生化實(shí)驗(yàn)血清醋酸纖維素膜電泳

生化實(shí)驗(yàn)血清醋酸纖維素膜電泳第1頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六電泳技術(shù)分光光度技術(shù)層析技術(shù)離心技術(shù)生物化學(xué)的四大研究技術(shù)：第2頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六電泳技術(shù)帶電粒子在電場(chǎng)中移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳。電泳技術(shù)即是利用樣品中各種帶電粒子的帶電性質(zhì)、分子大小、形狀等的差異，在電場(chǎng)中的遷移速度不同，從而對(duì)樣品分子進(jìn)行分離、鑒定、純化和制備。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，該技術(shù)多用于分離，純化、鑒定蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)。

第3頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六KaurinTiselius(1902-1971)因研究電泳和吸附分析，特別是發(fā)現(xiàn)關(guān)于血清蛋白的復(fù)雜本質(zhì)而獲獎(jiǎng)1948諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

1809年，俄國(guó)物理學(xué)家Peиce首次發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象；1937年，KaurinTiselius發(fā)明了Tiselius電泳儀，建立了自由界面電泳，首次證明人血清蛋白的組分；1948年，Wieland和Fischer以濾紙作為支持介質(zhì)的電泳；1959年，Raymond和Weintraub利用人工合成凝膠作為介質(zhì)——聚丙烯酰胺凝膠電泳:生物大分子的“LastCheck”！第4頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

（－）（+）----------------------------表面帶負(fù)電荷++++++++++++++++帶正電荷的水層（－）（+）

+++++++++++++++++表面帶正電荷---------------------------帶負(fù)電荷的水層++第5頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六電泳的影響因素：1、影響電泳遷移率的外界因素：電場(chǎng)強(qiáng)度溶液的pH值溶液的離子強(qiáng)度電滲現(xiàn)象2.影響電泳遷移率的內(nèi)在因素：質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷的量質(zhì)點(diǎn)的大小和形狀第6頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六電泳的分類根據(jù)電泳中是否使用支持介質(zhì)分為：自由界面電泳區(qū)帶電泳根據(jù)電泳系統(tǒng)pH是否連續(xù)分為：

連續(xù)pH電泳不連續(xù)pH電泳按支持物的裝置形式不同分為：

水平板式電泳垂直板式電泳垂直柱式電泳根據(jù)電泳物質(zhì)類別不同分為：細(xì)胞電泳，核酸電泳，蛋白質(zhì)電泳等按其介質(zhì)的物理性狀不同可分為：凝膠電泳粉末電泳線絲電泳纖維膜電泳等第7頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六血清醋酸纖維素薄膜電泳第8頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六基本原理本實(shí)驗(yàn)以醋酸纖維素為電泳支持物，分離各種血清蛋白。血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各種脂蛋白等。各種蛋白質(zhì)由于氨基酸組成、分子量、等電點(diǎn)及形狀不同，在電場(chǎng)中的遷移速度不同。以醋酸纖維素薄膜為支持物，正常人血清在pH8.6的緩沖體系中電泳，染色后可顯示5條區(qū)帶。其中清蛋白的泳動(dòng)速度最快，其余依次為α1-、α2-、β-及γ-球蛋白。第9頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六試劑

巴比妥緩沖液，染色液，漂洗液材料

血清，醋酸纖維素薄膜器材

電泳儀，培養(yǎng)皿，點(diǎn)樣器，玻璃板粗濾紙，鉛筆，加樣槍，鑷子等。

試劑和耗材第10頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六操作步驟1.準(zhǔn)備醋酸纖維素薄膜的預(yù)處理：

將薄膜小心放入盛有緩沖液的培養(yǎng)皿內(nèi)，使其漂浮在液面；用鑷子輕壓，使其全部浸入緩沖液內(nèi)。待膜完全浸透（約半小時(shí)）后取出，夾在清潔的濾紙中間，輕輕吸去多余的緩沖液，同時(shí)分辨出光滑面和粗糙面。

