躍遷到較高電子激發(fā)態(tài)后，在返回基態(tài)時有光譜輻射而建立的分子方法。單重態(tài)：如果分子中全部軌道里的電子都是自旋配對的，即s=0,分子的多重度=1,該分子體系處于單重態(tài)基態(tài)(S0):室溫下，分子處于基態(tài)的振動能級。所有電子遵從能量最低原理、Pauli不相容原理和洪特規(guī)則。激發(fā)態(tài):被激發(fā)后,能量變高,屬非穩(wěn)狀態(tài)。單重態(tài)（S）三重態(tài)（T）基態(tài)S0第一電子激發(fā)態(tài)S1第二電子激發(fā)態(tài)S2三重態(tài)T1T2三重態(tài)：如果電子在躍遷過程中還伴隨著自旋方向的改變，這時分子具有兩個自旋不配對的電子洪特規(guī)則：處于分立軌道上的非成對電子，平行自旋要比成對自旋更穩(wěn)定。Pauli不相容原理：分子中同一軌道所占據(jù)的兩個電子必須具有相反的自旋方向，即自旋配對。激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量；傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動弛預(yù)無輻射躍遷

激發(fā)態(tài)停留時間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強(qiáng)度相對大；熒光：10-6～10-9s,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)；磷光：10-4～10s；第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)；1）振動弛豫（VibrationalRelaxation,VR）在同一電子能級中，電子由高振動能級迅速轉(zhuǎn)至該電子能級低振動能級，將多余的能量以分子振動能形式消耗掉一部分，這樣的過程，稱為振動弛豫。

高振動能級→低振動能級發(fā)生振動弛豫的時間：10-12s2）內(nèi)轉(zhuǎn)換（InternalConversion，IC）當(dāng)兩個電子能級非?？拷?以致其振動能級有重疊時，發(fā)生電子由高能級以無輻射躍遷方式轉(zhuǎn)移至低能級，相同多重態(tài)的兩個電子態(tài)間的非輻射躍遷【例】:高電子能能級→→低電子能級S2→→

S1T2→→T1發(fā)生內(nèi)轉(zhuǎn)換的時間：10-13

～10-11s第一電子激發(fā)態(tài)第二電子激發(fā)態(tài)三重態(tài)S2S1基態(tài)S0T1T2第一電子激發(fā)態(tài)第二電子激發(fā)態(tài)三重態(tài)S2S1基態(tài)S0T1T25）熒光發(fā)射熒光：分子中電子從單重激發(fā)態(tài)的最低振動能級在很短時間（10-9-10-6s）躍遷到基態(tài)各振動能級時所產(chǎn)生的光子輻射稱為熒光。熒光發(fā)射：產(chǎn)生熒光的過程S1→→S0第一電子激發(fā)態(tài)第二電子激發(fā)態(tài)三重態(tài)熒光S1基態(tài)S0T1T2S2第一電子激發(fā)態(tài)第二電子激發(fā)態(tài)三重態(tài)磷光S2S1基態(tài)S0T1T2S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間竄躍內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫分子內(nèi)的光物理過程1.2激發(fā)光譜與熒光(磷光)光譜1.熒光(磷光)的激發(fā)光譜曲線

固定測量波長(選最大發(fā)射波長),化合物發(fā)射的熒光(磷光)強(qiáng)度與照射光波長的關(guān)系曲線（圖中曲線I）。激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大；2.熒光光譜(或磷光光譜)

固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長),化合物發(fā)射的熒光(或磷光強(qiáng)度)與發(fā)射光波長關(guān)系曲線(圖中曲線II或III)。3.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系a.Stokes位移激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長，振動弛豫消耗了能量。b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量(如能級圖2,1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長一定的熒光(如‘2)。c.鏡像規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關(guān)系。鏡像規(guī)則的解釋基態(tài)上的各振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動能級分布類似；基態(tài)上的零振動能級與第一激發(fā)態(tài)的二振動能級之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。

