怎樣用好液相色譜11

液相色譜儀的使用液相色譜儀的正確連接常見的液相色譜儀問題色譜峰加寬分辨率低裂峰柱壓比預(yù)期值高現(xiàn)在是1頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用正確連接液相色譜儀系統(tǒng)可使用戶受益，原因如下：

相對比較便宜不需要花費(fèi)大量的時(shí)間系統(tǒng)中大多數(shù)流體連接均易于檢修通常有助于避免不必要的硬件替換接頭對正確連接至關(guān)重要，因此知道接頭的一些基本特點(diǎn)也很重要。液相色譜儀的正確連接現(xiàn)在是2頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用液相色譜儀的正確連接接頭的普通特征

螺紋（10-32，?-28，M6x1）管道外徑（1/16”、1/32”、1/8”）端口幾何形狀（錐形、平底）管套直徑接頭要素現(xiàn)在是3頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用液相色譜儀的正確連接套圈固定管道，并且始終以相同方式固定——用力按入圓錐形端口，如下圖所示……套圈錐度（或角度）端口錐度（或角度）接頭要素現(xiàn)在是4頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用液相色譜儀的正確連接…然后在套圈接觸內(nèi)套處壓緊管壁。接頭要素現(xiàn)在是5頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用液相色譜儀的正確連接通用端口有以下特征：螺紋管道尺寸內(nèi)部幾何形狀…但并非所有的接頭都是通用的!接頭要素現(xiàn)在是6頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用液相色譜儀的正確連接接頭要素管套的深度并非通用!即使是最好的接頭，如果不正確使用也會產(chǎn)生許多問題。為什么會出現(xiàn)問題？現(xiàn)在是7頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用液相色譜儀的正確連接接頭要素以下示例解釋了不匹配的接頭導(dǎo)致多種色譜法問題的原因：如果前端太長，套圈不能密封——因而會發(fā)生泄漏……如果前端太短，套圈可以密封——但是將會導(dǎo)致無效空間（死體積）和混合的發(fā)生……現(xiàn)在是8頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用接頭要素液相色譜儀的正確連接連接出現(xiàn)泄漏后將會引發(fā)以下問題：系統(tǒng)壓力損失注射假象（鬼峰）出現(xiàn)混合室（死體積）將會引發(fā)以下問題：色譜峰加寬分辨率減低顯著殘留裂峰引發(fā)色譜法問題的原因很多時(shí)，接頭不匹配或使用不當(dāng)將可能導(dǎo)致液相色譜儀的所有主要問題發(fā)生!現(xiàn)在是9頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用接頭要素液相色譜儀的正確連接選擇匹配的接頭時(shí)，應(yīng)首先清楚以下問題：使用的端口螺紋類型（例如，10-32、?-28等。）使用的端口幾何尺寸（例如，錐形或平底）所需連接的管道外徑（例如，1/16”，1/8”）是否可以手動緊固連接接頭應(yīng)與哪些化學(xué)藥品兼容接頭應(yīng)該承受多大壓力現(xiàn)在是10頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用管道要素液相色譜儀的正確連接關(guān)于液相色譜儀中的管道，以下三個(gè)要素必須考慮：管道的正確型號管道的最有效尺寸切割管道的合適工具如果想獲取最好的色譜法效果，必須考慮這三個(gè)方面！現(xiàn)在是11頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用管道要素液相色譜儀的正確連接如果您想選擇適合應(yīng)用需要的管道類型，請考慮以下問題：管道在系統(tǒng)中的使用位置哪種管道材料能夠?qū)崿F(xiàn)最好的兼容性產(chǎn)生多少壓力可提供多種不同類型的管道……高壓管道：不銹鋼、PEEK?、Radel?R、PEEKsil?等。低壓管道:Teflon?FEP、Teflon?PFA、Tefzel?