標(biāo)記：在粗糙面上用鉛筆距薄膜條一端1.5cm處劃線即為點(diǎn)樣線并作好標(biāo)記。第11頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六2.點(diǎn)樣（關(guān)鍵）

在薄膜的粗糙面點(diǎn)樣。點(diǎn)樣時(shí)，先用吸管將3微升血清均勻地涂在點(diǎn)樣器表面，再用點(diǎn)樣器“印”在薄膜的點(diǎn)樣區(qū)內(nèi)，樣品呈線狀，寬約1~2mm。注意：點(diǎn)樣時(shí)動(dòng)作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。另外操作過(guò)程要防止指紋污染。第12頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六3.電泳將點(diǎn)樣后的薄膜使粗糙面（點(diǎn)樣面）向下，點(diǎn)樣端置于負(fù)極，貼在電泳槽支架的“濾紙橋”上，平衡5min。打開(kāi)電源，調(diào)節(jié)電壓和電流強(qiáng)度。調(diào)節(jié)電壓至90-100V左右，電流強(qiáng)度為0.4～0.6mA/cm薄膜條寬，電泳時(shí)間40min-1h左右。1.濾紙橋2.電泳槽3.醋酸纖維素薄膜4.電泳槽膜支架5.電極室中央隔板

點(diǎn)樣端第13頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六4.

染色電泳完畢立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min。5.漂洗

用漂洗液漂洗，不停擺動(dòng)薄膜條，每3-5min左右換一次液，連續(xù)更換三次，可使背景顏色脫去。將膜夾在干凈濾紙中，吸去多余溶液。操作中，注意控制染色和漂洗的時(shí)間，防止背景過(guò)深或某些區(qū)帶太淺。第14頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六分清薄膜的點(diǎn)樣面注意點(diǎn)樣樣品的寬度和力度注意薄膜放置的方向控制染色及漂洗時(shí)間保持良好的實(shí)驗(yàn)秩序6、注意事項(xiàng)第15頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六預(yù)期結(jié)果

一般的染色后的薄膜上可顯現(xiàn)清楚的五條區(qū)帶。從正極端起，依次為清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。

清蛋白

12第16頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

1、洗脫法：剪下各蛋白區(qū)帶0.02mol/LNaOH洗脫將洗脫液用分光光度計(jì)比色結(jié)果計(jì)算每種蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)量的相對(duì)含量=該種蛋白管光密度讀數(shù)各管光密度讀數(shù)之和×100%思考：如何設(shè)置洗脫法的空白對(duì)照？各蛋白組分的定量第17頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

2、光密度計(jì)掃描法清蛋白

12

清蛋白

12第18頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六血清中各蛋白組分的含量蛋白質(zhì)類型平均值標(biāo)準(zhǔn)差正常范圍（M±2SD）白蛋白64.593.7557.45%-71.73%α1-球蛋白3.120.681.76%-4.48%α2-球蛋白6.161.064.04%-8.28%β-球蛋白9.091.156.79%-11.39%γ-球蛋白17.412.7811.85%-22.9%A/G1.800.281.24-2.36第19頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六臨床意義急慢性腎炎、腎病綜合征、腎功能衰竭：白蛋白降低，α1、α2和β球蛋白升高；慢性活動(dòng)性肝炎、肝硬化：白蛋白降低，β、γ球蛋白升高；急性炎癥：α1、α2球蛋白升高；慢性炎癥：白蛋白降低、α2、γ球蛋白升高；紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎：白蛋白降低，γ球蛋白顯著升高；多發(fā)性骨髓瘤：白蛋白降低，γ球蛋白升高，β和γ球蛋白區(qū)帶之間出現(xiàn)“M”帶。第20頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六小結(jié)1、本次課重要概念、原理。2、結(jié)合基本原理和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，綜合分析實(shí)驗(yàn)操作中存在的問(wèn)題。3、醋酸纖維素薄膜電泳實(shí)驗(yàn)操作的細(xì)節(jié)及影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵因素。4、電泳結(jié)果與臨床意義。第21頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日