細菌內毒素檢查法

細菌內毒素檢查法第1頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六一、基本概念細菌內毒素與熱原的關系熱原(Progen)

指臨床上能使哺乳類動物產生熱原反應的物質。關于熱原的定義在學術上還有爭論。細菌內毒素(Endotxin)

革蘭氏陰性細菌細胞壁的構成成分，具有多種生物活性，其化學結構是脂多糖(LPS)。熱原與內毒素的關系在學術上仍有爭論，但在GMP的條件下，在藥檢的范疇里，內毒素是主要的熱原物質，可以說無內毒素就無熱原，控制內毒素就控制熱原。第2頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六一、基本概念細菌內毒素檢查法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產生的細菌內毒素，以判斷供試品中的細菌內毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。細菌內毒素檢查包括兩種方式，即凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質法。供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進行試驗。當測定結果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠法為準。第3頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六一、基本概念細菌內毒素的量用內毒素單位(EU或IU)表示。細菌內毒素國家標準品系自大腸埃希菌提取精制而成，用于標定、復核、仲裁鱟試劑靈敏度和標定細菌內毒素工作標準品的效價。細菌內毒素工作標準品系以細菌內毒素國家標準品為基準標定其效價，用于試驗中的鱟試劑靈敏度復核、干擾試驗及各種陽性對照。第4頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六一、基本概念細菌內毒素檢查用水系指內毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝膠法）或0.005EU/ml（用于光度測定法）且對內毒素試驗無干擾的滅菌注射用水。試驗所用的器皿需經處理，以去除可能存在的外源性內毒素。常用的方法是在250℃干烤30分鐘以上，也可以采用其他確證不干擾細菌內毒素檢查的適宜方法。試驗操作過程應防止微生物的污染。第5頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六二、細菌內毒素檢查法(凝膠限量法)細菌內毒素檢查法（凝膠法）實驗程序如下：一、實驗準備：試劑、儀器、及用具等二、確定藥品的細菌內毒素限值（L）三、計算供試品的最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）或最低有效濃度（MVC）四、鱟試劑靈敏度復核五、藥品與鱟試劑相容性的初篩試驗六、供試品干擾試驗以及干擾試驗的驗證七、供試品日常的內毒素限量檢查。第6頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六三、實驗準備1.儀器、設備

37±1℃恒溫水浴或適宜的恒溫器具2.器具：凡與供試品或試劑直接接觸的器具必須經除熱原處理（250℃干烤30min以上）;塑料用具須確證不干擾實驗結果.3.試劑內毒素工作標準品、鱟試劑、鱟試驗用水、

PH調節(jié)劑。

第7頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六四、確定藥品的細菌內毒素限值（L）L=K/ML:供試品的內毒素限值,可從《藥典》上查詢或按以上公式計算,以EU/ml、EU/mg、EU/U表示K:按照規(guī)定的給藥途徑,人體每公斤體重每小時可接受的最大內毒素劑量,以EU/(kg.h)表示;M:人體每公斤體重每小時最大用藥劑量,以ml／(kg.h)、mg／(kg.h)或U／(kg.h)表示，中國人均體重按60公斤計算，人體表面積按1.62m2計算。按注射時間若不足1小時，按1小時計算。供試品每平方米體表劑量乘以0.027即可轉換為每千克體重劑量（M)。第8頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六五、鱟試劑靈敏度復核

1.鱟試劑靈敏度定義：在本檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產生凝集的內毒素的最低濃度即為鱟試劑的標示靈敏度，用EU/ml表示。2.目的

2.1考察鱟試劑靈敏度和細菌內毒素工作標準品的效價是否準確，

2.2考察試驗人員操作方法是否正確和試驗條件是否符合規(guī)定。3.鱟試劑靈敏度復核的條件

3.1使用新批號的鱟試劑，

3.2試驗條件發(fā)生了任何可能影響檢驗結果的改變時。第9頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六五、鱟試劑靈敏度復核4.溶液配制

注：A為內毒素水溶液系列；B為陰性對照編號內毒素濃度/配制內毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內毒素的濃度平行管數(shù)A2λ/檢查用水檢查用水12482λ1λ0.5λ0.25λ