1熒光量子產(chǎn)率分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件：i）分子具有與輻射頻率相應(yīng)的熒光結(jié)構(gòu)（內(nèi)因）；ii）吸收特征頻率的光后，具一定光量子產(chǎn)率的熒光。即熒光量子產(chǎn)率（熒光效率或量子效率）足夠大.二、熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系∑ki:其它有關(guān)過程的速率常數(shù)熒光量子產(chǎn)率/熒光效率或量子效率：物理意義：表示物質(zhì)發(fā)射熒光的能力。影響因素：kf

由分子化學(xué)結(jié)構(gòu)決定（內(nèi)因）∑ki由化學(xué)環(huán)境和化學(xué)結(jié)構(gòu)決定kf:熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)3）剛性結(jié)構(gòu)：多數(shù)具有剛性平面結(jié)構(gòu)的有機(jī)分子具有強(qiáng)烈的熒光。原因：這種結(jié)構(gòu)可以減少分子的振動，使分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子的相互作用減少，也就減少了碰撞去活的可能性。

分子剛性（Rigidity）越強(qiáng)，分子振動少，與其它分子碰撞失活的機(jī)率下降，熒光量子效率提高。OHCOOCHOOHCOOCOHO熒光素（大）

酚酞（=0）

4）取代基效應(yīng)：①給電子取代基增強(qiáng)熒光原因：p-共軛，增強(qiáng)了電子共軛程度，使最低激發(fā)單重態(tài)與基態(tài)之間的躍遷幾率增大?！纠浚?OH、-OR、-NH2、-CN、-NR2等；②吸電子基降低熒光例：-COOH、-C=O、-NO2、-NO、-X、（-NH-N=N-）等；【例】：硝基苯為非熒光物質(zhì)，苯酚、苯胺熒光較苯強(qiáng)?；衔餆晒獾南鄬?qiáng)度化合物熒光的相對強(qiáng)度苯10氟代苯10甲苯17氯代苯7丙基苯17溴代苯5苯基氰20碘代苯0苯酚18酚離子10苯胺20苯甲酸3苯胺離子0硝基苯0表不同取代基對苯環(huán)熒光相對強(qiáng)度的影響

③重原子效應(yīng)將一個高原子序數(shù)的原子引入到發(fā)光分子的電子體系中，往往會增強(qiáng)磷光而減弱熒光。原因：原子序數(shù)較高的原子中，能級之間的交叉現(xiàn)象比較嚴(yán)重，電子自旋軌道間的相互作用變大，更有利于電子自旋的改變，增加了由單重態(tài)轉(zhuǎn)化為三重態(tài)的速率，發(fā)生自旋軌道的相互作用，增大了系間跨越的速度，而使熒光減弱，磷光增強(qiáng)。S1→T1的系間竄躍由于重原子的存在增強(qiáng)重原子降低熒光但增強(qiáng)磷光重原子效應(yīng)：將一個高原子序數(shù)的原子引入到發(fā)光分子的電子體系中，會增加磷光而減弱熒光現(xiàn)象?！纠浚悍降臒晒庑?.16

氯苯的熒光效率0.05

溴苯的熒光效率0.01磷光順序

熒光順序

④取代基的空間位置影響

分子結(jié)構(gòu)空間障礙的影響【例】：萘環(huán)上的8位引入磺酸基，使-NH2或-N(CH3)2基與萘之間的鍵發(fā)生扭轉(zhuǎn)而離開了平面構(gòu)型，影響了p-共軛，消弱了電子共軛程度，熒光減弱。N(CH3)2-O3SN(CH3)2O3S=0.03

=0.75

5）立體異構(gòu)現(xiàn)象的影響【例】：空間位阻對熒光發(fā)射的影響反式二苯乙烯強(qiáng)熒光物質(zhì)F=0.75F=0.03立體異構(gòu)體對熒光發(fā)射的影響順式二苯乙烯非熒光物質(zhì)非平面構(gòu)型平面構(gòu)型強(qiáng)熒光的有機(jī)化合物具備下特征:①具有大的共軛π鍵結(jié)構(gòu)；②具有剛性的平面結(jié)構(gòu)；③具有最低的單重電子激發(fā)態(tài)為S1為π

