經(jīng)濟(jì)學(xué)第二節(jié)其他重要工具酶

經(jīng)濟(jì)學(xué)第二節(jié)其他重要工具酶DNA聚合酶（DNApolymerase）DNA聚合酶是催化以DNA或RNA為模板合成DNA的一類酶的總稱。經(jīng)常使用的DNA聚合酶有大腸桿菌DNA聚合酶I()、Klenow酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、耐高溫的TaqDNA聚合酶以及反轉(zhuǎn)錄酶等。這些DNA聚合酶的共同特點(diǎn)是：它們都能夠把脫氧核糖核苷酸(dNTP，包括dATP、dTTP、dCTP和dGTP)連續(xù)的加到雙鏈DNA引物鏈的3'-羥基末端上，催化核苷酸的聚合，形成新的DNA鏈。DNA聚合酶IDNA聚合酶I具有三種活性，即5→3聚合活性、5→3外切活性和3‘→5’外切活性。DNA聚合酶

I要發(fā)揮作用需滿足以下三個(gè)條件。①底物和激活劑：DNA聚合酶

I催化聚合反應(yīng)需要四種dNTP(dATP、dCTP、dTTP、dGTP)作為底物，同時(shí)Mg2＋是不可缺少的激活劑。②帶有3-端羥基末端的引物：DNA聚合酶

I所催化的聚合反應(yīng)總是在引物的3-OH末端基團(tuán)和攙入的dNTP之間發(fā)生的，且只能沿引物末端由5→3方向延伸。③DNA模板：可以是ssDNA或dsDNA，后者只有在其主鏈上有一至數(shù)個(gè)斷裂的情況下才能成為有效的模板。實(shí)驗(yàn)室中，利用

DNA

聚合酶I，通過(guò)DNA缺口平移的方法制備DNA

探針，可以用于核酸雜交分析。雙鏈DNA

的單鏈缺口在DNA

聚合酶I的5→3外切作用下，從缺口的5‘端逐步水解核苷酸時(shí)，酶的聚合活性則利用缺口的3’端游離羥基逐個(gè)加上相應(yīng)的單核苷酸，使得缺口向下游移動(dòng)，這種缺口移動(dòng)的現(xiàn)象就稱為缺口平移。如果反應(yīng)中使用的是用同位素標(biāo)記過(guò)的單核苷酸底物，則合成產(chǎn)生的DNA分子即可作為帶放射性標(biāo)記的DNA分子雜交探針。DNA聚合酶IDNA聚合酶I大片段(Klenow片段)是E.coliDNA

聚合酶I

的蛋白水解產(chǎn)物，特點(diǎn)是：具有DNA

聚合酶活性和3→5核酸外切酶活性，但缺失了5’→3’核酸外切酶活性。Klenow

既保留了全酶的高保真性，又不會(huì)降解DNA5末端。用途：在基因工程中主要用于切口平移法標(biāo)記DNA，同時(shí)也可用于DNA

的缺口補(bǔ)平和延伸。用途：用隨機(jī)引物制備探針補(bǔ)平5突出端，形成平末端切除3突出端，形成平末端合成cDNA第二條鏈誘變反應(yīng)中第二條鏈的合成雙脫氧法DNA序列測(cè)定(Sanger法)DNA

聚合酶I大片段(Klenow片段)DNA

聚合酶I大片段(Klenow片段)T4DNA

聚合酶在模板及引物存在的條件下，T4DNA

聚合酶催化沿5'→3'方向合成DNA。此酶還具有3'→5'外切核酸酶的活性，該活性比DNA

聚合酶I強(qiáng)。與E.coliDNA

聚合酶I

不同，T4DNA

聚合酶不具有5'→3'外切核酸酶活性。T4DNA

聚合酶■

缺口填充(無(wú)鏈置換活性)

■

產(chǎn)生平末端的最佳用酶

■

補(bǔ)平5'突出端，形成平末端

■

切除3'突出末端，形成平末端

■

通過(guò)置換合成法標(biāo)記探針

■

單鏈刪除后亞克隆

■

基因定點(diǎn)突變中第二條鏈的合成DNA片段的末端平滑化示例T7DNA聚合酶T7DNA聚合酶是從受T7噬菌體感染的大腸桿菌寄主細(xì)胞中純化出來(lái)的一種復(fù)合形式的核酸酶。它由兩種亞基組成：一種是T7噬菌體基因5編碼的蛋白質(zhì)，其分子量為84kD；另一種是大腸桿菌編碼的硫氧還蛋白(thioredoxin)，其分子量為12kD。T7DNA聚合酶是目前已知的持續(xù)合成能力最強(qiáng)的DNA