4

444B無／檢查用水---------------2第10頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六五、鱟試劑靈敏度復核5.反應加樣6.結果判斷：反應管倒轉180°

陽性(+)：凝膠不變形，不從管壁滑脫者陰性(-)：無凝膠或凝膠不能保持完整，從管壁滑脫者內毒素濃度(EU／ml)2λλ0.5λ0.25λNC0.1ml鱟試劑○○○○○○○○○○○○○○○○○○反應條件37±1℃，60min±2min第11頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六五、鱟試劑靈敏度復核試驗有效性判斷

NC管必須全部為陰性(--)TAL與內毒素水溶液系列：

2λ管均為陽性(++++)，

0.25λ管均為陰性(----)

符合以上條件試驗有效第12頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六五、鱟試劑靈敏度復核結果計算鱟試劑靈敏度的測定值(λc)計算：

λc=antilg(∑X／4)X為反應終點濃度的對數(shù)值(lg)。反應終點濃度是指系列遞減的內毒素濃度中最后一個呈陽性結果的濃度。當0.5λ≤λc≤2λ時，以標示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。第13頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六六、鱟試劑靈敏度的選擇

一般為了試驗的方便，選擇靈敏度低的鱟試劑，若供試品的限值很小，則應選擇靈敏度高的鱟試劑，方便供試品溶液的稀釋和PPC（供試品陽性對照）的制備。

第14頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六七、供試品溶液的制備供試品溶液的最大稀釋倍數(shù)的計算

MVD＝CL/λL:供試品的內毒素限值；

C：供試品溶液的濃度；當L以EU/ml表示時，C為1ml/ml;當L以EU/mg或EU/u表示時，C的單位為mg/ml或u/ml(注意：當L以EU/ml表示時，C的值不是樣品的濃度，就是1)。第15頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六七、供試品溶液的制備某些供試品需進行復溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。一般要求供試品溶液的PH值在6.0～8.0的范圍內。(USP、EP一般要求供試品溶液與鱟試劑的混合液的PH值在6.0～8.0的范圍內。）

對于過酸、過堿或本身有緩沖能力的供試品，需要調節(jié)被測溶液(或其稀釋液)的PH值。第16頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六

八、藥品與鱟試劑相容性初篩試驗1.目的：通過一系列濃度的試驗，篩選出對鱟試驗無干擾的濃度2.作用：確定以后對樣品作BET常規(guī)檢查的兩個主要參數(shù)：樣品的有效稀釋范圍或有效濃度范圍，可選擇的鱟試劑的靈敏度范圍。減少干擾試驗的盲目性節(jié)省時間以及成本。第17頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六九、供試品的干擾試驗1.目的：判斷某種檢品在某種濃度下是否適合作內毒素檢查。2.原理：比較鱟試劑與內毒素的反應在水溶液中進行和在檢品中進行的差異,也即是比較反應在不同介質中進行反應的差異,無差異即無干擾,有差異即有干擾。若沒有干擾，該濃度可以進行日常檢查；若有干擾，則必須排除干擾后才能進行日常檢查。第18頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六九、供試品的干擾試驗3.在何種情況下需做干擾試驗：新品種建立方法鱟試劑的來源改變鱟試劑的配方、生產工藝改變供試品的來源改變供試品的配方、生產工藝改變試驗環(huán)境中發(fā)生了其它有可能影響試驗結果的變化。第19頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六九、供試品的干擾試驗編號內毒素濃度/配制內毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內毒素的濃度平行管數(shù)A無/檢查用水---------------2B2λ/檢查用水檢查用水12482λ1λ0.5λ0.25λ4444C2λ/供試品溶液供試品溶液12482λ1λ0.5λ0.25λ4444D無/供試品溶液---------------2①注：A為陰性對照；B為干擾試驗系列；C為鱟試劑標示靈敏度的對照系列；D為供試品溶液①

USP、EP規(guī)定為4支平行管凝膠法干擾試驗溶液的制備第20頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六九、供試品的干擾試驗加樣反應NCB溶液(PC系列)C溶液(PPC系列)供試品管內毒素濃度(Eu／ml)----2λλ0.5λ0.25λ2λλ0.5λ0.25λ----平行管○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○反應條件37±1℃，60min±2min第21頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六十、干擾試驗結果分析

