骨組織修復研究進展專家講座

骨組織修復最新研究進展小組組員：曹俊杰李俊松陳海洋唐銀宏骨組織修復研究進展專家講座第1頁1.絲蛋白

絲蛋白，又名絲素蛋白，屬線狀蛋白質(zhì)，含有抗蛋自水解酶、抗紫外線，而且以其顯著柔韌性、抗疲勞和與鋼材相同張力強度，高溫下熱穩(wěn)定性，在酸堿條件下穩(wěn)定性，在一50℃～60℃溫度范圍內(nèi)保持有良好彈性等．

絲蛋白以其良好生物相容性和生物降解性成為生物醫(yī)藥材料中主要天然材料．以其高純度、低價格等優(yōu)點，在生物醫(yī)藥材料上有遼闊應用前景．主要包含：藥品載體、骨骼與軟骨組織修復材料、神經(jīng)與血管移植等．骨組織修復研究進展專家講座第2頁

骨骼與軟骨組織是堅硬結(jié)締組織，由細胞、纖維和基質(zhì)組成．而絲蛋白在這之中起到支架作用尤其主要．其優(yōu)異機械性能、較低炎癥反應、遲緩生物降解性能和完善生物相容性能，使其必定會成為骨骼與軟骨組織修復材料中主要材料之一．1.1絲蛋白在骨組織修復中應用骨組織修復研究進展專家講座第3頁1.2絲蛋白應用實例1

張鋒等研究充分證實了低降解速率絲蛋白支架，其在體內(nèi)外骨發(fā)生研究方面含有潛在應用價值；骨組織修復研究進展專家講座第4頁

謝瑞娟等啕將非水溶性絲蛋白加入到磷酸鈣骨水泥中，制成復合粉體，再按一定液固比將復合粉體調(diào)和成糊狀物，轉(zhuǎn)化為與骨有相同結(jié)構(gòu)絲蛋白一磷酸鈣骨水泥復合材料。它含有良好力學性能和生物相容性，經(jīng)過注射器直接注入手術(shù)部位，可準確塑型固化作為骨修復充填材料使用；或者在體外環(huán)境中自固化后再植入體內(nèi)，作為骨修復植入材料使用．1.2絲蛋白應用實例2骨組織修復研究進展專家講座第5頁

NSunita等研究絲蛋白與金屬鈦功效化應用，mRNA轉(zhuǎn)運了骨涎蛋白、骨鈣蛋白和堿性磷酸酶到成骨細胞，強化絲蛋白、絲蛋白一RGD固定化鈦基體培養(yǎng)。1.2絲蛋白應用實例3骨組織修復研究進展專家講座第6頁1.3絲蛋白總結(jié)在生物材料領域中，絲蛋白含有極大開發(fā)潛力．同時，依然有一些問題需要處理：

(1)絲蛋白需要加工成不一樣形態(tài)，以滿足不一樣需求；

(2)生物降解速率應能控制而且能匹配生物體生長；

(3)表面改性是用來改進絲蛋白材料生物相容性，生產(chǎn)臨床伎用絲蛋白材料應含有低免疫原性或無免疫原性；

(4)應該研究出更多新、有價值絲蛋白材料用于臨床醫(yī)學．骨組織修復研究進展專家講座第7頁2.透明質(zhì)酸

透明質(zhì)酸是骨生物材料研究新熱點。

透明質(zhì)酸含有高度黏彈性、可塑性、超強吸水性、滲透性和良好生物易吸收性，無免疫抗原性。

改性透明質(zhì)酸不但維持了原來優(yōu)越性能，而且完善了其性能，使之更能適應人體環(huán)境。

骨組織修復研究進展專家講座第8頁2.1透明質(zhì)酸在骨關(guān)節(jié)炎治療中應用

膝關(guān)節(jié)損傷、關(guān)節(jié)病骨關(guān)節(jié)炎是最常見疾病，注射透明質(zhì)酸（玻璃酸鈉）已經(jīng)成為治療骨關(guān)節(jié)病常見方法。關(guān)節(jié)滑液中透明質(zhì)酸與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起帶有大量負電荷，有較強吸水性和高度黏滯性。蛋白多糖聚合體能夠提升關(guān)節(jié)液潤滑性和黏彈性，并使?jié)櫥号c關(guān)節(jié)軟骨之間有較大親和力。透明質(zhì)酸與蛋白多聚糖能緊密附著在關(guān)節(jié)面上起潤滑作用，從而降低關(guān)節(jié)運動阻力保護關(guān)節(jié)軟骨免受過分機械磨損。骨組織修復研究進展專家講座第9頁2.2透明質(zhì)酸與生物因子結(jié)合對軟骨及骨缺損修復應用1.促進軟骨細胞增殖