聚合酶，能連續(xù)合成數(shù)千個(gè)核苷酸。除聚合活性以外，T7DNA

聚合酶還具有單鏈和雙鏈的3‘→5’外切酶活性，它的活性也很強(qiáng)，約為Klenow

酶的1000倍。T7DNA聚合酶不具有5‘→3’外切酶活性。由于T7DNA聚合酶的高度續(xù)進(jìn)性和不受DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，在分子生物學(xué)中常被用于長(zhǎng)模板DNA的引物延伸反應(yīng)。同時(shí)，經(jīng)修飾的T7DNA聚合酶還是雙脫氧終止法對(duì)長(zhǎng)片段DNA進(jìn)行測(cè)序的理想工具酶。T7DNA

聚合酶

堿性磷酸酶（AlkalinePhosphatase）

堿性磷酸酶是一類能特異性地切去DNA或RNA的5‘-磷酸基團(tuán)的工具酶，它們的作用底物可以是ssDNA或dsDNA或RNA，也可以是NTP或dNTP。用途1）去除DNA片段的5’-末端的磷酸基。防止線狀DNA的自身環(huán)化（Self-Ligation）。

2）除去PCR反應(yīng)后殘存的dNTP。PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序時(shí)，在反應(yīng)體系中如果有多余的Primer和dNTP，將影響測(cè)序反應(yīng)的正常進(jìn)行。使用ExonucleaseI分解殘存的Primer；用SAP處理可降解多余的dNTP，之后不需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行精制，立即可以進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。從細(xì)菌中分離的堿性磷酸酶(AlkalinePhosphatase,E.coli

C75;

BAP)從小牛腸中分離的堿性磷酸酶(Alkalinephosphase,calfintestinal,CAP)。從蝦提取的蝦堿性磷酸酶（ShrimpAlkalinePhosphatase，SAP）

堿性磷酸酶

堿性磷酸酶T4多聚核苷酸激酶（T4polynucleotidekinase，PNK）

DNA或RNA5'末端的磷酸化，以便進(jìn)行連接反應(yīng)。DNA或RNA的末端標(biāo)記，用作探針和進(jìn)行DNA測(cè)序。

雙鏈DNA片段的磷酸化在微量離心管中配置溶液如下：37℃反應(yīng)3min,70℃反應(yīng)5~10分鐘使酶失活。進(jìn)一步用酒精沉淀的方法精制DNA。T4polynucleotidekinase2μlATP(10mM)5μl10reactionbuffer5μl雙鏈DNA片段10pmol

超純水補(bǔ)足50μlDNA

酶

I

（DNase）DNA酶I（DNaseI）是隨機(jī)水解雙鏈或單鏈DNA的一種內(nèi)切酶，使DNA分子降解成帶有5‘磷酸末端的單核苷酸和寡核苷酸的混合物。進(jìn)行重組DNA研究時(shí)，必須注意防止DNA酶的污染，否則制備的DNA樣品將會(huì)降解。因此使用的器皿或試劑要高溫處理，樣品中需加EDTA，或放置冰上以破壞或抑制酶活性。

用途1）與DNAPolymeraseI

一起用于切口平移（Nicktranslation）。2）在Mn2+存在的條件下，為鳥槍法測(cè)序（Shotgunsequencing）制作DNA文庫(kù)。3）用于足跡法（Footprinting）分析DNA-蛋白質(zhì)相互作用。4)DNaseI

可以作用于單鏈

DNA、雙鏈DNA、染色質(zhì)和RNA:DNA雜交鏈。RNA酶A（RibonucleaseA）

RibonucleaseA是一種內(nèi)切核糖核酸酶，可在C和U殘基位置特異性降解單鏈RNA。該酶可以切割核苷上5’-核糖與鄰近嘧啶核苷3’-核糖上磷酸基團(tuán)之間的磷酸二脂鍵。產(chǎn)生的2’，3’-環(huán)磷酸可以水解成相應(yīng)的3’-核苷磷酸鹽。