*

→π型；④取代基團(tuán)為給電子取代基。小結(jié)：三、溶液熒光的猝滅熒光物質(zhì)分與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象。猝滅劑：能引起熒光猝滅的物質(zhì)。例：鹵素離子、重金屬離子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物。1.碰撞猝滅相對速率1K1[M*]K2[M*][Q]與分子的直徑、粘度、溫度等因素有關(guān)。激發(fā)發(fā)射猝滅2.氧的猝滅作用氧分子是熒光、磷光的猝滅劑，沒有除氧，溶液中難以觀察到磷光3.自猝滅與自吸收當(dāng)熒光物質(zhì)的濃度大于1g/L時，常發(fā)生熒光的自猝滅(濃度猝滅)自吸收：由于F<1，使熒光強(qiáng)度減弱或消失.形成二聚體：由于二聚體不發(fā)熒光，或發(fā)射熒光的能量有改變，造成自猝滅現(xiàn)象。第二節(jié)、分子熒光定量分析

熒光強(qiáng)度

F正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率：

F=K’Ia

由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10-bc)F=K’I0(1-10-bc)=K’

I0(1-e-2.3bc)濃度很低時，將括號項近似處理后：F=2.3I0lc

=Kc一.熒光強(qiáng)度(磷光)與濃度的關(guān)系三.分子熒光(磷光)強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系1.熒光強(qiáng)度(磷光)與濃度的關(guān)系光吸收定律（Lambert–BeerLaw）相應(yīng)的吸光分?jǐn)?shù)為：熒光強(qiáng)度（IF）與相應(yīng)的吸光分?jǐn)?shù)成正比：按照級數(shù)展開式：對于稀溶液，當(dāng)bc<0.05（磷光bc<0.01）時：F----熒光強(qiáng)度I0--入射光強(qiáng)度。F----磷光強(qiáng)度b--吸收光程--摩爾吸光系數(shù)C--熒光物質(zhì)濃度熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成之正比.條件：極稀的溶液中，當(dāng)lc0.05時才成立。較濃溶液，由于猝滅現(xiàn)象和自吸收等原因，使熒光強(qiáng)度和濃度不呈線性關(guān)系。

標(biāo)準(zhǔn)曲線法：

配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度試樣測定熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再在相同條件下測量未知試樣的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出濃度；比較法：在線性范圍內(nèi)，測定標(biāo)樣和試樣的熒光強(qiáng)度，比較；熒光猝滅法多組分混合物的熒光分析二.熒光分析定量方法第三節(jié)熒光光譜儀測量熒光的儀器主要由四個部分組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測器。特殊點(diǎn)：有兩個單色器，光源與檢測器通常成直角?；玖鞒倘鐖D：單色器：選擇激發(fā)光波長的第一單色器和選擇發(fā)射光(測量)波長的第二單色器；光源：氙燈和高壓汞燈，染料激光器(可見與紫外區(qū))樣品池：石英檢測器：光電倍增管。第四節(jié)熒光光譜法的特點(diǎn)及干擾因素一、熒光分析的特點(diǎn)（1）靈敏度高比紫外-可見分光光度法高2～4個數(shù)量級；為什么？檢測下限：0.1～0.1g/cm-3相對靈敏度：0.05mol/L奎寧硫酸氫鹽的硫酸溶液。（2）選擇性強(qiáng)既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征吸收光譜；（3）試樣量少缺點(diǎn)：應(yīng)用范圍小。二、熒光分析的干擾因素（1）溫度（2）溶劑效應(yīng)（3）pH值（4）內(nèi)濾光和自吸（5）散射光的影響（6）熒光污染（1）溫度：溫度增加，熒光強(qiáng)度下降。

