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細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法第1頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六一、基本概念細(xì)菌內(nèi)毒素與熱原的關(guān)系熱原(Progen)
指臨床上能使哺乳類動(dòng)物產(chǎn)生熱原反應(yīng)的物質(zhì)。關(guān)于熱原的定義在學(xué)術(shù)上還有爭論。細(xì)菌內(nèi)毒素(Endotxin)
革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的構(gòu)成成分,具有多種生物活性,其化學(xué)結(jié)構(gòu)是脂多糖(LPS)。熱原與內(nèi)毒素的關(guān)系在學(xué)術(shù)上仍有爭論,但在GMP的條件下,在藥檢的范疇里,內(nèi)毒素是主要的熱原物質(zhì),可以說無內(nèi)毒素就無熱原,控制內(nèi)毒素就控制熱原。第2頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六一、基本概念細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素,以判斷供試品中的細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查包括兩種方式,即凝膠法和光度測定法,后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法。供試品檢測時(shí),可使用其中任何一種方法進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)測定結(jié)果有爭議時(shí),除另有規(guī)定外,以凝膠法為準(zhǔn)。第3頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六一、基本概念細(xì)菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位(EU或IU)表示。細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品系自大腸埃希菌提取精制而成,用于標(biāo)定、復(fù)核、仲裁鱟試劑靈敏度和標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)。細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品系以細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定其效價(jià),用于試驗(yàn)中的鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗(yàn)及各種陽性對照。第4頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六一、基本概念細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水系指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml(用于凝膠法)或0.005EU/ml(用于光度測定法)且對內(nèi)毒素試驗(yàn)無干擾的滅菌注射用水。試驗(yàn)所用的器皿需經(jīng)處理,以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。常用的方法是在250℃干烤30分鐘以上,也可以采用其他確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法。試驗(yàn)操作過程應(yīng)防止微生物的污染。第5頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六二、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法(凝膠限量法)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法(凝膠法)實(shí)驗(yàn)程序如下:一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備:試劑、儀器、及用具等二、確定藥品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L)三、計(jì)算供試品的最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)或最低有效濃度(MVC)四、鱟試劑靈敏度復(fù)核五、藥品與鱟試劑相容性的初篩試驗(yàn)六、供試品干擾試驗(yàn)以及干擾試驗(yàn)的驗(yàn)證七、供試品日常的內(nèi)毒素限量檢查。第6頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備1.儀器、設(shè)備
37±1℃恒溫水浴或適宜的恒溫器具2.器具:凡與供試品或試劑直接接觸的器具必須經(jīng)除熱原處理(250℃干烤30min以上);塑料用具須確證不干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果.3.試劑內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品、鱟試劑、鱟試驗(yàn)用水、
PH調(diào)節(jié)劑。
第7頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六四、確定藥品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L)L=K/ML:供試品的內(nèi)毒素限值,可從《藥典》上查詢或按以上公式計(jì)算,以EU/ml、EU/mg、EU/U表示K:按照規(guī)定的給藥途徑,人體每公斤體重每小時(shí)可接受的最大內(nèi)毒素劑量,以EU/(kg.h)表示;M:人體每公斤體重每小時(shí)最大用藥劑量,以ml/(kg.h)、mg/(kg.h)或U/(kg.h)表示,中國人均體重按60公斤計(jì)算,人體表面積按1.62m2計(jì)算。按注射時(shí)間若不足1小時(shí),按1小時(shí)計(jì)算。供試品每平方米體表劑量乘以0.027即可轉(zhuǎn)換為每千克體重劑量(M)。第8頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六五、鱟試劑靈敏度復(fù)核
