真菌學概述課程

真菌學概述課程第1頁/共61頁CandidaAspergillusHiBud!Hipal!Opportunityknocks!Huh.Youguysgetalltheattention

FusariumFromDonnellyJPThemainplayers第2頁/共61頁真菌(fungus)是一種真核細胞型微生物，一類具有典型細胞核，有核膜和核仁，胞質(zhì)內(nèi)有完整的細胞器，無根、莖、葉，不含葉綠素，無光合色素，細胞壁含幾丁質(zhì)和纖維素的單細胞或多細胞異養(yǎng)真核細胞型微生物。真菌廣泛分布于自然界，種類繁多，有10余萬種。大多對人無害，有的甚至有益，如食用蕈類，有的真菌用于生產(chǎn)抗生素和釀酒等。然而有些真菌也是造成動植物病害的病原菌之一，其中與醫(yī)學有關的真大約有數(shù)百種，少數(shù)真菌可以引起人類感染性、中毒性及變態(tài)反應性疾病（如曲霉菌屬、毛癬菌屬）。近年來，由于抗菌藥物的廣泛應用和或應用激素、抗癌藥物導致機體免疫低下等原因，而使機會致病真菌感染明顯增多（如曲霉菌、組織胞漿菌、卡氏肺胞菌、馬爾尼菲青霉菌）。

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真菌細菌細胞真核細胞原核細胞細胞核有，還有核仁、核膜擬核，無核仁、核膜細胞器有只有核糖體細胞壁無肽聚糖，由多糖（75%）與蛋白質(zhì)（25%）有肽聚糖對青霉素或頭孢菌素敏感不敏感敏感細胞膜含固醇不含固醇大小，復雜程度比細菌大幾倍至幾十倍，結構復雜小，簡單第5頁/共61頁第6頁/共61頁第一節(jié)分類真菌屬真菌界，真菌屬真核細胞型微生物。真菌的營養(yǎng)方式是吸收，植物的營養(yǎng)方式是光合作用。真菌分類的主要依據(jù)為：有性生殖的各種器官、無性菌絲、孢子及菌落的形態(tài)特征。第7頁/共61頁真菌分類粘菌門鞭毛菌亞門真菌界接合菌亞門*真菌門子囊菌亞門*擔子菌亞門*半知菌亞門*根據(jù)卡氏肺囊蟲囊蟲壁的超微結構類似真菌細胞，將其稱為卡氏肺胞菌接合菌門子囊菌門擔子菌門壺菌門第8頁/共61頁真菌分類接合菌亞門分為2綱7目24科115屬，600余種。屬條件致病菌，絕大多數(shù)為無隔、多核菌絲體，如毛霉菌、根霉菌等。子囊菌亞門：

6綱1959屬，15000余種。主要特征:有性生殖產(chǎn)生子囊和子囊孢子包括：青霉、曲霉、小孢子菌屬、毛癬菌屬、組織胞漿菌等有性期、毛癬菌屬、酵母菌屬等。第9頁/共61頁真菌分類擔子菌亞門具有擔子和擔孢子，如食用菌蘑菇、靈芝以及致病性真菌新生隱球菌。半知菌亞門

3綱1825個屬，約15000種。包括：酵母、隱球菌屬、念珠菌屬、紅酵母屬、絲孢酵母屬、皮膚癬菌、青霉、曲霉及部分雙相真菌等。第10頁/共61頁第二節(jié)真菌的基本特性單細胞真菌圓形或卵圓形酵母菌(yeast)多細胞真菌菌絲和孢子絲狀菌(filamentousfungus)

交織成團或霉菌(mold)

二相性(dimorphic)一、形態(tài)與結構第11頁/共61頁單細胞真菌形態(tài)呈圓形或卵圓形，常見于酵母菌或類酵母菌，對人致病的主要有新生隱球菌和白假絲酵母菌。這類真菌以出芽方式繁殖，芽生孢子成熟后脫落成獨立個體。