原因：因?yàn)殡S著溫度的升高，增加分子間碰撞的幾率，促進(jìn)分子內(nèi)能的轉(zhuǎn)化和系間竄躍、粘度或“剛性”降低。為提高靈敏度，熒光計的液槽上配有低溫裝置；熒光測定時需使試樣保持恒溫。【例】：熒光素鈉的乙醇溶液-80℃，熒光效率100％.溫度每增加10℃，熒光效率約減少3％。

溫度F色氨酸酪氨酸吲哚乙酸奎寧輻射躍遷的速率基本不隨溫度而改變，而非輻射躍遷的速率隨溫度升高而顯著增大。因此，升高溫度會使非輻射躍遷概率增大，熒光效率降低。（2）溶劑效應(yīng)：同一種熒光物質(zhì)在不同的溶劑中，其熒光光譜的形狀和強(qiáng)度有顯著不同?！镆话闳軇┬?yīng)：指的是溶劑的折射率和介電常數(shù)等的影響.波長隨溶劑電常數(shù)的增大，熒光峰的波長越大，熒光效率增大。溶劑相對介電常數(shù)熒光峰/nm熒光效率乙腈38.84100.064丙酮21.54050.055氯仿5.23980.041四氯化碳2.243900.002表8-羥基喹啉在不同溶劑中的熒光峰和熒光效率★特殊溶劑效應(yīng)：熒光體和溶劑分子間的特殊化學(xué)作用，如氫鍵、靜電作用、電荷轉(zhuǎn)移等作用，從而改變熒光物質(zhì)結(jié)構(gòu)來增加或降低熒光強(qiáng)度。增大溶劑的極性，將使n躍遷的能量增大，

躍遷的能量減小，而導(dǎo)致熒光增強(qiáng)，熒光峰紅移。特殊溶劑效應(yīng)>一般溶劑效應(yīng)。注意：溶劑效應(yīng)也有與上述現(xiàn)象相反的情況。溶劑的極性增強(qiáng)對激發(fā)態(tài)會產(chǎn)生更大的穩(wěn)定作用，電子激態(tài)比基態(tài)具有更大的極性，結(jié)果使熒光波長紅移，熒光強(qiáng)度增大（3）溶液的pH值：對有機(jī)熒光物質(zhì)：具酸或堿性基團(tuán)的有機(jī)物質(zhì)，在不同pH值時，其結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，因而熒光強(qiáng)度將發(fā)生改變；【例】:大多數(shù)芳香族化合物具有酸或堿功能團(tuán)，對pH的變化敏感?！纠浚罕桨罚喝醯挠袡C(jī)堿在堿性溶液pH7～12中以分子形式存在，藍(lán)色強(qiáng)熒光在酸性pH<2或>13以離子形式存在，熒光弱。對無機(jī)熒光物質(zhì)：pH值會影響其穩(wěn)定性。NH2NH3+pH≈1有熒光pH≈13無熒光【例】：(4)內(nèi)濾光和自吸：內(nèi)濾光：當(dāng)猝滅劑吸收光譜與熒光體的熒光光譜有重疊時，處于激發(fā)單重態(tài)的熒光體激發(fā)分子的能量就可能轉(zhuǎn)移到猝滅劑分子上或者猝滅劑吸收了熒光體發(fā)射的熒光，使熒光猝滅，而猝滅劑被激發(fā)，這是俗稱“內(nèi)濾作用”。

