實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

內(nèi)容概要熒光定量PCR的基本概念熒光定量PCR的標(biāo)記方法熒光定量PCR解析方法

SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六常規(guī)PCR與實(shí)時(shí)熒光定量PCR常規(guī)PCR：借助電泳對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量及定性分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六熒光定量PCR常用的三個(gè)概念擴(kuò)增曲線熒光閾值CT值現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）BaselineLg－linerphase平臺(tái)期熒光基團(tuán)熒光檢測(cè)元件擴(kuò)增曲線現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）BaselineLg－linerphase

前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline）熒光閾值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動(dòng)設(shè)置：大于熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值；進(jìn)入指數(shù)期的最初階段真正的信號(hào):熒光信號(hào)超過閾值Threshold熒光閾值平臺(tái)期現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六Ct值的定義：

PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）CtvalueCt值Ct值的特點(diǎn)：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定；Ct值極具重現(xiàn)性現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六Ct值的數(shù)學(xué)原理理想的PCR反應(yīng)：Xn=X0×2n非理想的PCR反應(yīng)：Xn=X0(1+Ex)n方程式兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)得: logXn=log[X0(1+Ex)n]

整理方程式得:logX0=(-log(1+Ex))×n+logXn將C(t)和達(dá)到C(t)值時(shí)終產(chǎn)物的量Xc(t)帶入上式得：

logX0=(-log(1+Ex))×C(t)+

logXc(t)初始濃度的對(duì)數(shù)與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)Xn：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0：初始模板量Ex：擴(kuò)增效率現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六CyclenumberCk104Ck102SampleLgofDNAconcentration

模板DNA量越多，熒光達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。

Log模板起始濃度與Ct值呈線性關(guān)系。Ct值與模板起始量的關(guān)系現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六qPCR常用實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單成本較低適用于多重PCR特異性較好可進(jìn)行SNP檢測(cè)特異性非常好ABC現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六SYBRGreenI染料法——原理SYBRGreenI是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料SYBRGreenI現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六熱變性引物退火延伸反應(yīng)SYBRGreenI染料法——作用機(jī)理現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六問題點(diǎn)：

SYBRGreenI與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合后散發(fā)熒光，因此如果反應(yīng)體系中有非特異性擴(kuò)增或引物二聚體的產(chǎn)生，也將同時(shí)被檢測(cè)，從而可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。SYBRGreenI染料法——問題點(diǎn)與關(guān)鍵點(diǎn)關(guān)鍵點(diǎn)：

設(shè)計(jì)合適引物，防止非特異性擴(kuò)增！現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)(-dI/dT)原始圖譜對(duì)數(shù)圖譜SYBRGreenI染料法——融解曲線現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)確SYBRGreenI染料法——融解曲線現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六

使用方便，不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針具有價(jià)格優(yōu)勢(shì)優(yōu)點(diǎn)

無模板特異性對(duì)引物特異性要求較高不能進(jìn)行多重定量靈敏度相對(duì)較低缺點(diǎn)SYBRGreenI染料法——優(yōu)缺點(diǎn)現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六Taqman探針法——原理

5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等

3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)

探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光

Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六Taqman探針法——工作機(jī)理熱變性引物和探針與模板退火延伸反應(yīng)探針報(bào)告基團(tuán)淬滅基團(tuán)探針DNA聚合酶引物現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六1、引物、探針的設(shè)計(jì)：

探針Tm為68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能會(huì)淬滅熒光素，引物盡量靠近探針，擴(kuò)增片段<400bp，引物Tm為59-60℃2、反應(yīng)參數(shù)的確定：

一般為：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高），也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度

3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號(hào)/背景比值引物濃度：100-900nM

探針濃度：50-300nM4、其他與常規(guī)PCR相同Taqman探針法——PCR體系的建立現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六

高度特異性重復(fù)性好靈敏度高可進(jìn)行多重定量?jī)?yōu)點(diǎn)

只適合一個(gè)特定的目標(biāo)委托公司標(biāo)記，價(jià)格較高不易找到本底低的探針缺點(diǎn)Taqman探針法——優(yōu)缺點(diǎn)現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六