透明質(zhì)酸本身帶負電荷，有較強親水性和高黏附性，與軟骨細胞之間有較強親和力。而且還含有軟骨誘導功效，能為關(guān)節(jié)軟骨細胞提供營養(yǎng)，參加蛋白多糖聚合物合成，經(jīng)過糖蛋白多糖在軟骨細胞表面起構(gòu)建作用，還能促進表層關(guān)節(jié)增生，維持未鈣化軟骨厚度，對發(fā)生退行性變關(guān)節(jié)軟骨在一定程度上含有促進其修復作用.骨組織修復研究進展專家講座第10頁透明質(zhì)酸改良后復合物在生物骨組織中應用

透明質(zhì)酸易降解，其降解時間與其分子量大小緊密相關(guān)。所以，要想延長透明質(zhì)酸分子在機體中降解時間，勢必要經(jīng)過化學修飾制備出一個分子量遠高于天然透明質(zhì)酸鈉分子衍生物，即交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉衍生物。骨組織修復研究進展專家講座第11頁透明質(zhì)酸復合物跟生長因子結(jié)合在骨組織中應用

透明質(zhì)酸是骨修復中生長因子良好運輸載體，但其作為支架主要缺點是它低細胞黏附性能，而整合素是細胞表面受體主要家族，對細胞和細胞外基質(zhì)黏附起介導作用.

透明質(zhì)酸-整合素，基質(zhì)可作為生長因子輸送載體，并含有潛在臨床應用價值。對于透明質(zhì)酸復合物研究是現(xiàn)在生物材料研究熱點，這種復合物結(jié)合本身物質(zhì)優(yōu)點，又能填補本身不足，有著其它物質(zhì)不可比擬優(yōu)勢，不過這種復合物組織相容性、炎癥反應和可降解性還沒有深入研究，這可能是今后研究熱點。骨組織修復研究進展專家講座第12頁3.磷酸鈣

磷酸鈣作為生物體硬組織中主要無機成份,含有良好生物相容性、生物活性及生物可降解性,廣泛應用于骨組織與牙齒修復和替換、藥品輸運和控制釋放、基因轉(zhuǎn)染及診療成像等生物醫(yī)學領域。人工合成磷酸鈣材料組成、結(jié)構(gòu)、尺寸、形貌和結(jié)晶度等特征均與材料制備方法相關(guān),且材料這些特征對其應用起到?jīng)Q定性作用。所以,發(fā)展不一樣方法制備出含有特定組成、結(jié)構(gòu)、尺寸、形貌、結(jié)晶度和性能磷酸鈣納米材料對其應用至關(guān)主要。本文綜述近年來在磷酸鈣納米材料制備、表征、性能和應用研究方面所取得最新進展,討論室溫制備法、溶劑熱/水熱合成法、微波輔助快速合成法、靜電紡絲法及含磷生物分子磷源合成法等制備方法,分析磷酸鈣納米材料性能及其在藥品裝載和可控釋放、蛋白質(zhì)吸附及釋放、生物成像等領域應用,展望磷酸鈣納米材料研究領域發(fā)展趨勢。骨組織修復研究進展專家講座第13頁4.硫酸鈣