等?，F(xiàn)在是12頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用管道要素液相色譜儀的正確連接選擇合適的管道尺寸時(shí)，請考慮以下問題：接受端口需要什么尺寸的管道？流速多少？管道將會產(chǎn)生多大壓力？接頭提供的管道尺寸是多少？請始終注意……-高壓管道最常見的尺寸為：1/16”O(jiān)Dx.010”ID-低壓管道最常見的尺寸為：1/8”O(jiān)Dx1/16”ID現(xiàn)在是13頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用管道要素液相色譜儀的正確連接這是系統(tǒng)低壓、高流量區(qū)域。這是系統(tǒng)高壓、低流量區(qū)域。這是系統(tǒng)低壓、低流量區(qū)域。現(xiàn)在是14頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用管道要素液相色譜儀的正確連接在具體應(yīng)用中，僅僅選擇合適的管道類型和正確的管道尺寸還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，但是………如果管道切割不當(dāng)，那么結(jié)果可能仍不理想?，F(xiàn)在是15頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用管道要素液相色譜儀的正確連接正確的切割技術(shù)確實(shí)能影響色譜法的質(zhì)量……不正確切割 正確切割現(xiàn)在是16頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用液相色譜儀的正確連接儲液器和泵之間的管道連接管道通常用Teflon?材料制造，尺寸為1/8”O(jiān)Dx1/16”ID。將管道連接至泵上的接頭通常為?-28螺紋，平底幾何形狀。泵和檢測器之間的管道連接管道通常用PEEK?聚合體或不銹鋼材料制造，尺寸為：1/16”O(jiān)Dx.010”ID或稍小。將管道連接至系統(tǒng)部件上的接頭通常為10-32螺紋，錐形幾何形狀。檢測器之后的管道連接管道通常用Teflon?材料制造，尺寸為1/16”O(jiān)D選擇正確接頭和管道的一般準(zhǔn)則現(xiàn)在是17頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用液相色譜儀的正確連接管道內(nèi)徑的公英制換算內(nèi)徑體積內(nèi)徑體積英寸mmuL/cm英寸mmuL/cm0.0050.130.130.030.754.560.0070.180.250.041.008.110.010.250.510.0461.2010.720.020.52.03現(xiàn)在是18頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用液相色譜儀的正確連接HPLC系統(tǒng)不同部位的管道部位種類內(nèi)徑/mm長說明儲液器～泵聚四氟乙烯1.6隨意能透氧泵～進(jìn)樣器不銹鋼管0.25~0.5隨意進(jìn)樣器定量管不銹鋼或PEEK視定量管體積而定長短由進(jìn)樣體積定，一般由進(jìn)樣閥制造商提供進(jìn)樣器～柱不銹鋼管0.18~0.25盡量短柱～檢測器不銹鋼或PEEK0.18~0.25盡量短檢測器放空聚四氟乙烯或聚乙烯0.25隨意需要時(shí)加長到1米，增加流過池出口壓力現(xiàn)在是19頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用液相色譜儀的正確連接不同色譜柱的管道使用指南色譜柱/(1mL/min)不同內(nèi)徑(mm)管柱外峰寬效應(yīng)5％時(shí)最大長度/cm柱長(mm)內(nèi)徑(mm)填料粒度um塔板數(shù)0.18mm0.25mm0.5mm334.634400229＜8504.6366773314＜81004.63133336727＜81504.651200016768＜82504.6520000278114＜82502.05200005020＜82501.052000012＜8＜8現(xiàn)在是20頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析分析型液相色譜儀定性及定量分析