標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ)莖由互補(bǔ)配對(duì)序列組成環(huán)莖熒光素淬滅劑實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類－－分子信標(biāo)現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六FRET實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類——分子信標(biāo)現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六高特異性：對(duì)目標(biāo)序列檢測(cè)SNP最靈敏的試劑之一熒光背景低優(yōu)點(diǎn)

只能用于一個(gè)特定目標(biāo)設(shè)計(jì)困難價(jià)格比較高缺點(diǎn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類——分子信標(biāo)現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六

幾種方法的應(yīng)用比較方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)適用范圍SYBRGreenI適用性廣靈敏方便便宜引物要求高易出現(xiàn)非特異性帶適合科研中對(duì)各種目的基因定量分析，基因表達(dá)量的研究，轉(zhuǎn)基因重組動(dòng)植物的研究TaqMan特異性高重復(fù)性好價(jià)格高只適合特定目標(biāo)病原體檢測(cè)，疾病耐藥基因研究,藥物療效考核遺傳疾病的診斷MolecularBeacon高特異性熒光背景低只適合特定目標(biāo)設(shè)計(jì)困難價(jià)格高特定基因分析SNP分析現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線由已知濃度的RNA、質(zhì)粒生成定量未知模板標(biāo)準(zhǔn)樣品和未知樣品必須同時(shí)反應(yīng)相對(duì)定量

CtMethod:使用內(nèi)參基因定量所研究樣品和參照樣品目的基因，參照基因可以與目的基因同時(shí)反應(yīng)，也可以單獨(dú)反應(yīng)。雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法：對(duì)每個(gè)樣品的內(nèi)參基因和目的基因都做絕對(duì)定量，求出每個(gè)樣品中內(nèi)參基因和目的基因的絕對(duì)數(shù)量，然后根據(jù)相對(duì)定量的基本公式來求出目的基因的差異表達(dá)。絕對(duì)定量vs相對(duì)定量現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六Sample25絕對(duì)定量

Log（起始濃度）與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,即得到該擴(kuò)增反應(yīng)存在的線性關(guān)系

根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六一個(gè)目的基因

——即需要確定其量值的核酸序列。一組標(biāo)準(zhǔn)樣本

——用來生成標(biāo)準(zhǔn)曲線?？梢允呛心康幕虻馁|(zhì)粒、PCR產(chǎn)物、基因組DNA等。重復(fù)反應(yīng)孔

–——建議每個(gè)樣本使用三個(gè)或更多重復(fù)反應(yīng)，以確保統(tǒng)計(jì)顯著性。標(biāo)記方法的選擇——SYBRGreen法或探針法均可。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示——擴(kuò)增曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線；融解曲線（探針法不需要）。絕對(duì)定量分析幾要素現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六拷貝數(shù)的計(jì)算：待測(cè)樣本濃度（ng/ul）＝OD260×40×稀釋倍數(shù)樣本分子量=堿基數(shù)×324待測(cè)樣本拷貝數(shù)（copies/ul）=待測(cè)樣本濃度/樣本分子量×6×1014

倍比梯度稀釋方法：1v原液(標(biāo)準(zhǔn)品i)+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品ii1v標(biāo)準(zhǔn)品ii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iii1v標(biāo)準(zhǔn)品iii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iv1v標(biāo)準(zhǔn)品iv+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品v質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法與拷貝數(shù)計(jì)算現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六

方法：從血液中提取病毒DNA，以TaqMan探針法進(jìn)行熒光定量檢測(cè)

試劑：RealMasterMix（Probe）

標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為106、105

、104

、103

；2個(gè)重復(fù)；設(shè)陰性空白對(duì)照

實(shí)驗(yàn)步驟：提取HBVDNA；設(shè)計(jì)特異引物；設(shè)計(jì)TaqMan探針并標(biāo)記探針；熒光定量擴(kuò)增；結(jié)果分析：獲取血液樣品中HBVDNA的精確copy數(shù)。絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)例——乙肝病人血液中HBV的絕對(duì)定量現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六Samplecopies/mlCt1Ct2MeanCtSTD標(biāo)準(zhǔn)品5×10328.1828.6428.410.16標(biāo)準(zhǔn)品5×10425.2525.1425.190.04標(biāo)準(zhǔn)品5×10522.1122.4622.280.12標(biāo)準(zhǔn)品5×10618.6318.9218.770.10未知樣品?20.5620.4520.50.05空白對(duì)照NoneNone實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)乙肝病人血液中HBV的絕對(duì)定量現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六擴(kuò)增效率（E）計(jì)算