1.鱟試劑靈敏度定義:在本檢查法規(guī)定的條件下,使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度,用EU/ml表示。2.目的
2.1考察鱟試劑靈敏度和細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)是否準(zhǔn)確,
2.2考察試驗(yàn)人員操作方法是否正確和試驗(yàn)條件是否符合規(guī)定。3.鱟試劑靈敏度復(fù)核的條件
3.1使用新批號的鱟試劑,
3.2試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)。第9頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六五、鱟試劑靈敏度復(fù)核4.溶液配制
注:A為內(nèi)毒素水溶液系列;B為陰性對照編號內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A2λ/檢查用水檢查用水12482λ1λ0.5λ0.25λ
4
444B無/檢查用水---------------2第10頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六五、鱟試劑靈敏度復(fù)核5.反應(yīng)加樣6.結(jié)果判斷:反應(yīng)管倒轉(zhuǎn)180°
陽性(+):凝膠不變形,不從管壁滑脫者陰性(-):無凝膠或凝膠不能保持完整,從管壁滑脫者內(nèi)毒素濃度(EU/ml)2λλ0.5λ0.25λNC0.1ml鱟試劑○○○○○○○○○○○○○○○○○○反應(yīng)條件37±1℃,60min±2min第11頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六五、鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)有效性判斷
NC管必須全部為陰性(--)TAL與內(nèi)毒素水溶液系列:
2λ管均為陽性(++++),
0.25λ管均為陰性(----)
符合以上條件試驗(yàn)有效第12頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六五、鱟試劑靈敏度復(fù)核結(jié)果計(jì)算鱟試劑靈敏度的測定值(λc)計(jì)算:
λc=antilg(∑X/4)X為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對數(shù)值(lg)。反應(yīng)終點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個(gè)呈陽性結(jié)果的濃度。當(dāng)0.5λ≤λc≤2λ時(shí),以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。第13頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六六、鱟試劑靈敏度的選擇
一般為了試驗(yàn)的方便,選擇靈敏度低的鱟試劑,若供試品的限值很小,則應(yīng)選擇靈敏度高的鱟試劑,方便供試品溶液的稀釋和PPC(供試品陽性對照)的制備。
第14頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六七、供試品溶液的制備供試品溶液的最大稀釋倍數(shù)的計(jì)算
MVD=CL/λL:供試品的內(nèi)毒素限值;
C:供試品溶液的濃度;當(dāng)L以EU/ml表示時(shí),C為1ml/ml;當(dāng)L以EU/mg或EU/u表示時(shí),C的單位為mg/ml或u/ml(注意:當(dāng)L以EU/ml表示時(shí),C的值不是樣品的濃度,就是1)。第15頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六七、供試品溶液的制備某些供試品需進(jìn)行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。一般要求供試品溶液的PH值在6.0~8.0的范圍內(nèi)。(USP、EP一般要求供試品溶液與鱟試劑的混合液的PH值在6.0~8.0的范圍內(nèi)。)
對于過酸、過堿或本身有緩沖能力的供試品,需要調(diào)節(jié)被測溶液(或其稀釋液)的PH值。第16頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六
八、藥品與鱟試劑相容性初篩試驗(yàn)1.目的:通過一系列濃度的試驗(yàn),篩選出對鱟試驗(yàn)無干擾的濃度2.作用:確定以后對樣品作BET常規(guī)檢查的兩個(gè)主要參數(shù):樣品的有效稀釋范圍或有效濃度范圍,可選擇的鱟試劑的靈敏度范圍。減少干擾試驗(yàn)的盲目性節(jié)省時(shí)間以及成本。第17頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六九、供試品的干擾試驗(yàn)1.目的:判斷某種檢品在某種濃度下是否適合作內(nèi)毒素檢查。2.原理:比較鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)在水溶液中進(jìn)行和在檢品中進(jìn)行的差異,也即是比較反應(yīng)在不同介質(zhì)中進(jìn)行反應(yīng)的差異,無差異即無干擾,有差異即有干擾。若沒有干擾,該濃度可以進(jìn)行日常檢查;若有干擾,則必須排除干擾后才能進(jìn)行日常檢查。第18頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六九、供試品的干擾試驗(yàn)3.在何種情況下需做干擾試驗(yàn):新品種建立方法鱟試劑的來源改變鱟試劑的配方、生產(chǎn)工藝改變供試品的來源改變供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了其它有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化。第19頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六九、供試品的干擾試驗(yàn)編號內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/檢查用水---------------2B2λ/檢查用水檢查用水12482λ1λ0.5λ0.25λ4444C2λ/供試品溶液供試品溶液12482λ1λ0.5λ0.25λ4444D無/供試品溶液---------------2①注:A為陰性對照;B為干擾試驗(yàn)系列;C為鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對照系列;D為供試品溶液①