a.靈敏度的要求b.樣品的復(fù)雜性c.樣品量的要求d.精度及準(zhǔn)確度的要求e.容易使用現(xiàn)在是21頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析分配色譜概述反相色譜的主要類型，基于分之的極性分離洗脫次序：一般為反相，即極性高的先被洗脫常用流動相：有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈，水應(yīng)用添加劑，成為離子對、離子抑制方法常用固定相：碳十八、碳八、胺基等基團(tuán)反相色譜固定相多為鍵合相現(xiàn)在是22頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析鍵合相色譜柱以硅膠為基質(zhì)，通過化學(xué)鍵合方式把碳十八、碳八、胺基等基團(tuán)聯(lián)在基質(zhì)上，作為固定相。優(yōu)點(diǎn)：固定相穩(wěn)定，不易流失。應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑。消除硅羥基的不良影響。缺點(diǎn)：PH值不能小于3或大于8同樣填料，各種牌號色譜柱不盡相同?，F(xiàn)在是23頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析色譜柱化學(xué)及外形的關(guān)系現(xiàn)在是24頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析Q：需要什么樣的分離結(jié)果？A：分辨率高?，F(xiàn)在是25頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析什么是色譜的分辨率？分辨率R的公式：現(xiàn)在是26頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析影響分辨率的因素：k’，a，N分辨率的方程：k’是容量因子，表達(dá)了樣品與填料的作用強(qiáng)弱。a是選擇性系數(shù)，描述兩化合物分離的好壞程度，是化學(xué)因素。N是理論塔板數(shù)，描述色譜峰的譜帶展寬程度?，F(xiàn)在是27頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析色譜柱的柱效N理論塔板數(shù)計(jì)算公式：現(xiàn)在是28頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析提高柱效(N)的方法色譜柱本身減小填料的顆粒度找到最佳的流速（根據(jù)不同的內(nèi)徑）合適的溫度降低溶劑的粘度增加柱長現(xiàn)在是29頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析其他影響柱效(N)的因素柱外效應(yīng)連接管路進(jìn)樣器檢測器進(jìn)樣體積樣品濃度現(xiàn)在是30頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析容量因子k’與峰高的關(guān)系與R的關(guān)系改變k’值的方法：調(diào)節(jié)流動相中有機(jī)溶劑濃度、pH值、離子強(qiáng)度等梯度淋洗k’=(tR-t0)/t0現(xiàn)在是31頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析選擇性系數(shù)a定義：a＝1時(shí)兩組分分不開，改變a的途徑：改變流動相種類改變固定相改變溫度改變樣品的本身性質(zhì)現(xiàn)在是32頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析a、k’、N如何控制分辨率