E=10-1/slope

－1=10-1/-3.29

－1

=2.01－1=1.01標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：利用MeanCt作圖可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.29x+40.33R2=0.9978乙肝病人血液中HBV的絕對(duì)定量

相關(guān)系數(shù)（R2）：大于0.98，越接近1，結(jié)果可信度越高。擴(kuò)增效率（E）：0.9-1.1,越接近1，越理想?，F(xiàn)在是30頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六未知樣品拷貝數(shù)的計(jì)算將Ct值帶入線性方程：20.5=-3.29X+40.33QuantityUnknown=106.03

=1,071,519copies乙肝病人血液中HBV的絕對(duì)定量X=20.5-40.33-3.29=6.03現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六理論上目的基因表達(dá)量分析條件SampleBSampleA目的基因擴(kuò)增效率相同RNA提取效率相同細(xì)胞起始數(shù)相同實(shí)際目的基因表達(dá)量分析相對(duì)定量的必要性現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六一個(gè)參照樣本一個(gè)或一個(gè)以上的未知樣本一個(gè)目的基因管家基因——用來校對(duì)不同樣本之間目的基因的實(shí)際表達(dá)量重復(fù)反應(yīng)孔

–——建議每個(gè)樣本設(shè)置三個(gè)或三個(gè)以上重復(fù)孔，以確保統(tǒng)計(jì)結(jié)果的可信度。標(biāo)記方法的選擇——SYBRGreen法或探針法均可。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示——擴(kuò)增曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線；融解曲線（探針法不需要）。一組標(biāo)準(zhǔn)樣本（有些分析方法不需要）相對(duì)定量分析幾要素現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六管家基因

維持細(xì)胞基本代謝活動(dòng)所必須的基因,如：GAPDH、Actin、18SrRNA等篩選方法

根據(jù)文獻(xiàn)提供通過具體實(shí)驗(yàn)篩選相對(duì)定量分析——管家基因篩選0123456Sample1Sample2Sample3Sample4實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)值β-ActinGAPDHβ-2-microglobulinHPRTP