USP、EP規(guī)定為4支平行管凝膠法干擾試驗(yàn)溶液的制備第20頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六九、供試品的干擾試驗(yàn)加樣反應(yīng)NCB溶液(PC系列)C溶液(PPC系列)供試品管內(nèi)毒素濃度(Eu/ml)----2λλ0.5λ0.25λ2λλ0.5λ0.25λ----平行管○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○反應(yīng)條件37±1℃,60min±2min第21頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六十、干擾試驗(yàn)結(jié)果分析
試驗(yàn)有效性判斷
---NC管必須全部為陰性
---供試品管必須為陰性
---TAL與內(nèi)毒素水溶液系列:
2λ管均為陽性(++++),
0.25λ管均為陰性(----)
即0.5λ≤Es≤2λ
符合以上條件試驗(yàn)有效。
λ
第22頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六十、干擾試驗(yàn)結(jié)果分析按下式計(jì)算系列溶液C和溶液B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值(Es和Et)Es=antilg(∑Xs/4)Et=antilg(∑Xt/4)Xs和Xt分別為系列溶液C和溶液B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對數(shù)值(lg)。當(dāng)0.5λ≤Es≤2λ且0.5Es≤Et≤2Es
時(shí),認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。USP、EP規(guī)定當(dāng)0.5λ≤Es≤2λ且0.5λ≤Et≤2λ時(shí),認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。第23頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六十、干擾試驗(yàn)結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)果1(SD表示供試品溶液)E0.5
E0.25
E0.125
E0.06NCEs
++++++++----------0.25Eu/mlSDE0.5
SDE0.25
SDE0.125
SDE0.06NPCEt
++++++++----------0.25Eu/ml
0.5λ≤Es≤
2λ且Es=Et,干擾成立第24頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六十、干擾試驗(yàn)結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)果2:E0.5E0.25E0.125E0.06NCEs++++++++++++------0.125Eu/mlSDE0.5SDE0.25SDE0.125SDE0.06NPCEt++++++++----------0.25Eu/ml
0.5λ≤Es≤
2λ且Et=2Es,干擾成立第25頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六十、干擾試驗(yàn)結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)果3:E0.5E0.25E0.125E0.06NCEs++++++++----------0.25Eu/mlSDE0.5SDE0.25SDE0.125SDE0.06NPCEt++++++++++++------0.125Eu/ml
0.5λ≤Es≤
2λ且
Et
=0.5Es,干擾成立第26頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六十、干擾試驗(yàn)結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)果4:增強(qiáng)E0.5E0.25E0.125E0.06NCEs++++++++----------0.25Eu/mlSDE0.5SDE0.25SDE0.125SDE0.06NPCEt+++++++++++++-----0.104Eu/ml按中國藥典判斷:試驗(yàn)有效,但內(nèi)毒素供試品溶液系列不符合0.5Es≤Et≤2Es
,則認(rèn)為干擾試驗(yàn)不成立,即供試品在試驗(yàn)濃度下有干擾作用。
按USP、EP判斷:內(nèi)毒素供試品溶液系列0.25λ管(SDE0.5)中有一管呈陽性,不符合0.5λ≤Et≤2λ的要求,則認(rèn)為干擾試驗(yàn)不成立,即供試品在試驗(yàn)濃度下有干擾作用。第27頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六十、干擾試驗(yàn)結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)果5:增強(qiáng)E0.5E0.25E0.125E0.06NCEs++++++++++++------0.125Eu/mlSDE0.5SDE0.25SDE0.125SDE0.06NPCEt+++++++++++++-----0.104Eu/ml按中國藥典判斷:試驗(yàn)有效,符合0.5λ≤Es≤2λ且0.5Es≤Et≤2Es
,則認(rèn)為干擾試驗(yàn)成立,即供試品在試驗(yàn)濃度下無干擾作用。按USP、EP判斷:
內(nèi)毒素供試品溶液系列0.25λ管(SDE0.5)中有一管呈陽性,不符合0.5λ≤Et≤2λ的要求,則認(rèn)為干擾試驗(yàn)不成立,即供試品在試驗(yàn)濃度下有干擾作用。第28頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六十、干擾試驗(yàn)結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)果6:抑制E0.5
