植物細(xì)胞培養(yǎng)的基本過(guò)程和方法課件

第十章

植物細(xì)胞培養(yǎng)的基本過(guò)程和方法第一節(jié)植物細(xì)胞的獲取細(xì)胞來(lái)源：1、外植體；2、愈傷組織1、外植體的選擇：適當(dāng)生長(zhǎng)期的健康植株、細(xì)胞之間粘連程度?。蝗~片組織2、外植體的前處理：（1）沖刷材料;流水幾分鐘-數(shù)小時(shí)吐溫(2)表面浸潤(rùn)滅菌；超凈臺(tái)70%酒精10-30S（3）深層滅菌；氯化汞次氯酸鈉（4）無(wú)菌水沖洗。3min/次3-10次一、從外植體直接分離植物細(xì)胞怎樣從愈傷組織分離得到細(xì)胞？P175獲得愈傷組織后，挑選質(zhì)量好的愈傷組織塊，用無(wú)菌的鑷子或小刀分割得到植物小細(xì)胞團(tuán)，也可以將愈傷組織轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中，加入經(jīng)過(guò)滅菌處理的玻璃珠，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，使愈傷組織分散成為小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞，然后用適當(dāng)孔徑的不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾，除去大細(xì)胞團(tuán)和殘?jiān)?，得到一定體積的小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞懸浮液。

果膠酶增強(qiáng)分散效果第二節(jié)懸浮培養(yǎng)（cellsuspensionculture）懸浮培養(yǎng)是細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法，是將單個(gè)游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。

1、懸浮細(xì)胞的誘導(dǎo)---愈傷組織誘導(dǎo)

要求：松散性好，增殖快，再生能力強(qiáng)。其外觀一般是鮮艷的乳白或淡黃色，呈細(xì)小顆粒狀，松散易碎。

適于懸浮培養(yǎng)適于再生植株懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)：基本的懸浮培養(yǎng)體系均是將細(xì)胞分散在一定容積的培養(yǎng)液中進(jìn)行，在一個(gè)培養(yǎng)周期不添加培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)體系基本是處于封閉狀態(tài)。當(dāng)一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡時(shí)，細(xì)胞即停止生長(zhǎng)。在這種懸浮培養(yǎng)體系中，細(xì)胞擴(kuò)增生長(zhǎng)成S形曲線(xiàn)。細(xì)胞生長(zhǎng)指標(biāo)1、細(xì)胞生長(zhǎng)計(jì)量:細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞密實(shí)體積細(xì)胞鮮重細(xì)胞干重2、細(xì)胞活力測(cè)定懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的同步化細(xì)胞同步化：同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細(xì)胞都同時(shí)通過(guò)細(xì)胞周期的某一特定時(shí)期。

植物細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)中的游離性較差，容易團(tuán)聚進(jìn)入不同程度的分化狀態(tài)，因此要達(dá)到完全同步化相當(dāng)困難。③抑制法：通過(guò)一些DNA合成抑制劑處理細(xì)胞，使細(xì)胞滯留在DNA合成前期，當(dāng)解除抑制后，即可獲得處于同一細(xì)胞周期—G1期的同步化細(xì)胞。④低溫法：冷處理也可提高培養(yǎng)體系中細(xì)胞同步化程度。第三節(jié)固定化培養(yǎng)細(xì)胞固定化是將細(xì)胞包埋在惰性支持物的內(nèi)部或貼附在它的表面。其前提就是通過(guò)懸浮培養(yǎng)獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞。方法：吸附法、包埋法包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物多采用瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽、聚丙烯酰胺等；吸附式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物采用尼龍網(wǎng)、聚氨酯泡沫、中空纖維等材料。1、平板培養(yǎng)2、看護(hù)培養(yǎng)3、微室培養(yǎng)4、條件培養(yǎng)（雙層濾紙培養(yǎng)）1、細(xì)胞平板培養(yǎng)

平板培養(yǎng)(plateculture)：將一定密度的懸浮細(xì)胞接種到一薄層固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)。

單細(xì)胞的分離：用于平板培養(yǎng)的小細(xì)胞團(tuán)不能超過(guò)6個(gè)細(xì)胞，所以過(guò)濾時(shí)篩網(wǎng)的網(wǎng)孔大小要合適。

單細(xì)胞懸浮液的制備：分離的單細(xì)胞經(jīng)低速離心，培養(yǎng)液洗滌2次后，調(diào)整密度為5×105／ml。

植板：將1份已調(diào)整好密度的單細(xì)胞懸浮液與4份35℃的固體培養(yǎng)基充分混合均勻，然后均勻地平鋪于培養(yǎng)皿中，厚度約1~2mm。

封口：用石蠟?zāi)し馀囵B(yǎng)皿。2、看護(hù)培養(yǎng)看護(hù)培養(yǎng)（nurseculture）：是由Muir1954年設(shè)計(jì)的。

操作方法：

在固體培養(yǎng)基上置入一塊活躍生長(zhǎng)的愈組織，再在愈傷組織上放一小片濾紙，待濾紙濕潤(rùn)后將細(xì)胞接種于濾紙上。當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞長(zhǎng)出微小細(xì)胞團(tuán)以后，將其直接轉(zhuǎn)至瓊脂培養(yǎng)基上讓其迅速生長(zhǎng)4、雙層濾紙培養(yǎng)Horsch等（1980）將平板培養(yǎng)與飼養(yǎng)層培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，建立了雙層濾紙植板培養(yǎng)方法。第五節(jié)原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體的特點(diǎn):①具有全能性；②無(wú)細(xì)胞壁障礙；③吸收能力強(qiáng)、分泌能力提高；④可進(jìn)行細(xì)胞融合。原生質(zhì)體的制備

基礎(chǔ)材料準(zhǔn)備預(yù)處理與酶解（或機(jī)械破壁）原生質(zhì)體收集與純