P

P

O

現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六

雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法

2-△△Ct法

相對(duì)定量分析方法現(xiàn)在是35頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六相對(duì)定量分析實(shí)例分析利用TaqMan法研究ERBB2在正?；蛉橄倌[瘤組織標(biāo)本中的表達(dá)差異已知在50%的乳腺腫瘤樣本中,ERBB2表達(dá)異常,因此可以作為一個(gè)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)選用GAPDH作為內(nèi)標(biāo)基因FAM標(biāo)記的ERBB2探針VIC標(biāo)記的GAPDH探針構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線雙重PCR反應(yīng)陰性對(duì)照無RNA對(duì)照（空白）無逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)照（基因組）現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法Color2-VICdetectionforGAPDHColor1–FAMdetectionforERBB2現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六樣品擴(kuò)增：正常vs腫瘤PMT1-FAMdetection-ERBB2PMT2-VICdetection-GAPDH腫瘤腫瘤正常正常現(xiàn)在是38頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法——實(shí)驗(yàn)結(jié)果MultiplexReactions:C(t)HealthyRNACarcinoma28.4027.3628.4627.1228.43±0.0426.24±0.17ERBB2表達(dá)MultiplexReactions:C(t)HealthyRNACarcinoma23.2722.8123.4122.8628.34±0.1026.83±0.03GAPDH表達(dá)現(xiàn)在是39頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六HealthyRNATumorRNAGAPDHERBB210951052213024929550085730136000130800Copiesng/μlTotalRNAERBB2copies/GAPDHcopies1095/95500=0.0111052/85730=0.0122130/136000=0.0172492/130800=0.019HealthyRNATumorRNA0.0110.0180.018/0.011=1.6300.20.40.60.811.21.41.61.82HealthyTissueCarc.TissueRelativeExpression雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法——結(jié)果分析現(xiàn)在是40頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六ΔΔC(t)=4.41-5.18=-0.77±0.182-ΔΔc(t)=1.51-1.93結(jié)果與雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法相近HealthyRNABBER2GAPDHΔC(t)28.4023.275.3128.4623.415.0528.43±0.0428.34±0.105.18±0.18CarcinomaRNABBER2GAPDHΔC(t)27.3622.814.5527.1222.864.2626.24±0.1726.83±0.034.41±0.212法——實(shí)驗(yàn)結(jié)果－△△Ct現(xiàn)在是41頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六樣品制備環(huán)境要求定量體系配備數(shù)據(jù)分析RT上機(jī)濃度確定SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)無RNase環(huán)境使用無RNase耗材專用RNase-free工具純度高、完整性好的RNA分光光度計(jì)檢測(cè)電泳檢測(cè)現(xiàn)在是42頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六cDNA的合成反應(yīng)體系優(yōu)化試劑選擇樣品制備定量體系配備數(shù)據(jù)分析上機(jī)AMVM-MLVQuant下游反應(yīng)數(shù)確定反轉(zhuǎn)錄體積引物的選擇高效、全長(zhǎng)的cDNASYBR法實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)現(xiàn)在是43頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六cDNA合成(兩步法qRT-PCR)qPCR關(guān)鍵cDNA影響qPCR敏感度全長(zhǎng)cDNA合成增加qPCR成功率引物Oligo(dT):只識(shí)別mRNA，合成cDNA序列靠近3’隨機(jī)引物:隨機(jī)合成序列，可能合成非編碼RNA，造成定量結(jié)果高估兩者混合結(jié)合兩者優(yōu)點(diǎn)好的qPCR結(jié)果依賴于成功的cDNA合成現(xiàn)在是44頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六定量體系配備引物設(shè)計(jì)濃度確定環(huán)境要求誤差控制RT樣品制備數(shù)據(jù)分析上機(jī)核酸制備區(qū)反應(yīng)液制備區(qū)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)定濃度區(qū)間使用mix降低系統(tǒng)誤差設(shè)置重復(fù)（≥3次）設(shè)置空白和陰性對(duì)照均一的反應(yīng)液和模板混合物GC％：50－60％Tm：50－65℃單個(gè)堿基重復(fù)＜4個(gè)無二級(jí)結(jié)構(gòu)擴(kuò)增長(zhǎng)度：100－200bp現(xiàn)在是45頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六維基百科/google輸入待查基因名稱選擇物種mRNA找出目的mRNA輸入要查找的蛋白或是基因名稱NCBICOPY名稱到NCBI重新檢索目的mRNA序列文獻(xiàn)Real-TimePCR引物序列Blast確定引物特異性引物設(shè)計(jì)現(xiàn)在是46頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六SYBR引物設(shè)計(jì)原則SYBR-Green引物引物長(zhǎng)度18-30bp，產(chǎn)物長(zhǎng)度范圍100~400bpG/C含量:40-60%避免引物內(nèi)含有互補(bǔ)序列(尤其是3’端)避免3’端錯(cuò)配3’端不能出現(xiàn)連續(xù)三個(gè)以上的G或C避免3’端出現(xiàn)T堿基設(shè)計(jì)夸內(nèi)含子引物現(xiàn)在是47頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六TaqMan探針和引物設(shè)計(jì)TaqMan探針

-Tm值比引物高10℃

-沒有連續(xù)相同的堿基

-探針位置盡可能地靠近上游引物

-C遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于G-5‘端沒有GTaqMan引物

-Tm(58-600C)

-15-30basesinlength

-G+Ccontent30-80%

-不要有連續(xù)4個(gè)G

-3’端不能有連續(xù)兩個(gè)以上的G+C

-5‘端不要有G(AorCpreferred)-引物之間的TM相差避免超過2℃

-擴(kuò)增長(zhǎng)度50-150bp(max400)

