目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建精美生物醫(yī)學(xué)

目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建精美生物醫(yī)學(xué)第1頁/共39頁基因文庫第2頁/共39頁請你找找看……什么是基因文庫，由哪兩部分組成呢？構(gòu)建基因文庫由什么用呢？構(gòu)建一個基因文庫都有哪些基本步驟，請概括！第3頁/共39頁一．基因文庫概述

1、概念基因文庫(library)：一套包含某生物體所有基因的DNA序列。這些序列分別與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合在一起。第4頁/共39頁2、基本組成包括：基因組文庫、cDNA文庫cDNA：由mRNA逆轉(zhuǎn)錄的DNA，因此不含非轉(zhuǎn)錄的基因組序列。單鏈cDNA可由DNA聚合酶轉(zhuǎn)變成雙鏈，應(yīng)用于基因工程。

第5頁/共39頁基因組文庫GenomicDNAlibrary使用與切割載體相同的限制酶，將供體生物的基因組DNA切割成許多片段將所有片段連接到載體上，構(gòu)成一個重組DNA群體這個群體包含全基因組的遺傳信息第6頁/共39頁cDNA文庫（cDNAlibrary）

以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)DNA(complementaryDNA，cDNA)將雙鏈cDNA與適當(dāng)載體連接轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，建成cDNA文庫第7頁/共39頁基因組文庫與cDNA文庫的比較：基因組文庫包含基因組的所有基因cDNA文庫只包括某一特定細(xì)胞類型、某一組織、或某一發(fā)育時期的表達(dá)序列分離特定基因，cDNA庫比較方便研究調(diào)控序列，必須用到基因組文庫第8頁/共39頁3、構(gòu)建目的創(chuàng)建基因文庫的目的：從特定的材料中分離目的DNA片段或基因。把所有的基因集中在一個庫中，采用一定的方法在庫中篩選目的基因。同時也便于基因的長期保存。第9頁/共39頁4、基因文庫的構(gòu)建流程（1）基因組文庫的構(gòu)建提取某生物全部DNA用適當(dāng)限制酶切割許多DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌群該生物基因組文庫（每個受體菌含有一段不同的DNA片段）（2）cDNA文庫的構(gòu)建——mRNA反轉(zhuǎn)錄形成mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶雜交雙鏈核酸酶H單鏈DNADNA聚合酶雙鏈DNA與載體連接導(dǎo)入受體菌群該生物cDNA文庫第10頁/共39頁5、基因文庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)盡可能高的完備性重組克隆的總數(shù)不宜過大以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長度避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選第11頁/共39頁二、目的基因的克隆第12頁/共39頁用限制酶切斷成許多片段1、直接分離法—“鳥槍法”載入運載體導(dǎo)入不同的受體細(xì)胞大量復(fù)制和表達(dá)找出含有目的基因的細(xì)胞限制酶將DNA切成許多片段第13頁/共39頁鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景知識不能獲得的最小長度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)第14頁/共39頁2、人工合成基因法：1）逆轉(zhuǎn)錄法：mRNA雙鏈DNA(即目的基因)逆轉(zhuǎn)錄酶單鏈DNA合成2）直接合成法：蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測推測目的基因（雙鏈）化學(xué)合成第15頁/共39頁3、通過DNA合成儀直接合成目的基因DNA合成儀蛋白質(zhì)的氨基酸順序mRAN核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因推測推測合成

當(dāng)基因比較小、蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以測得或核苷酸序列已知時，可采用此種方法。第16頁/共39頁4、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段第17頁/共39頁5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物ⅡG—G1.目的基因受熱變性，解旋；2.引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合；3.合成鏈在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸。5/3/A—G引物Ⅰ第18頁/共39頁(2)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增②原理：__________DNA復(fù)制③條件：_______________________、

_______________、______________、

__________(做啟動子)。已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對引物DNA聚合酶、解旋酶④方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)2n⑤結(jié)果：使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴(kuò)增第19頁/共39頁⑥過程：a、DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復(fù)性25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈第20頁/共39頁三、基因文庫的構(gòu)建（一）切割：基因組DNA的分解用于基因組文庫構(gòu)建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法。超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭部分酶切法一般選用四對堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶，如：Sau3AI或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進(jìn)行分級分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機(jī)連為一體！第21頁/共39頁載體和受體的選擇出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的l-DNA或考斯質(zhì)粒；對于大型基因組（如動植物和人類）需使用YAC載體由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文庫構(gòu)建的載體通常選質(zhì)粒第22頁/共39頁

上述幾種載體的最大裝載量如下：質(zhì)粒l-DNA考斯質(zhì)粒15kb25kb45kbYAC400

kb第23頁/共39頁

用于基因文庫構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌第24頁/共39頁密集鋪板（1-10萬）雜交挖取鋪板鋪板目的重組克隆二、篩選：從基因文庫中篩選目的基因第25頁/共39頁從基因庫中篩選特定的克隆一個基因文庫中有幾萬個克隆，目的基因到底在哪個克隆上呢？根據(jù)待選基因相關(guān)信息確定篩選方法和條件。最常用的方法是利用DNA探針，用放射性同位素或非放射性同位素標(biāo)記探針，篩選基因文庫第26頁/共39頁DNA探針（probe）探針是一段能夠與待選目的基因互補(bǔ)的核酸序列DNA、cDNA、寡聚核苷酸單鏈、雙鏈同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記、顏色標(biāo)記第27頁/共39頁篩選文庫質(zhì)?；驇旌Y選細(xì)菌混合液在培養(yǎng)在平板上轉(zhuǎn)移到尼龍膜上裂解細(xì)菌變性DNA標(biāo)記探針雜交漂洗放射自顯影或熒光檢測挑取對應(yīng)菌落、培養(yǎng)抽提質(zhì)粒第28頁/共39頁陽性克隆的分析與鑒定

從基因庫中篩選出的陽性克隆，還需進(jìn)一步分析、鑒定，才能最后得到目的基因測序自動測序儀功能分析預(yù)測軟件第29頁/共39頁磷酸二脂鍵第30頁/共39頁測序電泳圖譜第31頁/共39頁基因測序及分析第32頁/共39頁序列測定的技術(shù)

雜交測序法質(zhì)譜法單分子測序法原子探針顯微鏡測序法DNA芯片法經(jīng)典方法:Sanger雙脫氧鏈終止法(Sanger,1977)Maxam-GilbertDNA化學(xué)降解法(Maxam&Gilbert,1977)新技術(shù)方法:第33頁/共39頁與PCR反應(yīng)類似。反應(yīng)體系中包含：模板DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs和測序引物；反應(yīng)過程：變性－復(fù)性－延伸－終止Sanger雙脫氧終止法第34頁/共39頁Dideoxynucleotides

（雙脫氧核苷酸）ddNTPs是反應(yīng)終止劑可以當(dāng)作正常堿基參與復(fù)制，一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接。反應(yīng)體系中dNTPs的濃度遠(yuǎn)高于ddNTPs(一般1：3~4)。第35頁/共39頁*少一個－OH脫氧核甘酸與雙脫氧核甘酸結(jié)構(gòu)比較第36頁/共39頁Sanger第一步：加入復(fù)制終止劑