原始分離狀態(tài)改變k’后改變a后改變N后現(xiàn)在是33頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析開發(fā)液相色譜分析方法分辨率是色譜分析中主要考慮的因素。在開發(fā)色譜方法時(shí)，有很多因素是很重要的。除分辨率之外，以下因素都要考慮。1.靈敏度5.成本2.載樣量6.容易使用3.分析速度7.色譜柱壽命4.溶劑消耗8.效率現(xiàn)在是34頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析液相色譜分析方法的建立1建立液相色譜分析方法通常有以下幾步：（1）分子量－在樣品預(yù)處理或GPC分析時(shí)有用（2）選擇合適的液相色譜方法（正相、反相或其他）；（3）選擇合適的色譜柱；（4）溶解度－選擇流動相的條件（5）官能團(tuán)－有否離子化基團(tuán)？保留特性如何？（6）樣品的基質(zhì)－考慮是否要前處理，如何前處理現(xiàn)在是35頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析液相色譜分析方法的建立2續(xù)前一頁（7）選擇合適的K’值的條件；（8）選擇良好的峰位（a值）；（9）選擇良好的色譜柱條件（N值）；（10）檢測特性－是否有紫外吸收？熒光？（11）用實(shí)測樣品解決出現(xiàn)的特殊問題；（12）證實(shí)方法的正確性?，F(xiàn)在是36頁\一共有119頁\編輯于星期六方法樣品特點(diǎn)/色譜柱何時(shí)應(yīng)用該方法反相HPLC流動相：水/有機(jī)溶劑色譜柱：C18（ODS），C8，苯基，三甲基硅烷，氰基首選為能溶于水/有機(jī)混合物的中性或非離子化合物。離子對HPLC流動相：水/有機(jī)溶劑（一種緩沖物控制pＨ和離子對試劑）色譜柱：C18（ODS），C8，氰基離子或可電離化合物，尤其是堿性或陽離子化合物的良好選擇正相HPLC流動相：有機(jī)溶劑混合液色譜柱：氰基，二醇基，氨基，硅膠當(dāng)反相或離子對HPLC無效時(shí)的第二個(gè)較好選擇；首選為不溶于水/有機(jī)混合液的親脂樣品，異構(gòu)體混合物和制備HPLC硅膠最好液相色譜分析選擇液相色譜的方法主要液相色譜方法特性現(xiàn)在是37頁\一共有119頁\編輯于星期六方法描述/色譜柱何時(shí)應(yīng)用該方法離子交換色譜法流動相：水相，另以緩沖物控制pH色譜柱：陽離子或陰離子交換分離無機(jī)離子混合物的首選（離子色譜法）；分離蛋白質(zhì)、核酸樣品及有關(guān)化合物的良好選擇體積排阻色譜法流動相：水相（GFC）或有機(jī)相（GPC）色譜柱：GFC用二醇基，GPC用聚苯乙烯或硅膠，孔徑大小支配分子量范圍分離大分子樣品，如蛋白質(zhì)和人造聚合物的良好首選，也可用于測量分子量的分布疏水作用色譜法流動相：鹽溶液色譜柱：類似于反相填料，但疏水性小得多用于分離蛋白質(zhì)液相色譜分析選擇液相色譜的方法次要液相色譜方法特

性現(xiàn)在是38頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析液相色譜的保留保留時(shí)間tR的初步估計(jì)：保留時(shí)間tR＝死時(shí)間t0(1+峰容量因子k’）峰的容量因子k’＝（保留時(shí)間tR－死時(shí)間t0）/死時(shí)間t0t0≈0.5Ld2

左式中：t0－進(jìn)樣峰的出峰時(shí)間k’=(tR-t0)/t0tR－峰的保留時(shí)間L－柱長(cm)tR=t0(1+k’)d－柱內(nèi)徑(cm)

k’－峰的容量因子

現(xiàn)在是39頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析反相色譜不同配比流動相與容量因子值甲醇/水乙腈/水四氫呋喃/水峰容量因子值0/1000/1000/10010010/906/944/964020/8012/8810/901630/7022/7817/83640/6032/6823/772.550/5040/6030/70160/4050/5037/630.470/3060/4045/550.280/2073/2753/470.0690/1086/1463/370.03100/0100/072/280.01現(xiàn)在是40頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析溶劑強(qiáng)度

改變流動相的組成或溶劑的強(qiáng)度，就可以改變K’和tR。在一定的條件下，減少保留時(shí)間或縮短分析時(shí)間的溶劑（小tR和K’值）為強(qiáng)溶劑，增加或延長分析時(shí)間的溶劑（大tR和K’值）為弱溶劑。例如，在反相色譜中，水是弱溶劑。在甲醇/水為流動相的系統(tǒng)中增加甲醇的比例，流動相變強(qiáng)。液相色譜的溶劑由弱到強(qiáng)排列的順序?yàn)椋赫和?、氯仿、二氯甲烷、甲基叔丁醚、乙醚、四氫呋喃、乙酸乙酯、乙腈、丙醇、甲醇?/p>