自上世紀80年代以來，人們開始研究人工骨材料，從而使得骨修復生物材料學蓬勃發(fā)展心。人們期望能夠取得一個含有良好組織相容性、成骨活性、生物力學強度及與自體骨相近替換材料。硫酸鈣作為一個在臨床上廣泛應用人工骨支架材料，它含有良好生物相容性與降解性能、起源充分、滅菌方便等特點，被美國食品藥品管理局(FDA)同意應用于臨床骨缺損治療。骨組織修復研究進展專家講座第14頁硫酸鈣生物學特征4．1硫酸鈣生物相容性大量動物試驗及臨床應用發(fā)覺，硫酸鈣植入后對宿主周圍組織無炎癥刺激及異物刺激反應，無細胞毒性反應。4．2硫酸鈣在機體內(nèi)降解性能硫酸鈣在機體內(nèi)能夠被完全降解、吸收，而且不會對血液中鈣水平產(chǎn)生顯著影響深入研究發(fā)覺，硫酸鈣降解速率在一定范圍內(nèi)是可預測、可預期調(diào)控，而控制分子晶體結(jié)構(gòu)、大小及形態(tài)是其關(guān)鍵作用。骨組織修復研究進展專家講座第15頁硫酸鈣生物學特征4.3硫酸鈣成骨性能在局部誘導新骨生成、促進材料在生物體骨缺損處進行替換修復是理想人工骨材料必備條件。當前，硫酸鈣成骨機制還沒有被完全說明。普通認為，硫酸鈣促進成骨主要是因為其含有良好生物相容性和骨傳導性，這有利于成骨細胞長人材料內(nèi)部，實現(xiàn)了骨缺損修復。硫酸鈣材料降解過程會形成局部高鈣環(huán)境，能夠誘導成骨細胞生長，協(xié)同弱酸環(huán)境誘導成骨因子釋放，而且能夠促進與成骨細胞功效相關(guān)多重mRNA及BMPl、BMP7、骨細胞受體(FGFRI)等因子表示。研究表明，硫酸鈣支架材料含有良好骨誘導活性，它能夠誘導血管生成，增強局部營養(yǎng)能力，而且能促進骨髓間充質(zhì)干細胞進行分化成骨細胞，促進了局部人工骨材料血管化和成骨能力。骨組織修復研究進展專家講座第16頁4.2硫酸鈣在修復四肢骨缺損臨床應用

臨床研究發(fā)覺，硫酸鈣或硫酸鈣復合物植入缺損部位后能夠完全降解，而且在其降解過程中，能夠同時誘導新骨形成。作為良好填充材料，硫酸鈣植入由創(chuàng)傷、腫瘤等疾病引發(fā)骨缺損部位，不會產(chǎn)生炎癥反應，而且術(shù)后不易復發(fā)。

當前觀點是，硫酸鈣是一個安全、有效骨移植替換材料，它能夠有效阻止周圍軟組織快速長入，為骨組織再生提供時間以及良好環(huán)境。骨組織修復研究進展專家講座第17頁4.3硫酸鈣骨水泥在長骨骨缺損方面應用

當前，硫酸鈣骨水泥已經(jīng)廣泛應用于創(chuàng)傷、骨腫瘤病灶去除術(shù)、骨髓炎去除術(shù)等造成干骺端松質(zhì)骨缺損。

研究表明硫酸鈣骨水泥能夠有效修復橈骨遠端粉碎性骨折，在6周時間內(nèi)，骨碎片即可到達牢靠結(jié)合。當少許硫酸鈣骨水泥進入關(guān)節(jié)腔后，并未發(fā)覺異位骨化等并發(fā)癥。臨床發(fā)覺使用注射型硫酸鈣骨水泥，對跟骨骨折、脛骨平臺骨折、骨腫瘤病灶去除術(shù)等造成骨缺損空腔等進行治療，均取得滿意效果。骨組織修復研究進展專家講座第18頁4.4硫酸鈣作為藥品載體治療感染性骨缺損

感染性骨缺損、骨髓炎是骨科臨床經(jīng)常碰到難題，因其輕易重復發(fā)作，久治不愈，骨質(zhì)重復遭到破壞，并形成死骨，往往需經(jīng)歷屢次外科手術(shù)。

硫酸鈣可用作抗生素載體，能夠定點用藥，在局部形成較高藥品濃度，有效抑制細菌生長，全身副作用小。

硫酸鈣材料在體內(nèi)能夠完全吸收、降解，能夠有效填充清創(chuàng)后骨缺損死腔，含有良好生物相容性、力學強度、骨傳導能力、成骨能力。骨組織修復研究進展專家講座第19頁4.5硫酸鈣小結(jié)