試驗有效性判斷

---NC管必須全部為陰性

---供試品管必須為陰性

---TAL與內毒素水溶液系列：

2λ管均為陽性(++++)，

0.25λ管均為陰性(----)

即0.5λ≤Es≤2λ

符合以上條件試驗有效。

λ

第22頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六十、干擾試驗結果分析按下式計算系列溶液C和溶液B的反應終點濃度的幾何平均值(Es和Et)Es=antilg(∑Xs／4)Et=antilg(∑Xt／4)Xs和Xt分別為系列溶液C和溶液B的反應終點濃度的對數(shù)值(lg)。當0.5λ≤Es≤2λ且0.5Es≤Et≤2Es

時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。USP、EP規(guī)定當0.5λ≤Es≤2λ且0.5λ≤Et≤2λ時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。第23頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六十、干擾試驗結果分析反應結果1(SD表示供試品溶液)E0.5

E0.25

E0.125

E0.06NCEs

++++++++----------0.25Eu／mlSDE0.5

SDE0.25

SDE0.125

SDE0.06NPCEt

++++++++----------0.25Eu／ml

0.5λ≤Es≤

2λ且Es=Et,干擾成立第24頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六十、干擾試驗結果分析反應結果2：E0.5E0.25E0.125E0.06NCEs++++++++++++------0.125Eu／mlSDE0.5SDE0.25SDE0.125SDE0.06NPCEt++++++++----------0.25Eu／ml

0.5λ≤Es≤

2λ且Et=2Es,干擾成立第25頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六十、干擾試驗結果分析反應結果3：E0.5E0.25E0.125E0.06NCEs++++++++----------0.25Eu／mlSDE0.5SDE0.25SDE0.125SDE0.06NPCEt++++++++++++------0.125Eu／ml

0.5λ≤Es≤

2λ且

Et

=0.5Es,干擾成立第26頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六十、干擾試驗結果分析反應結果4：增強E0.5E0.25E0.125E0.06NCEs++++++++----------0.25Eu／mlSDE0.5SDE0.25SDE0.125SDE0.06NPCEt+++++++++++++-----0.104Eu／ml按中國藥典判斷：試驗有效，但內毒素供試品溶液系列不符合0.5Es≤Et≤2Es

，則認為干擾試驗不成立，即供試品在試驗濃度下有干擾作用。

按USP、EP判斷:內毒素供試品溶液系列0.25λ管（SDE0.5）中有一管呈陽性,不符合0.5λ≤Et≤2λ的要求,則認為干擾試驗不成立，即供試品在試驗濃度下有干擾作用。第27頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六十、干擾試驗結果分析反應結果5：增強E0.5E0.25E0.125E0.06NCEs++++++++++++------0.125Eu／mlSDE0.5SDE0.25SDE0.125SDE0.06NPCEt+++++++++++++-----0.104Eu／ml按中國藥典判斷:試驗有效，符合0.5λ≤Es≤2λ且0.5Es≤Et≤2Es

，則認為干擾試驗成立,即供試品在試驗濃度下無干擾作用。按USP、EP判斷:

內毒素供試品溶液系列0.25λ管（SDE0.5）中有一管呈陽性,不符合0.5λ≤Et≤2λ的要求，則認為干擾試驗不成立,即供試品在試驗濃度下有干擾作用。第28頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六十、干擾試驗結果分析反應結果6：抑制E0.5

E0.25

E0.125

E0.06NC

++++++++----------SDE0.5

SDE0.25

SDE0.125

SDE0.06NPC

+++---------------

內毒素供試品溶液系列2λ管（SDE0.5）中有一管呈陰性，供試品在該濃度下對凝膠反應有抑制作用。第29頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六十、干擾試驗結果分析反應結果7：抑制E0.5E0.25E0.125E0.06NCEs++++++++++++------0.125Eu／mlSDE0.5SDE0.25SDE0.125SDE0.06NPCEt