在反相色譜中有機(jī)溶劑增加10％左右，tR和K’值要減少2-3倍?，F(xiàn)在是41頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析峰位的重排在分析多組分樣品時(shí)，僅改變流動相的強(qiáng)度（組成百分比）而不改變其組成，一般僅僅改變所有組分的tR，不會發(fā)生峰位重排。在反相色譜中，下列條件改變可能發(fā)生峰位重排：（1）流動相中換了強(qiáng)溶劑種類；（2）pH值的改變；（3）柱填料的改變；（4）柱溫的改變；（5）流動相組成的改變（如加入離子對試劑三乙基胺等）現(xiàn)在是42頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析液相色譜壓力計(jì)算(4.6內(nèi)徑柱)式中：L――柱長，(mm)；e――流動相粘度；F――流速，mL/mindc――柱內(nèi)徑，(mm)；dp――柱填料直徑，(mm)反相色譜常用流動相的粘度值（mPa·s）（25℃）有機(jī)溶劑/水（體積比）甲醇乙腈四氫呋喃0/1000.890.890.8920/801.40.981.2240/601.620.891.3860/401.540.721.2180/201.120.520.85100/00.560.350.46注1：左表紅線框內(nèi)的數(shù)字即為該溶液與水混合后的粘度（在25℃時(shí)）即e注2：以上計(jì)算公式是針對新柱而言。現(xiàn)在是43頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析實(shí)驗(yàn)室常備的流動相和固定相

為滿足液相色譜的方法選擇，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該常備以下的流動相和固定相（1）流動相：甲醇、乙腈、純水、四氫呋喃、正己烷二氯甲烷，這些溶劑基本上能滿足90％以上的液相色譜分離問題。（2）固定相：C18鍵合相柱、硅膠柱、氰基柱合氨基柱。幾點(diǎn)注意事項(xiàng)

色譜柱和流動相確定以后，為想獲得滿意的色譜分離，可進(jìn)一步選擇柱長、填料粒度和流速等。需要指出的是某些樣品在進(jìn)樣前要進(jìn)行很完全的樣品預(yù)處理，另外，許多樣品則需要梯度洗脫，當(dāng)色譜條件有所改變時(shí)，需要尋找更合適的分離條件。現(xiàn)在是44頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法的開發(fā)第一步干什么？想辦法得到各種信息向同行了解是否做過此類樣品，或有否類似樣品的分析方法；查文獻(xiàn)，各種手冊，如藥典、農(nóng)藥手冊以及國家標(biāo)準(zhǔn)；向儀器制造商詢問。對色譜柱有足夠的了解掌握分離機(jī)理，自己開發(fā)方法。充分了解自己的樣品現(xiàn)在是45頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法的開發(fā)分析時(shí)要了解哪方面的情況？靈敏度的要求有多高？樣品的本底是否很復(fù)雜？有多少組分要分析？對分析的精確度、準(zhǔn)確度等有多高要求？是否因是日常檢驗(yàn)而要求方法容易使用？現(xiàn)在是46頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法的開發(fā)分離時(shí)要了解哪方面的情況？要分離的樣品量有多大？要分離的組分在樣品中的含量很高還是微量？是否需要保持生物活性？對分離產(chǎn)物純度的要求有多高？純度和活性的鑒定如何完成？現(xiàn)在是47頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法的開發(fā)一般的具體步驟先用一根短的色譜柱用相對較高的流速使用盡可能純度高的標(biāo)準(zhǔn)品先用高強(qiáng)度的洗脫液調(diào)節(jié)k值改變保留值調(diào)節(jié)a值改變選擇性調(diào)節(jié)柱長度改變柱效及分離速度請記住每次改變一個(gè)參數(shù)現(xiàn)在是48頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法的開發(fā)使用文獻(xiàn)方法色譜柱填料的種類、品牌是否相同？注意文獻(xiàn)方法的流動相是否損害色譜柱？如色譜填料品牌不同，需要調(diào)整流動相。注意色譜柱的規(guī)格：內(nèi)徑、柱長需要調(diào)整流速、進(jìn)樣量注意梯度條件了解系統(tǒng)的滯后體積（梯度）現(xiàn)在是49頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法的開發(fā)色譜方法轉(zhuǎn)換如果沒有與文獻(xiàn)或要求相近的色譜柱轉(zhuǎn)換進(jìn)樣量：轉(zhuǎn)換流速：D＝內(nèi)徑；L＝長度現(xiàn)在是50頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法的開發(fā)離子型化合物的分離方式使用離子交換柱：離子交換法主要用于強(qiáng)的陰、陽離子樣品使用反相柱：離子抑制色譜法通過改變流動相的PH值，使樣品呈中性