硫酸鈣作為一個傳統(tǒng)骨科材料，不但僅被用作石膏來固定骨折，同時被看成骨移植替換材料來修復各種骨缺損。

硫酸鈣含有很多理想骨移植替換材料特點：①能在體內(nèi)被完全吸收。②含有良好生物相容性與可成形性。③可作為新骨生長支架，能夠填補骨缺損以及預防周圍軟組織快速長人。④能夠激活成骨細胞活性，誘導成骨。⑤能夠作為藥品緩、控釋載體。⑥滅菌方便、自然界中蘊含量豐富等。

所以，硫酸鈣是含有遼闊應用前景、可作為骨移植替換材料。當然，硫酸鈣還存在生物力學性能欠佳、降解速度稍快，不能單獨作為支架材料用于骨缺損修復等缺點。骨組織修復研究進展專家講座第20頁5.骨再生研究現(xiàn)實狀況分析

骨缺損是臨床上較為常見疾病，傳統(tǒng)臨床治療方法主要有自體骨移植與同種異體骨移植，但自體骨移植與同種異體骨移植均存在一定治療缺點，如自體骨移植存在供區(qū)并發(fā)癥與起源有限等缺點，同種異體移植存在并發(fā)疾病傳輸和免疫排斥風險；而骨組織工程即使有其本身不足，但因其可限制異體移植引發(fā)疾病傳輸、防止免疫排斥反應等已逐步成為一個新治療骨缺損模式。骨組織修復研究進展專家講座第21頁5.1骨組織移植物類型骨移植物包含自體移植、異體移植，異種移植及組織工程材料，自體移植因為起源有限及感染等并發(fā)癥，限制臨床應用。所以，其它類型移植物被引入，以克服自體移植不足是非常必要。研究分析，全部移植物均含有不一樣不足。骨組織修復研究進展專家講座第22頁5.2自體移植

自體移植指從個體本身一個部位取得組織移植于另一個部位，它們能夠是松質(zhì)骨、皮質(zhì)骨或皮質(zhì)骨與松質(zhì)骨結(jié)合，新鮮自體移植包含存活細胞和骨誘導蛋白質(zhì)，如BMP-2、BMP一7、FGF及IGF等。

從生物學角度來講，自體移植是最為理想移植材料，因為其完全沒有免疫原性，保留了其原有活性，因為缺乏免疫源性，所以在移植后可提升與宿主組織整合性。

另外，對于其成骨特征、骨誘導性、骨傳導特征，新鮮自體移植均是最正確，且可提供間充質(zhì)細胞、成骨前體細胞、成骨細胞以及生長因子。其缺點是，自體移植必須從自體骨組織獲取，從而增加供體部位疼痛、感染等并發(fā)癥，且對于大骨質(zhì)缺損，起源有限，限制應用。骨組織修復研究進展專家講座第23頁5.3同種異體移植

同種異體移植指從同一個屬不一樣個體取得，因為自體移植限制，同種異體移植已被廣泛應用于基礎研究與臨床應用，同種異體骨移植包含皮質(zhì)骨、松質(zhì)骨或皮質(zhì)松質(zhì)骨結(jié)合，諸如粉末狀、皮質(zhì)條、松質(zhì)立方塊，以脫鈣或未脫鈣、新鮮、新鮮冷凍、或冷凍干燥形式。

移植主要優(yōu)點是，輕易取得，防止犧牲宿主組織，含有良好骨誘導和骨傳導性，但但缺乏活性細胞，所以，含有較低成骨潛能。

同種異體骨移植存在傳輸疾病風險，且其可能造成免疫反應，干擾骨愈合過程，可能造成移植物排斥反應，有研究表明同種異體骨移植是與自體骨移植相比是欠缺比骨組織修復研究進展專家講座第24頁5.4骨組織工程

骨組織工程包括主要原因主要包含種子細胞、生物支架材料與生長因子，種子細胞為骨組織工程形態(tài)與組織重建基礎，生物支架材料是骨組織工程關(guān)鍵原因。

生物支架材料為種子細胞提供有效細胞外基質(zhì)環(huán)境，是種子細胞與生長因子有效載體。

另首先，支架材料為骨修復或新骨生長提供有效支撐作用，其支架材料研究是骨組織工程重點研究對象，生長因子主要為支架材料提供有效調(diào)整作用。骨組織修復研究進展專家講座第25頁5.5骨組織工程

