實(shí)驗(yàn)九質(zhì)粒的制備

實(shí)驗(yàn)九質(zhì)粒的制備第1頁，共14頁，2023年，2月20日，星期六一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諌A變性裂解法制備質(zhì)粒DNA的原理。掌握DNA分離純化的基本操作技能。第2頁，共14頁，2023年，2月20日，星期六二．實(shí)驗(yàn)背景

質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外的環(huán)形雙鏈DNA分子，能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主的進(jìn)行復(fù)制。大多數(shù)來自細(xì)菌的質(zhì)粒是雙鏈、共價(jià)閉合環(huán)狀的分子，以超螺旋形式存在。它是細(xì)菌內(nèi)的共生型遺傳因子。大小可從1kb到200kb。第3頁，共14頁，2023年，2月20日，星期六質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要依賴于宿主細(xì)胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)，如離開宿主細(xì)胞則不能存活，而宿主即使沒有它們也可以正常存活。質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性，如對(duì)抗生素的抗性或致育因子等。第4頁，共14頁，2023年，2月20日，星期六質(zhì)粒類型質(zhì)粒按復(fù)制方式分為兩種類型：

松弛型質(zhì)粒和嚴(yán)緊型質(zhì)粒松弛型質(zhì)粒其復(fù)制不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，完全依賴于宿主提供的半衰期較長的酶。質(zhì)粒的拷貝數(shù)通常很高，有的甚至可達(dá)2000-3000拷貝/細(xì)胞。第5頁，共14頁，2023年，2月20日，星期六2.嚴(yán)緊型質(zhì)粒嚴(yán)緊型質(zhì)粒的復(fù)制受到嚴(yán)格控制，其拷貝數(shù)通常很低，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只含有1個(gè)或幾個(gè)質(zhì)粒分子。第6頁，共14頁，2023年，2月20日，星期六質(zhì)粒的應(yīng)用大多數(shù)基因工程使用松弛型質(zhì)粒。嚴(yán)緊型質(zhì)粒用來表達(dá)一些可使宿主細(xì)胞受毒害致死的基因。質(zhì)粒的特點(diǎn)使質(zhì)粒成為攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值。第7頁，共14頁，2023年，2月20日，星期六分離質(zhì)粒DNA方法從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA方法眾多，目前常用的有：堿變性法；煮沸法；羥基磷灰石層析法等各方法分離是依據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成及結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)加以選擇的，其中堿變性法既經(jīng)濟(jì)且收得率較高,提取的質(zhì)粒DNA可用于酶切,連接與轉(zhuǎn)化。第8頁，共14頁，2023年，2月20日，星期六三、實(shí)驗(yàn)原理

堿變性法基本原理堿裂解法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，堿變性抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在pH值高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離，當(dāng)以pH4.8的NaAc/KAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH值至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。而質(zhì)粒DNA仍為可溶狀態(tài)留在上清中。第9頁，共14頁，2023年，2月20日，星期六差速離心（differentialcentrifugation）是利用不同離心速度產(chǎn)生的不同離心力，將沉降系數(shù)不同的各種亞細(xì)胞組分和各種顆粒分開。用于分離大小、形狀顯著不同的組分，根據(jù)顆粒沉降速度不同得以分離.特點(diǎn)：（1）介質(zhì)密度均一；（2）速度由低向高，逐級(jí)離心。沉降順序：核——線粒體——溶酶體與過氧化物酶體——內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體——核蛋白體?？蓪⒋笮∠嗖顟沂獾募?xì)胞器初步分離，常需進(jìn)一步通過密度梯度離心再行分離純化。差速離心第10頁，共14頁，2023年，2月20日，星期六差速離心高速低速第11頁，共14頁，2023年，2月20日，星期六四、操作步驟第12頁，共14頁，2023年，2月20日，星期六第13頁，共14頁