離子對色譜法加入“對離子”試劑，使樣品呈中性現(xiàn)在是51頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法的開發(fā)離子抑制色譜離子型化合物在反相色譜柱上不保留改變流動相的pH值，抑制樣品離子的電離適用于弱酸性化合物的分離降低流動相的pH值，使樣品降低離子化使用硅膠基質(zhì)C18填料使用條件應(yīng)在填料基質(zhì)的范圍內(nèi)硅膠柱的pH在2－8（較保險(xiǎn)值3－7）內(nèi)現(xiàn)在是52頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法的開發(fā)離子抑制色譜的使用范圍如果：一些酸在pH低于2時(shí)還保持離子化；一些堿在pH高于7時(shí)還保持離子化；可以有以下的選擇：離子交換色譜；使用聚合物反相柱，在pH高于7時(shí)用離子抑制法；使用離子對色譜法?，F(xiàn)在是53頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法的開發(fā)離子對色譜法在反相色譜流動相中加入“離子對”試劑與樣品中可電離的組分形成“對離子”在反相色譜柱上分離離子型化合物離子對試劑的類型：磷酸季丁銨，適用于弱酸烷基磺酸鹽，適用于弱堿烷基長度不同，形成對離子的能力不同磷酸二丁胺，適用于弱堿現(xiàn)在是54頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法的開發(fā)方法開發(fā)的其它因素流速對柱效的影響不同內(nèi)徑的色譜柱有對自己的最佳流速樣品的進(jìn)樣濃度對柱效的影響樣品的進(jìn)樣體積對柱效的影響溶劑的粘度對柱效的影響以上因素均影響分離度現(xiàn)在是55頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法的開發(fā)結(jié)論充分用已知樣品結(jié)構(gòu)確定以哪種方法開始普通反相？離子抑制？離子對？還是其它觀察流動相條件改變時(shí)色譜峰的移動根據(jù)變化的方向及大小決定下一步干什么改變參數(shù)時(shí)要合理，每次只改動其中一個(gè)變量！色譜柱的改變影響最大現(xiàn)在是56頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法建立的實(shí)例等度分析色譜柱：C18，4mm×30mm流動相：乙腈/水，不同的溶劑強(qiáng)度，60/40、50/50、40/60，由強(qiáng)漸弱流速：2ml/min樣品：①對羥基苯甲酸甲酯(MethylParaben)②對羥基苯甲酸丙酯(PropylParaben)③對羥基苯甲酸丁酯(ButylParaben)現(xiàn)在是57頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法建立的實(shí)例改變?nèi)萘恳蜃觡'現(xiàn)在是58頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法建立的實(shí)例改變選擇性∶a通過改變流動相改變選擇性同樣強(qiáng)度的不同溶劑改變色譜柱123THF/H2O28:72MeOH/H2O58:42CH3CN/H2O38:62現(xiàn)在是59頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法建立的實(shí)例梯度方法的建立梯度洗脫的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)單位時(shí)間的分離能力增加檢測靈敏度提高缺點(diǎn)儀器設(shè)備要求高不適合某些檢測方式柱需再生定量分析的重復(fù)性較低分析時(shí)間長現(xiàn)在是60頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法建立的實(shí)例梯度的洗脫方式高壓梯度及低壓梯度溶劑A溶劑B泵A泵B混合器A高壓梯度溶劑A泵溶劑B比例閥（溶劑混合點(diǎn)）混合器B低壓梯度（溶劑混合點(diǎn)）現(xiàn)在是61頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法建立的實(shí)例梯度洗脫的可變參數(shù)A及B(可能還有C和D液)的成分和化學(xué)特性梯度的陡度梯度的變化形狀現(xiàn)在是62頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法建立的實(shí)例如不用梯度：分離不理想現(xiàn)在是63頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法建立的實(shí)例梯度條件的優(yōu)化現(xiàn)在是64頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法建立的實(shí)例梯度曲線的變化∶凹線現(xiàn)在是65頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法建立的實(shí)例梯度曲線的變化∶凸線現(xiàn)在是66頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法建立的實(shí)例梯度平衡時(shí)間的影響（一）10分鐘的梯度，6分鐘的平衡時(shí)間色譜圖不重復(fù)現(xiàn)在是67頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法建立的實(shí)例梯度平衡時(shí)間的影響（二）平衡時(shí)間∶6分鐘平衡時(shí)間∶7分鐘平衡時(shí)間∶8分鐘平衡時(shí)間∶9分鐘平衡時(shí)間從6到7分鐘，第一個(gè)峰的保留時(shí)間有明顯的變化，說明6到7分鐘的平衡時(shí)間不足，而8到9分鐘變化不大因而大于這個(gè)時(shí)間時(shí)，平衡充足?，F(xiàn)在是68頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法建立的實(shí)例有機(jī)污染物的影響（一）50ml超純水的有機(jī)物污染狀態(tài)現(xiàn)在是69頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法建立的實(shí)例有機(jī)污染物的影響（二）“三蒸水”有大量的有機(jī)污染物不適合梯度分析現(xiàn)在是70頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法建立的實(shí)例有機(jī)污染物的影響（三）典型的“實(shí)驗(yàn)室水”有大量的有機(jī)污染物不適合高靈敏度梯度分析現(xiàn)在是71頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法建立的實(shí)例梯度方法開發(fā)實(shí)例-第一步開發(fā)一個(gè)有9個(gè)烷基苯酮化合物的梯度方法，用C18柱，在最初的條件下(0-100%水-乙腈)，分離不理想。整個(gè)色譜峰組保留時(shí)間太長，分離度也不好現(xiàn)在是72頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法建立的實(shí)例梯度方法開發(fā)實(shí)例-第二步為使色譜峰前移，提高起始時(shí)乙腈的比例（50-100%，水-乙腈），分離得到改善。但是9個(gè)化合物出了10個(gè)色譜峰，說明有雜質(zhì)存在，很可能是流動相水中的?，F(xiàn)在是73頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法建立的實(shí)例梯度方法開發(fā)實(shí)例-第三步