第12頁/共61頁多細胞真菌形態(tài)多細胞絲狀真菌能長出菌絲，菌絲延伸分枝，有的菌絲上長出孢子。各種絲狀菌長出的菌絲和孢子形態(tài)不同，是鑒別真菌的重要標志。第13頁/共61頁第14頁/共61頁1.菌絲hypha有隔菌絲多數(shù)致病性真菌無隔菌絲在環(huán)境適宜情況下由孢子長出芽管，逐漸延長呈絲狀，稱菌絲菌絲形態(tài)(螺旋狀、球拍狀、結節(jié)狀、鹿角狀、梳狀等)有助于鑒別營養(yǎng)菌絲氣生菌絲生殖菌絲按生物學功能第15頁/共61頁有性孢子:同一菌體或不同菌體上的2個細胞融合經(jīng)減數(shù)分裂形成無性孢子:菌絲上的細胞分化或出芽生成

病原性真菌大多形成無性孢子

分生孢子葉狀孢子孢子囊孢子大分生孢子大小、細胞數(shù)和顏色是鑒定的重要依據(jù)小分生孢子真菌都能產(chǎn)生芽生孢子假菌絲

厚膜孢子關節(jié)孢子第16頁/共61頁多細胞真菌形態(tài)sporehypha第17頁/共61頁大分生孢子第18頁/共61頁芽生孢子第19頁/共61頁

假菌絲第20頁/共61頁厚膜孢子第21頁/共61頁關節(jié)孢子第22頁/共61頁孢子囊孢子第23頁/共61頁真菌孢子和細菌芽胞的區(qū)別

真菌繁殖結構真菌孢子細菌芽胞抵抗力不強，加熱60-70℃短時間即可死亡強，有的可耐100℃數(shù)小時數(shù)目一條菌絲可產(chǎn)生多個孢子一個菌體只形成一個芽胞作用為繁殖方式之一不是繁殖方式形狀形狀多種多樣圓形或橢圓形第24頁/共61頁二、真菌的培養(yǎng)特性特點：低營養(yǎng)、低PH(4.0-6.0)、高濕度和氧、溫度（淺部感染真菌22-28℃，深部感染真菌37℃）。培養(yǎng)基：沙保(Sabouraud)培養(yǎng)基（常加氯霉素和放線菌酮）菌落：單細胞--酵母型菌落、類酵母型菌落（假菌絲）多細胞--絲狀菌落

菌落形態(tài)也是鑒別真菌的重要依據(jù)

第25頁/共61頁酵母型菌落

是單細胞真菌的菌落形式，菌落光滑濕潤，柔軟而致密。形態(tài)與一般細菌菌落相似，如隱球菌即屬之。有部分單細胞真菌在出芽繁殖后，芽管延長不與母細胞脫離，形成假菌絲。假菌絲由菌落向下生長，伸入培養(yǎng)基中，這種菌落稱為類酵母菌落，如假絲酵母菌。

第26頁/共61頁C.albicans菌落(類酵母型)真菌在出芽繁殖后，芽管延長不與母細胞脫離，形成假菌絲。假菌絲由菌落向下生長，伸入培養(yǎng)基中，這種菌落稱為類酵母菌落。