天然聚合物細胞兼容性與生物活性，通常是優(yōu)于合成聚合物，不過天然聚合物與有機合成聚合物機械性能相對是較差，且降解速度無法控制。另首先，生物降解合成材料(包含脂肪族聚酯)已經(jīng)被應用于骨軟骨支架材料，依賴這個合成條件，其機械性能也輕易去控制。骨組織修復研究進展專家講座第26頁5.6骨組織工程總結(jié)

我們總結(jié)了最近關(guān)于骨軟骨組織工程最新進展，考慮到界面組織分層結(jié)構(gòu)獨特特點，理論上，骨軟骨支架需要含有多相結(jié)構(gòu)，以模仿骨軟骨組織正常結(jié)構(gòu)，然而多相結(jié)構(gòu)是非常復雜，需控制每個階段表型，比如每個層次結(jié)構(gòu)降解速度以及不一樣層面剪切應力，所以當前主要研究針對于雙向支架，其雙支架相對于多向支架是較為簡單。

然而對于兩個界面穩(wěn)定性依舊是需要提出質(zhì)疑，這個弱穩(wěn)定性可能是因為雙層界面結(jié)構(gòu)不一樣工藝構(gòu)建造成，為了克服這一點，將雙向支架鑄造為一個整體結(jié)構(gòu)可能抵抗這個雙向結(jié)構(gòu)間剪切應力。另外有一點依舊是值得懷疑，雙向支架是否能夠分別充分地促進軟骨與成骨分化，這是因為在各相支架上，細胞分化調(diào)整因子可能并非所期望細胞因子，為了克服這一點，需要構(gòu)建一個時空上靶向調(diào)控細胞因子投遞系統(tǒng)，經(jīng)過使用這個系統(tǒng)，在不一樣支架上細胞可取得對應細胞信號因子，為細胞各自每個階段分化調(diào)控發(fā)揮作用，所以，我們提出在未來研究中，在雙向支架需充分利用時空靶向基因投遞系統(tǒng)，以滿足骨軟骨組織工程組織修復應用。骨組織修復研究進展專家講座第27頁

近年來，骨性關(guān)節(jié)炎和運動造成關(guān)節(jié)軟骨損傷發(fā)病率逐步上升。因為關(guān)節(jié)軟骨自我修復能力有限，關(guān)節(jié)軟骨損傷后修復成為臨床急需處理問題。關(guān)節(jié)軟骨修復理想狀態(tài)是受損軟骨能連續(xù)生成透明樣軟骨，新生組織與周圍組織融合，同時能夠符合關(guān)節(jié)軟骨生物學和力學特征。6.關(guān)節(jié)軟骨新興生物治療骨組織修復研究進展專家講座第28頁6.1基因治療

基因治療基本原理是利用目標基因修飾相關(guān)細胞，使其表示一些含有治療作用基因產(chǎn)物，促進缺損處軟骨細胞修復和增殖分化，而且能夠在軟骨再生過程中連續(xù)、高效地分泌生長因子，完成修復過程。骨組織修復研究進展專家講座第29頁6．2

細胞治療

細胞治療是指經(jīng)過向組織內(nèi)注射細胞，從而修復受損組織。經(jīng)過多年研究，細胞治療已逐步走向臨床，包含腫瘤免疫細胞治療、干細胞治療等。在治療關(guān)節(jié)軟骨疾病方面主要用于骨性關(guān)節(jié)炎所造成關(guān)節(jié)軟骨損傷。所用細胞主要包含各種起源干細胞以及軟骨細胞。干細胞主要包含間充質(zhì)干細胞、脂肪干細胞、臍血干細胞、外周血干細胞等，軟骨細胞則包含自體軟骨細胞和同種異體軟骨細胞。骨組織修復研究進展專家講座第30頁6.3組織工程軟骨

組織工程軟骨基礎研究主要集中在種子細胞和生物支架兩個關(guān)鍵原因上。種子細胞包含各種起源干細胞和軟骨細胞。

近年來，國內(nèi)外不一樣學科教授在軟骨組織工程方面進行了大量研究，取得了巨大成就，國內(nèi)外都有組織工程軟骨進入臨床研究階段。FulcoI[4胡等利用組織工程軟骨為5位因腫瘤切除鼻翼小葉患者修復了切除鼻翼小葉。術(shù)后1年，患者鼻翼皮膚敏感性，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和呼吸流量等各項指標均符合預期。骨組織修復研究進展專家講座第31頁6.4關(guān)節(jié)軟骨未來展望