E0.25
E0.125
E0.06NC
++++++++----------SDE0.5
SDE0.25
SDE0.125
SDE0.06NPC
+++---------------
內(nèi)毒素供試品溶液系列2λ管(SDE0.5)中有一管呈陰性,供試品在該濃度下對凝膠反應(yīng)有抑制作用。第29頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六十、干擾試驗(yàn)結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)果7:抑制E0.5E0.25E0.125E0.06NCEs++++++++++++------0.125Eu/mlSDE0.5SDE0.25SDE0.125SDE0.06NPCEt
++++--------------0.5Eu/ml按中國藥典:0.5λ≤Es≤
2λ但
Et
>2Es,干擾不成立。認(rèn)為供試品在試驗(yàn)濃度下對凝膠反應(yīng)有抑制作用.按USP、EP:0.5λ≤Es≤
2λ且0.5λ≤
Et≤
2λ
干擾成立。認(rèn)為供試品在試驗(yàn)濃度下對凝膠反應(yīng)無干擾作用.第30頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六十一、舉例:某產(chǎn)品的干擾試驗(yàn)1.試劑試劑名稱廠家規(guī)格靈敏度或效價(jià)數(shù)量鱟試劑湛江安度斯0.1ml/支0.25Eu/ml36支工作標(biāo)準(zhǔn)品中國藥品生物制品檢驗(yàn)所-------150EU/支1支BET水湛江安度斯50ml/瓶-------------PH調(diào)節(jié)劑湛江安度斯2ml/支-------1支某產(chǎn)品-------100ml:0.4g-------1瓶第31頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六十一、舉例:某產(chǎn)品的干擾試驗(yàn)2.制備某產(chǎn)品供試品溶液某產(chǎn)品內(nèi)毒素限值L≤0.6EU/mg最大有效稀釋倍數(shù)MVD=(4mg/ml×0.6EU/mg)/0.25EU/ml=9.6選擇稀釋倍數(shù)為8倍,則其供試液的濃度為0.5mg/ml。供試液(S8)的制備
2.0ml供試品+13.4mlBET水+0.6mlOH-,PH=7.0第32頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六十一、舉例:某產(chǎn)品的干擾試驗(yàn)3.內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和內(nèi)毒素供試品溶液的制備:分別用鱟試劑和供試品溶液將同一支內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品按以下步驟稀釋:
0.2ml0.2ml1.0ml
150EU/ml15EU/ml1.5EU/ml0.5EU/ml1.8ml1.8ml2.0ml1.0ml1.0ml1.0ml1.0ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml1.0ml1.0ml第33頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六十一、舉例:某產(chǎn)品的干擾試驗(yàn)4.反應(yīng)結(jié)果NCB溶液(PC系列)反應(yīng)終點(diǎn)濃度C溶液(PPC系列)反應(yīng)終點(diǎn)濃度供試品管內(nèi)毒素濃度(Eu╱ml)---0.50.250.1250.060.50.250.1250.06----平行管-++--0.25++--0.25--++--0.25++--0.25-/++--0.25+---0.5//++--0.25++--0.25/反應(yīng)條件37±1℃,60min±2min第34頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六十一、舉例:某產(chǎn)品的干擾試驗(yàn)
5.結(jié)果分析試驗(yàn)有效性判斷:
NC管必須全部為陰性
NPC管必須全部為陰性
TAL與內(nèi)毒素水溶液系列:
2λ管均為陽性(++++),0.25λ管均為陰性(----)
試驗(yàn)結(jié)果符合以上條件,試驗(yàn)有效。
λ
第35頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六十一、舉例:某產(chǎn)品的干擾試驗(yàn)按下式計(jì)算系列溶液C和溶液B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值(Es和Et)
Es=antilg(∑Xs/4)=antilg[(lg0.25Eu/ml×4)/4]=0.25Eu/mlEt=antilg
(∑Xt/4)=antilg[(lg0.25Eu/ml×3+lg0.5Eu/ml)/4]=0.297Eu/ml0.5λ≤Es≤2λ且0.5Es≤Et≤2Es
,供試品在0.5mg/ml濃度下無干擾作用。第36頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六十二、消除干擾的方法
供試品若經(jīng)干擾試驗(yàn)證實(shí)存在干擾因素,可采用適宜的方法來消除干擾。消除干擾的一個(gè)重要原則是不能影響供試品中的內(nèi)毒素生物活性。
1.供試品稀釋法
MVD=CL/λ
鱟試劑靈敏度(λ)越高(數(shù)值越小),供試品的稀釋倍數(shù)越大,干擾越小。第37頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六十二、消除干擾的方法
2.物理方法如加熱法(血液制品)、冷析法(甘露醇)3.化學(xué)方法如調(diào)節(jié)PH值(奎諾酮類)、調(diào)節(jié)金屬離子(血液保養(yǎng)液、FDP)4.生物方法如抗增液的使用,阻斷G因子反應(yīng),防止假陽性;
5.其它方法如過濾法、溶劑抽提等第38頁,共44頁,2023年,2月20日,星期六十三、檢品的日常檢查
1.經(jīng)過干擾試驗(yàn)的驗(yàn)證后,則可進(jìn)行檢品的日常內(nèi)毒素檢查,檢查法的反應(yīng)管按以下設(shè)置:
注:A為供試品溶液;B供試品陽性對照(PPC);C為陽性對照(PC);D為陰性對照(NC)編
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