第27頁/共61頁2.霉菌型菌落（絲狀菌落）是多細胞真菌的菌落形式，由許多管狀分支的菌絲體構成。菌落成棉絮狀、絨毛狀或粉末狀，菌落正背兩面呈現(xiàn)不同的顏色。菌落的形態(tài)、結構和顏色常作為鑒定真菌的參考。真菌有從中心向四周等距離生長形成圓形菌落的傾向，所以臨床體癬、股癬、疊瓦癬等皮損表現(xiàn)為環(huán)形或多環(huán)形。第28頁/共61頁第29頁/共61頁曲霉屬霉菌型菌落第30頁/共61頁青霉菌落霉菌型菌落第31頁/共61頁雙相真菌凡在組織內(nèi)和在特殊培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)時呈酵母相，而在普通培養(yǎng)基上和室溫培養(yǎng)時呈菌絲相的一類真菌，統(tǒng)稱為雙相真菌（dimorphicfungi）。酵母相也稱為組織相，是主要的致病相。臨床上重要的傳統(tǒng)雙相真菌包括：孢子絲菌、粗球孢子菌、組織胞漿菌、皮炎芽生菌、副球孢子菌等。近年發(fā)現(xiàn)的馬爾尼菲青霉等。近年來，有學者將雙相真菌的概念擴大，認為凡是具有兩種表型的真菌均稱為雙相真菌。如白念珠菌，在YPD培養(yǎng)基上，表現(xiàn)為酵母相；而在Lee培養(yǎng)基上則呈菌絲相。第32頁/共61頁雙相真菌特征菌絲相和酵母相能相互轉(zhuǎn)化，這種轉(zhuǎn)化與培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基成分、二氧化碳和氧的濃度變化有關。雙相真菌既能引起皮膚感染又能引起內(nèi)臟器官的感染。鑒定雙相真菌的鑒定主要依賴于轉(zhuǎn)化試驗。第33頁/共61頁真菌的繁殖方式有性繁殖無性繁殖出芽繁殖：為酵母菌的主要繁殖方式。分裂繁殖：以二分裂法進行繁殖，可見于某些雙相真菌在體內(nèi)的繁殖。芽管繁殖：真菌孢子萌發(fā)芽管，芽管延長后形成菌絲。生隔繁殖：分生孢子在分生孢子梗某一段落形成一橫隔，原生質(zhì)濃縮后形成一個新的孢子，該孢子又可再獨立進行繁殖。第34頁/共61頁致病性病原性真菌感染：主要為外源性真菌感染。條件致病性真菌感染：主要為內(nèi)源性真菌感染。真菌變態(tài)反應性疾病真菌性中毒真菌與腫瘤第35頁/共61頁抵抗力對干燥、日光、紫外線及一般消毒劑抵抗力強對熱敏感，60℃1小時菌絲、孢子均被殺死對細菌抗生素不敏感對二性霉素B、制霉菌素、咪康唑、酮康唑、氟康唑和伊曲康唑敏感第36頁/共61頁

臨床標本的采集及檢驗程序

淺部感染真菌的檢查可用70%乙醇棉球擦拭局部后取皮屑、毛發(fā)、指（趾）甲屑等標本。深部感染真菌的檢查可根據(jù)病情取痰、血液、腦脊液等標本。標本類型：皮膚的角質(zhì)性物質(zhì)：皮屑、毛發(fā)、指（趾）甲屑等。分泌物和排泄物：痰、生殖道分泌物、尿液等。血液和體液：血液、腦脊液、胸水、腹水、淋巴穿刺液、膿液及滲出液等。注意事項：若為淺部真菌感染，應刮片取病變部位邊緣的痂鱗屑。余同細菌感染標本采集事項。

第37頁/共61頁真菌檢驗各種真菌的形態(tài)結構有其一定的特殊性，一般可以通過直接鏡檢和培養(yǎng)進行鑒定，但具體方法應根據(jù)標本種類和檢查目的而異。

第38頁/共61頁一、標本的直接檢查顯微鏡檢查抗原檢測第39頁/共61頁顯微鏡檢查皮屑、毛發(fā)、指（趾）甲屑等標本置玻片上，滴加10%KOH少許，以蓋玻片覆蓋后在火焰上微微加溫，使被檢組織中的角質(zhì)軟化。輕壓蓋玻片，使標本變薄透明，然后在低倍或高倍鏡下檢查。若見菌絲或孢子，即可初步診斷患有真菌癬，但一般不能確定其菌種。皮膚癬標本檢查常用濕標本，不加染色。假絲酵母菌感染則取材涂片，行革蘭染色;隱球菌感染取腦脊液離心。沉淀物用墨汁作負染色后鏡檢。結果的判斷：①直接檢查陽性有意義，陰性不能排除感染。但陰道、痰等分離出假絲酵母菌、曲霉等條件致病菌需多次陽性才有意義。②組織中發(fā)現(xiàn)分隔分枝的菌絲多為曲霉;粗大、不分隔或不分枝的菌絲多為毛霉。假絲酵母菌出現(xiàn)假菌絲代表活動性，有意義。③皮膚癬菌菌絲肥大粗長，提示處于活躍狀態(tài)。④酵母型和二相型真菌在組織內(nèi)常表現(xiàn)為孢子。