【例】：在1μg·mL-1的色氨酸溶液中，如有K2Cr2O7存在，由于在色氨酸的激發(fā)和發(fā)射峰附近是重鉻酸鉀的兩個吸收峰，吸收了色氨酸的激發(fā)能和色氨酸發(fā)射的熒光，使測得的色氨酸熒光降低熒光自吸：當(dāng)熒光物質(zhì)濃度較大時，可吸收自身的熒光發(fā)射熒光物質(zhì)的熒光發(fā)射光譜的短波長一端與該物質(zhì)的吸收光譜的長波長一端有重疊，在濃度較大時，一部分熒光發(fā)射被自身吸收，引起熒光強(qiáng)度降低。(5)散射光的影響散射：當(dāng)一束平行光投射在液體樣品時，大部分光線透過溶液，小部分光由于光子與物質(zhì)分子相碰撞，使光子的運(yùn)動方向發(fā)生改變而向不同角度散射。瑞利散射光容器表面的散射光丁達(dá)爾散射拉曼散射光選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光，使熒光避開拉曼光40050060070080604020450360320640720波長（nm）F奎寧硫酸鹽的熒光光譜中的各種類型散射0.04μg奎寧/mL、0.1N硫酸、激發(fā)320nm丁達(dá)爾瑞利散射水的拉曼光奎寧硫酸鹽熒光峰二級瑞利散射和丁達(dá)爾散射二級拉曼光消除方法：減少狹縫寬度截止濾光法選用適當(dāng)波長的激發(fā)光選用高分辨率的儀器對純?nèi)軇┑睦暹M(jìn)行測定，然后在熒光光譜中進(jìn)行校正或差示光譜。蒽（5×10-9mol/L）在不同樣品池中的熒光光譜普通池?zé)o熒光池（6）熒光污染（1）無機(jī)化合物的熒光分析直接熒光測定，以鈾和稀土元素為主；無機(jī)化合物與某種試劑反應(yīng)，利用熒光呈現(xiàn)或淬滅來測定。常用的有機(jī)熒光試劑：8-羥基喹啉、安息香、黃酮醇與有機(jī)試劑配合物后測量；可測量約60多種元素。鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法；氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測定；銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過氧化氫采用催化熒光法測定；鉻、鈮、鈾、碲采用低溫?zé)晒夥y定；鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測定第五節(jié)熒光光譜法在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用（2）有機(jī)化合物的熒光分析有機(jī)化合物：多環(huán)胺類、萘酚類、吲哚類、多環(huán)芳烴、氨基酸、蛋白質(zhì)等。藥物：嗎啡、喹啉類、異喹啉類、麥角堿、麻黃堿、可卡因、鴉片堿、巴比妥類、阿托品、異煙肼、利血平、色胺、阿司匹林、青霉素、四環(huán)素等藥物的分析（3）農(nóng)副產(chǎn)品蛋白質(zhì)、維生素、有害殘留物等食品:食品添加劑、維生素含量、甾體、抗生素、酶和輔酶等的分析例：維生素A、B1、B2、B6、B12、E、C、葉酸等。（a）萘f=0.29；em=310nm（b）蒽f=0.46；em=400nm多環(huán)芳烴是重要的環(huán)境污染物，可用熒光法測定。ex=386nm,em=430nm3，4-苯并芘強(qiáng)致癌物（4）基因研究及檢測

遺傳物質(zhì)的脫氧核糖酸(DNA)，自身的熒光效率很低，一般條件下幾乎檢測不到DNA的熒光。因此，常選用某些熒光分子作為探針，通過探針標(biāo)記分子的熒光變化來研究DNA與小分子及藥物的作用機(jī)理，從而探討致病原因及篩選和設(shè)計新的高效低毒藥物。典型的熒光探針分子為溴化乙錠(EB)，也使用釘?shù)呐浜衔锏??？纱嫱凰貥?biāo)記，從而克服了同位素標(biāo)記物產(chǎn)生的污染、價格昂貴及難保存等的不足。應(yīng)用實(shí)例：食品中硒的測定（GB/T12399-1996）3）激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系i）波長比較:

λ激發(fā)<λ發(fā)射Stokes位移：在溶液中，分子熒光的發(fā)射相對于吸收位移到較長的波長。原因:ΔE激發(fā)≠ΔE發(fā)射①受激分子通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動弛豫而失去轉(zhuǎn)動能，②溶液中溶劑分子與受激分子的碰撞，也會有能量的損失。ii）形狀比較：熒光光譜形狀與激發(fā)波長無關(guān)。不論用哪一個波長的光輻射激發(fā)，電子都從第一激發(fā)態(tài)的最低振動能級降至基態(tài)的各個不同振動能級。熒光光譜只含一個發(fā)射帶.熒光S2S1S0l1l2l3蒽的乙醇溶液的2個吸收帶蒽的乙醇