關(guān)節(jié)軟骨損傷后修復理想狀態(tài)是新生軟骨能較大程度符合正常關(guān)節(jié)軟骨生物學和力學性能。研究者和臨床工作者為了對受損關(guān)節(jié)軟骨到達理想修復狀態(tài)，針對關(guān)節(jié)軟骨損傷修復進行深入研究和探索，對傳統(tǒng)治療伎倆不停進行改進，一些新興治療方法也逐步應用于臨床。基因治療、細胞治療和組織工程軟骨是當前較為常見三項新興治療方式。相較于其它兩種技術(shù)，基因治療因為載體安全性和基因表示穩(wěn)定性等問題，當前仍局限于試驗室研究階段；細胞治療經(jīng)過多年研究，已逐步應用于臨床，尤其是自體軟骨細胞移植治療患者已上萬例，是一個極具希望治療關(guān)節(jié)軟骨損傷方法；組織工程軟骨當前也有產(chǎn)品進入臨床試驗階段，可望在很快未來逐步應用于臨床。骨組織修復研究進展專家講座第32頁7.3D打印技術(shù)在骨組織修復個體化治療中應用進展

傳統(tǒng)各類骨組織修復材料均需要在術(shù)中由手術(shù)醫(yī)生進行調(diào)整。因為材料本身性質(zhì)限制,難以到達與修復患區(qū)所需形態(tài)完全一致,也是術(shù)后產(chǎn)生并發(fā)癥主要原因。

而3D打印技術(shù),能夠依據(jù)醫(yī)學影像和組織結(jié)構(gòu)數(shù)字化信息處理,依據(jù)個體情況直接一次性成型所需要假體,不但能夠提供更多材料選擇,還能夠?qū)崿F(xiàn)假體空間多維化及表面生物孔隙處理,在處理以往假體為大塊實體弊端同時實現(xiàn)輕量化,更靠近生物特征,從而取得更加好相容性,深入減低了并發(fā)癥出現(xiàn)可能,提升患者術(shù)后生活質(zhì)量。骨組織修復研究進展專家講座第33頁

7.13D打印技術(shù)在骨關(guān)節(jié)外科中應用

3D打印技術(shù)具備無需特殊模具、制作快速、加工準確等特點,使得個體化假體設計、制備成為可能。

植入物大小、類型及位置等都能利用3D打印技術(shù)在術(shù)前有效確定,有利于術(shù)者制訂最正確手術(shù)方案,從而指導術(shù)者開展個體化關(guān)節(jié)外科手術(shù),使手術(shù)更精準,降低了手術(shù)時間和術(shù)中使用工具數(shù)量。骨組織修復研究進展專家講座第34頁7.23D打印技術(shù)在顱頜面外科中應用

近年來,國外學者經(jīng)過激光直接燒結(jié)Ti64粉末定制個性化骨板、個性化髁狀突—下頜骨骨板,進行下頜骨缺損腓骨瓣游離移植修復術(shù),認為個性化骨板能夠防止傳統(tǒng)手術(shù)中依賴醫(yī)生臨床經(jīng)驗重復修改調(diào)整鈦板這一過程,降低手術(shù)耗時,而且最大程度恢復下頜骨輪廓外形,降低術(shù)后并發(fā)癥。骨組織修復研究進展專家講座第35頁7.3基于組織工程3D生物打印骨科應用

應用3D打印制備生物支架,能夠滿足生物相容性、生物活性、力學性能等要求,其高孔隙率三維立體結(jié)構(gòu)更適合種子細胞增殖、分化與誘導成骨修復缺損,含有重大應用價值。

孫梁等經(jīng)過3D打印技術(shù)制備聚乳酸—聚羥乙酸/磷酸三鈣生物支架復合骨形成蛋白(bonemorphogeneticprotein,BMP)成功修復了兔15mm骨缺損,成骨速度與支架降解速度得到完美匹配。Samar等成功應用3D打印技術(shù)制備抗張力與松質(zhì)骨相同聚丙烯—磷酸三鈣支架。骨組織修復研究進展專家講座第36頁8富血小板血漿促進骨修復研究

富血小板血漿（plateletrichplasma,PRP