轉(zhuǎn)錄組實(shí)戰(zhàn)講解之表達(dá)定量和差異與功能分析

轉(zhuǎn)錄組實(shí)戰(zhàn)講解之表達(dá)定量和差異與功能分析第一頁，共29頁。步驟四：表達(dá)值的定量定量策略&工具步驟五：差異分析差異分析工具步驟六：功能注釋附錄：運(yùn)行命令第二頁，共29頁。轉(zhuǎn)錄組分析的通用套路定量鑒定差異功能有多少RNARNA的表達(dá)量結(jié)構(gòu)、表達(dá)量、比例的變化功能注釋3第三頁，共29頁。測(cè)序數(shù)據(jù)和參考基因組比對(duì)測(cè)序評(píng)估及低質(zhì)量過濾編碼基因表達(dá)注釋轉(zhuǎn)錄本重構(gòu)長(zhǎng)非編碼鑒定長(zhǎng)非編碼表達(dá)注釋編碼基因差異(特異)表達(dá)GO功能顯著性富集Pathway顯著性富集功能富集網(wǎng)絡(luò)圖長(zhǎng)非編碼差異表達(dá)GO功能顯著性富集Pathway顯著性富集功能富集網(wǎng)絡(luò)圖FusionsJunctionsGenomeBrowser可視化轉(zhuǎn)錄組第五講測(cè)序中國(guó)-測(cè)序?qū)W堂轉(zhuǎn)錄組第三講轉(zhuǎn)錄組第四講轉(zhuǎn)錄組第六講第四頁，共29頁。步驟三：轉(zhuǎn)錄本的構(gòu)建（Cufflinks/Scripture）構(gòu)建流程詳解基因存儲(chǔ)文件:Gtf,Bed格式文件Cuffmerge/cuffcompare合并轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄本構(gòu)建效果評(píng)估多外顯子比率、已知覆蓋程度步驟四：長(zhǎng)非編碼RNA的鑒定鑒定流程詳解關(guān)鍵:如何判斷編碼或是非編碼基因工具：CNCI，CPC,PhyloCSF上期回顧第五頁，共29頁。一個(gè)測(cè)序?qū)嵗樱和砥诟伟┎∪说母谓M織(共4個(gè))癌旁組織(N)原發(fā)灶(P)轉(zhuǎn)移灶(M)門脈血栓轉(zhuǎn)移灶(V)一組時(shí)間序列上的4個(gè)點(diǎn)的取樣6第六頁，共29頁。步驟四：表達(dá)值的定量定量策略&工具步驟五：差異分析差異分析工具步驟六：功能注釋附錄：運(yùn)行命令第七頁，共29頁。轉(zhuǎn)錄組分析的通用套路定量鑒定差異功能有多少RNARNA的表達(dá)量結(jié)構(gòu)、表達(dá)量、比例的變化功能注釋鑒定完成后的分析步驟8第八頁，共29頁。定量策略FPKMexpectednumberoffragmentsperkilobaseoftranscriptsequencepermillionsbasepairssequencedTPMtranscriptpermillionRPKMreadsperkilobasepermillionmappedreads9第九頁，共29頁。定量工具：Cufflinks(FPKM)Cuffdiff(FPKM)推薦RSEM(TPM)推薦Range(RPKM)10第十頁，共29頁。FPKM定量計(jì)算工具：cufflinks輸出結(jié)果transcripts.gtfisoforms.fpkm_trackinggenes.fpkm_tracking轉(zhuǎn)錄本定量？基因定量？定量：cufflinks-Gref.gtf–ooutdirtophat_outdir_N/accept_hits.bam第十一頁，共29頁。長(zhǎng)編碼RNA表達(dá)定量藍(lán)線：長(zhǎng)非編碼基因黑線：非編碼基因NPMV第十二頁，共29頁。步驟四：表達(dá)值的定量定量策略&工具步驟五：差異分析差異分析工具步驟六：功能注釋附錄：運(yùn)行命令第十三頁，共29頁。差異分析差異分析工具：DeseqHypothesistestingH0:nodifferencebetweentowconditions.NegativeBinomialforreadscountCuffdiffTestA.FPKM-B.FPKMwithnormaldistributionSAMseqNonparametricmethodsMann-WhitneystatisticNeedmanysamples/replicatesinconditionsEBseqEmpiricalBayesianmode(forTPM)14第十四頁，共29頁。Cuffdiff輸出結(jié)果isoforms_exp.diffgenes_exp.diffsplicing.difftherelativecontributionofdifferentisoformsissignificantlydifferent

tissue1is80/20fortwoisoformsandtissue2is50/50tss.diff第十五頁，共29頁。表達(dá)差異分析結(jié)果P/N∪M/N∪V/N=342codinggenesP/N∪M/N∪V/N=312lincRNAgenes第十六頁，共29頁。動(dòng)態(tài)變化分析(特異性分析)JSscorerangingfrom0to1;Jensen-Shannon(JS)ScoreAperfecttissue-specificpatternwillbescoredasJS=117第十七頁，共29頁。動(dòng)態(tài)變化分析(特異性)18第十八頁，共29頁。步驟四：表達(dá)值的定量定量策略&工具步驟五：差異分析差異分析工具步驟六：功能注釋附錄：運(yùn)行命令第十九頁，共29頁。功能注釋工具：DavidGo(Forcodinggenes)./ncFANs(forlincRNAs)ncfansv2/20第二十頁，共29頁。DavidGO:數(shù)據(jù)上傳第二十一頁，共29頁。DavidGO:注釋數(shù)據(jù)庫選擇GOTERM_BP_FATKEGG_PATHWAY第二十二頁，共29頁。DavidGO:FunctionalAnnotationClustering第二十三頁，共29頁。DavidGO:FunctionalAnnotationChart第二十四頁，共29頁。功能注釋25第二十五頁，共29頁。步驟四：表達(dá)值的定量定量策略&工具步驟五：差異分析差異分析工具步驟六：功能注釋附錄：運(yùn)行命令第二十六頁，共29頁。運(yùn)行命令匯總

差異分析&定量：cuffdiff-ocuffdif