第40頁/共61頁1010%KOH壓片：淺部真菌感染，敏感性更高第41頁/共61頁抗原檢測近年來有許多方法用于檢測深部感染真菌的抗體，作輔助診斷莢膜組織胞漿菌、念珠菌、曲霉菌。但系統(tǒng)性感染患者常因免疫功能降低不出現(xiàn)抗體；而且許多真菌間抗原性有交叉反應；有的產(chǎn)生抗體后維持時間較長，正常人群中有一定比例的陽性率，則必須結合臨床情況分析結果才能作出恰當?shù)脑\斷。由于上述檢測抗體受到許多因素的限制，及深部真菌感染時，早期培養(yǎng)陽性率甚低，晚期則多于失去治療時機，因此用免疫學方法從血清或其他部位檢測真菌抗原，對早期診斷具有重要意義。如乳膠凝集法檢測新型隱球菌病患者的莢膜多糖抗原，ELISA法檢測白色念珠菌感染者的甘露聚糖抗原及免疫熒光法檢測孢子絲菌病患者的可溶性抗原等，均為早期，快速、特異的診斷方法。

第42頁/共61頁血清學試驗（1）測抗原胞壁1,3-β-D-葡聚糖（G試驗），表面抗原甘露聚糖（LA試驗），熱不穩(wěn)定蛋白（LA試驗），胞漿蛋白烯醇化酶（ELISA和WB），Mr65000蛋白（抑制ELISA）等。（2）測抗體烯醇化酶（P47）抗體（ELISA），白念珠菌芽管抗體（CAGTA）間接免疫熒光法。（3）GM試驗臨床意義：早期診斷侵襲性曲霉菌感染檢測物質(zhì)：半乳甘露聚糖（Galactomannan）試驗原理：雙抗夾心法酶聯(lián)吸附試驗標本：血清、肺泡灌洗液、腦脊液第43頁/共61頁二、分離培養(yǎng)

直接鏡檢不能確診時應作真菌培養(yǎng)。皮膚、毛發(fā)、甲屑標本經(jīng)70%乙醇或2%石炭酸浸泡2～3min殺死雜菌，無菌鹽水洗凈后接種于含放線菌酮和氯霉素的沙保培養(yǎng)基上，25～28℃數(shù)日至數(shù)周，觀察菌落特征。必要時做小培養(yǎng)，于鏡下觀察菌絲、孢子特征進行鑒定。陰道、口腔粘膜材料可用棉拭子直接在血平板上分離。若為血液需先增菌，腦脊液則取沉淀物接種于血平板上37℃培養(yǎng)。若疑為假絲酵母菌取菌落研種于0.5ml血清試管內(nèi)，37℃1h后涂片革蘭染色。見有假絲酵母菌細胞長出芽管即可初步鑒定為假絲酵母珠菌。

第44頁/共61頁培養(yǎng)基的選擇1、葡萄糖蛋白胨瓊脂:也叫Sabourand(沙保羅或沙氏)瓊脂。它適合于多種霉菌的生長。2、血瓊脂培養(yǎng)基：適合于假絲酵母菌3、DTM：含蛋白胨、葡萄糖、酚紅、放線菌酮、慶大霉素、四環(huán)素等。它用于分離皮膚真菌。4、左旋多巴-枸櫞酸鐵=咖啡酸培養(yǎng)基：用于新生隱球菌的分離。5、酵母浸膏磷酸鹽瓊脂：分離莢膜組織胞漿菌和皮炎芽和菌。二、分離培養(yǎng)第45頁/共61頁培養(yǎng)方法:玻片培養(yǎng)法(小培養(yǎng));平皿培養(yǎng)法;大試管培養(yǎng)法二、分離培養(yǎng)培養(yǎng)溫度：25～28℃和35～37℃第46頁/共61頁菌落直接觀察觀察菌落的生長情況是鑒別真菌的主要方法之一。觀察菌落時注意①菌落性質(zhì)②菌落大?、劬漕伾芫涫欠裣鲁粒欠袷古囵B(yǎng)基開裂。菌落涂片觀察：絲狀菌菌落用乳酸酚棉蘭染色鏡檢。第47頁/共61頁1.在玻片滴上棉蘭2.制作膠帶粘菌小旗3.膠帶黏面輕壓菌苔粘菌4.在膠帶與棉棒交接處滴數(shù)滴75%酒精絲狀真菌鑒定重要步驟—乳酸酚棉蘭壓片5.翻轉(zhuǎn)棉棒有菌面貼在撥片