++++--------------0.5Eu／ml按中國藥典:0.5λ≤Es≤

2λ但

Et

＞2Es,干擾不成立。認為供試品在試驗濃度下對凝膠反應有抑制作用.按USP、EP:0.5λ≤Es≤

2λ且0.5λ≤

Et≤

2λ

干擾成立。認為供試品在試驗濃度下對凝膠反應無干擾作用.第30頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六十一、舉例：某產品的干擾試驗1.試劑試劑名稱廠家規(guī)格靈敏度或效價數(shù)量鱟試劑湛江安度斯0.1ml/支0.25Eu/ml36支工作標準品中國藥品生物制品檢驗所-------150EU/支1支BET水湛江安度斯50ml/瓶-------------PH調節(jié)劑湛江安度斯2ml/支-------1支某產品-------100ml:0.4g-------1瓶第31頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六十一、舉例：某產品的干擾試驗2.制備某產品供試品溶液某產品內毒素限值L≤0.6EU/mg最大有效稀釋倍數(shù)MVD=(4mg/ml×0.6EU/mg)/0.25EU/ml=9.6選擇稀釋倍數(shù)為8倍,則其供試液的濃度為0.5mg/ml。供試液(S8)的制備

2.0ml供試品+13.4mlBET水+0.6mlOH-,PH=7.0第32頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六十一、舉例：某產品的干擾試驗3.內毒素標準品溶液的制備細菌內毒素標準品溶液和內毒素供試品溶液的制備：分別用鱟試劑和供試品溶液將同一支內毒素標準品按以下步驟稀釋：

0.2ml0.2ml1.0ml

150EU/ml15EU/ml1.5EU/ml0.5EU/ml1.8ml1.8ml2.0ml1.0ml1.0ml1.0ml1.0ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml1.0ml1.0ml第33頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六十一、舉例：某產品的干擾試驗4.反應結果NCB溶液(PC系列)反應終點濃度C溶液(PPC系列)反應終點濃度供試品管內毒素濃度(Eu╱ml)---0.50.250.1250.060.50.250.1250.06----平行管-++--0.25++--0.25--++--0.25++--0.25-／++--0.25+---0.5／／++--0.25++--0.25／反應條件37±1℃，60min±2min第34頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六十一、舉例：某產品的干擾試驗

5.結果分析試驗有效性判斷：

NC管必須全部為陰性

NPC管必須全部為陰性

TAL與內毒素水溶液系列：

2λ管均為陽性(++++)，0.25λ管均為陰性(----)

試驗結果符合以上條件，試驗有效。

λ

第35頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六十一、舉例：某產品的干擾試驗按下式計算系列溶液C和溶液B的反應終點濃度的幾何平均值(Es和Et)

Es=antilg(∑Xs／4)=antilg［(lg0.25Eu／ml×4)／4］=0.25Eu／mlEt=antilg

(∑Xt／4)=antilg［(lg0.25Eu／ml×3+lg0.5Eu／ml)／4］=0.297Eu／ml0.5λ≤Es≤2λ且0.5Es≤Et≤2Es

，供試品在0.5mg／ml濃度下無干擾作用。第36頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六十二、消除干擾的方法

供試品若經干擾試驗證實存在干擾因素，可采用適宜的方法來消除干擾。消除干擾的一個重要原則是不能影響供試品中的內毒素生物活性。

1.供試品稀釋法

MVD=CL/λ

鱟試劑靈敏度(λ)越高(數(shù)值越小)，供試品的稀釋倍數(shù)越大，干擾越小。第37頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六十二、消除干擾的方法

2.物理方法如加熱法(血液制品)、冷析法(甘露醇)3.化學方法如調節(jié)PH值(奎諾酮類)、調節(jié)金屬離子(血液保養(yǎng)液、FDP)4.生物方法如抗增液的使用，阻斷G因子反應，防止假陽性；

5.其它方法如過濾法、溶劑抽提等第38頁，共44頁，2023年，2月20日，星期六十三、檢品的日常檢查

1.經過干擾試驗的驗證后，則可進行檢品的日常內毒素檢查，檢查法的反應管按以下設置：

注：A為供試品溶液；B供試品陽性對照(PPC)；C為陽性對照(PC)；D為陰性對照(NC)編