-引物跨越內(nèi)含子現(xiàn)在是48頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六免費(fèi)的基于網(wǎng)絡(luò)的設(shè)計(jì)軟件Primer5（primer3.ut.ee）-引物和雙標(biāo)記水解探針的設(shè)計(jì)-Tm的計(jì)算MFold（

）-引物和擴(kuò)增產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)-二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性(deltaG)和融解溫度(Tm)BLAST（/）-結(jié)構(gòu)特異性現(xiàn)在是49頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六對(duì)照設(shè)置陰性對(duì)照Negativecontrol:Notemplate(NTC)：檢驗(yàn)是否有模板污染Noreversetranscriptase(NRT):檢驗(yàn)RNA樣品中是否有DNA污染Noamplificationcontrol(NAC):檢驗(yàn)是否有聚合酶污染Noprobecontrol(NPC):檢驗(yàn)熒光污染Buffer:Onlycontainsbuffer:檢驗(yàn)背景熒光陽(yáng)性對(duì)照Calibrator:可以用帶有PCR擴(kuò)增子的合成的RNA或cDNA寡核苷酸；質(zhì)粒DNA；克隆到質(zhì)粒的cDNA；體外反轉(zhuǎn)錄的RNA；ReferenceRNApools；來自于特定的生物體樣本的RNA或DNA及國(guó)際上公認(rèn)的生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)物。Standardcurve現(xiàn)在是50頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六反應(yīng)體系優(yōu)化上機(jī)反應(yīng)條件優(yōu)化cDNA的合成樣品制備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析退火溫度優(yōu)化：梯度PCR延伸時(shí)間：產(chǎn)物長(zhǎng)度決定反應(yīng)體積＞5ul，推薦20－50ul引物濃度優(yōu)化，模板量?jī)?yōu)化Mg2＋調(diào)節(jié)，酶活調(diào)節(jié)重復(fù)性擴(kuò)增效率：90％－110％：std＜0.2標(biāo)準(zhǔn)曲線：R＞0.99或R2

＞0.98SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)品待測(cè)樣本陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照現(xiàn)在是51頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六技能要求誤差控制儀器介紹上機(jī)（qPCR）試劑選擇cDNA的合成樣品制備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析自配realmastermixRCHO-LightcyclerseriesROTOGEN-RGseriesBIO-RADOpticonseriesABI-7seriesBioer－Linegeneseries分裝控制內(nèi)參控制機(jī)器校正控制平滑曲線，重復(fù)性好，靈敏度高SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)現(xiàn)在是52頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六數(shù)據(jù)分析儀器介紹分析方法上機(jī)cDNA的合成樣品制備模板準(zhǔn)備相對(duì)定量：2－△△Ct法絕對(duì)定量：標(biāo)準(zhǔn)曲線法可靠，準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)現(xiàn)在是53頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六qPCR體系的檢驗(yàn)用擴(kuò)增曲線檢驗(yàn)qPCR體系用融解曲線檢驗(yàn)qPCR體系用標(biāo)準(zhǔn)曲線檢驗(yàn)qPCR體系用No-TemplateControl(

NTC)檢驗(yàn)qPCR體系（引物）用NoRTControl檢驗(yàn)qPCR體系（模板）現(xiàn)在是54頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六擴(kuò)增曲線平滑起始無擴(kuò)增起峰時(shí)間正常NTC和NRC無擴(kuò)增或擴(kuò)增起峰較晚CT值是判斷實(shí)驗(yàn)成功與否的重要參考現(xiàn)在是55頁(yè)\一共有62頁(yè)\編輯于星期六熒光定量PCR參數(shù)解析--CT值CT值主要是由反應(yīng)中模板的初始濃度決定。模板濃度高，只需較少的擴(kuò)增循環(huán)就可累積足夠的產(chǎn)物，產(chǎn)生高過背景的熒光信號(hào)，那么CT值就會(huì)很早出現(xiàn)，相反CT值則會(huì)較晚出現(xiàn)。大多數(shù)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的CT值在18-30之間。CT值在30-35個(gè)循環(huán)之內(nèi)出現(xiàn)，需要多次重復(fù)試驗(yàn)以判斷數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，然后再判斷是否有目的基因的擴(kuò)