33第48頁/共61頁6.膠膜上再滴棉蘭7.再加上蓋玻片絲狀真菌鑒定重要步驟—乳酸酚棉蘭壓片8.用手壓實蓋玻片

34第49頁/共61頁三、生化試驗糖發(fā)酵試驗：利用真菌對各種糖的分解能力及代謝產(chǎn)物不同，借以鑒別。試驗方法同細菌試驗，主要用于檢驗深部感染真菌如假絲酵母菌、隱球菌等。常用的有單糖（葡萄糖、果糖、半乳糖），雙糖（麥芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖），三糖（蜜三糖），多糖（淀粉）；醇類有甘油、甘露醇、山梨醇、肌醇等。同化碳源試驗：將1ml含菌生理鹽水與已融化的固體同化碳源培養(yǎng)基（45℃）混合，然后在培養(yǎng)基上分別加入各種糖少許，置25℃或37℃孵育后觀察結果。若24h后無變化可重復加糖少許。如能同化，在加入糖的周圍有生長圈，否則無生長。固體平板培養(yǎng)基適用于生長快的真菌，而液體培養(yǎng)基則適合于生長慢的真菌。第50頁/共61頁三、生化試驗

同化氮源試驗或利用硝酸甲試：方法同同化碳源試驗，但需無氮源的培養(yǎng)基，不加糖，加入硝酸甲。其它：另外還有牛乳分解試驗和脲酶試驗、明膠液化試驗等，操作方法同細菌鑒定。第51頁/共61頁四、動物試驗主要用于分離、鑒定致病菌。常用實驗動物有小鼠、豚鼠和家兔等。應按實驗要求，選用一定的體重和年齡，具有高度易感性的健康動物。接種途徑有皮內(nèi)、皮下、腹腔、肌肉、靜脈、腦內(nèi)和灌胃等。接種后應仔細觀察動物的食量、精神狀態(tài)和局部變化，有時尚要測定體重、體溫和血液等指標。若死亡應立即解剖，檢查病變，或進一步作分離培養(yǎng)，證實由何病菌所致。第52頁/共61頁五、核酸檢測

（一）DNA中G+Cmol%含量測定

（二）電泳核型（EK）分析（三）隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）分析第53頁/共61頁（一）DNA中G+Cmol%含量測定是最早用于真菌分類學研究的分子生物學技術。目前在酵母菌的應用較為成功。即利用真菌DNA中核酸序列的同源性及基因大小相似性的遺傳特征，測定DNA中的堿基含量（G+Cmol%含量）作為真菌分類鑒定的重要遺傳指標之一。因為每種真菌都有固定的G+Cmol%范圍且較為穩(wěn)定，不同生物種的G+C含量是不同的，生物種之間的親緣關系越遠，其G+C含量差別就越大，反之亦然，因而可作為真菌的分類學指標。第54頁/共61頁（二）電泳核型（EK）分析

電泳核型是指細胞中的染色體在一定電場作用下在固體包埋物中的排列情況，反映了染色體的大小、數(shù)目和形狀的差異。它是通過脈沖電場凝膠電泳（PFGE）完成的，能分辨50kb至10Mb范圍內(nèi)的DNA分子，基本滿足酵母菌和絲狀真菌的要求。對病原體而言，EK分析特別適用于低等真核微生物或原蟲，它無需用RE消化和探針雜交，就可方便地從EK的差異區(qū)別不同的菌種。EK分析帶型清晰易辨、分辨力較強，電泳條件穩(wěn)定時結果重復性好。但EK受電泳條件影響較大，影響不同實驗室間的可比性，而且相同大小兩條不同染色體往往因遷移率相近呈現(xiàn)為同一條帶，影響分辨力。此外它需要昂貴的儀器，DNA的制備及PFGE過程也均較費時。

第55頁/共61頁（三）隨機擴增多態(tài)性DNA分析

（RAPD）

RAPD分析是一種利用隨機合成的單個寡核苷酸引物通過PCR反