產(chǎn)品用途：質(zhì)粒和基因組DNA制備時(shí)用于去除RNA；重組蛋白質(zhì)制備過(guò)程中，除去溶液中的RNA。質(zhì)粒提取后用RNA酶處理其它的RNA酶RNA酶T1只作用于鳥嘌呤核苷酸的3‘磷酸根，切開(kāi)與其相鄰核苷酸連接的5’磷酸鍵；

RNaseH

可以降解DNA-RNA雜交鏈中的RNA分子。防護(hù)RNA酶的污染人體的分泌物如唾液、汗液中都含有RNA酶。因此在操作RNA樣品時(shí)，必須戴手套，實(shí)驗(yàn)用的玻璃器皿都要經(jīng)250℃烘烤4h(RNA酶耐熱)，或用RNA酶的抑制劑處理。末端轉(zhuǎn)移酶的主要用途末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶簡(jiǎn)稱末端轉(zhuǎn)移酶，分子量為60kD，來(lái)源于前淋巴細(xì)胞和分化早期的類淋巴樣細(xì)胞。在二價(jià)陽(yáng)離子的存在下，該酶能夠逐個(gè)地將脫氧核苷酸分子加到線性DNA分子的3'-OH末端。末端轉(zhuǎn)移酶在反應(yīng)過(guò)程中不需要模板的存在。對(duì)不同的dNTP所需要的二價(jià)陽(yáng)離子不同，若加入的核苷酸是嘧啶核苷酸，則Co2+為首選陽(yáng)離子；如果加入的核苷酸是嘌呤核苷酸，則Mg2+為首選陽(yáng)離子。當(dāng)反應(yīng)體系中只有一種dNTP時(shí)，就可以在DNA分子的3′末端加上同聚物尾巴(homopolymerictail)。末端轉(zhuǎn)移酶的主要用途分別給外源DNA片段和載體分子加上互補(bǔ)的同聚物尾巴，以使它們可以連接起來(lái)。例如：可以給用做克隆載體的線性DNA

分子的3'-OH

末端加上poly(dT)尾巴，給待克隆的外源DNA

片段的3'-OH

末端加上poly(dA)尾巴。然后將外源DNA

連接于載體中，形成重組DNA分子。末端轉(zhuǎn)移酶的主要用途DNA連接酶

作用機(jī)制及特點(diǎn)DNA連接酶(DNAligase)能利用NAD+或ATP中的能量，催化多段DNA的3‘羥基和5’磷酸末端之間形成3‘，5’-磷酸二酯鍵，把兩個(gè)DNA片段連接在一起，封閉DNA雙鏈上形成的切口(見(jiàn)圖3-3)。連接酶和限制酶一樣是基因工程中不可缺少的重要工具。應(yīng)當(dāng)注意，DNA連接酶只能連接雙鏈DNA分子的單鏈切口(nick)，既不能催化兩條單鏈DNA分子的連接(T4DNA連接酶例外)，也不能催化雙鏈中一個(gè)或多個(gè)核苷酸缺失所造成的缺口(gap)。DNA連接酶的分類常用的DNA連接酶有T4DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶兩種。在這兩種連接酶中，最常使用的是T4DNA連接酶，它的連接效率高，既可用于黏性末端的連接，也可用于平齊末端的連接。一般來(lái)說(shuō)，片段越小，末端黏性越強(qiáng)，連接反應(yīng)則可使用較高的溫度。DNA平齊末端的連接比黏性末端連接效率低得多。平齊末端的連接一般需要在10～20℃進(jìn)行，且需要較高的DNA濃度和T4DNA連接酶的濃度。而黏性末端的連接一般在16～26℃進(jìn)行。大腸桿菌

DNA

連接酶催化的連接反應(yīng)中所需要的能量由NAD+提供，

T4DNA連接酶催化的反應(yīng)中所需要的能量由ATP

提供。其他方面大腸桿菌DNA連接酶和T4DNA

連接酶的作用機(jī)制相同。

各種連接酶特性的比較

反轉(zhuǎn)錄酶商品化的反轉(zhuǎn)錄酶有兩種，一種來(lái)自禽成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)，另一種來(lái)自大腸桿菌中表達(dá)的Mo