從空白梯度圖顯示，在同樣的色譜條件，同樣的檢測靈敏度下，共有兩個(gè)雜質(zhì)峰。說明流動相水中的雜質(zhì)在此條件下可能會對檢測有影響。現(xiàn)在是74頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法建立的實(shí)例梯度方法開發(fā)實(shí)例-第四步

空白梯度圖同樣品的色譜圖進(jìn)行對照后，我們看到雜質(zhì)（共兩個(gè)峰）中的第一個(gè)小峰對第8個(gè)色譜峰有干擾，會使其定量分析結(jié)果不準(zhǔn)確?，F(xiàn)在是75頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法建立的實(shí)例梯度方法開發(fā)實(shí)例-第五步

根據(jù)“梯度曲線下的面積越大，洗脫能力越強(qiáng)”的規(guī)律，試用#5曲線使3-9號峰提前(曲線5，50-100%B)，但是小峰仍沒有分出來?，F(xiàn)在是76頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法建立的實(shí)例梯度方法開發(fā)實(shí)例-第六步

根據(jù)“梯度曲線下的面積越大，洗脫能力越強(qiáng)”的規(guī)律，試用#5曲線使3-9號峰提前，改用50-95%B見到好的現(xiàn)象?，F(xiàn)在是77頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜分析

分析方法建立的實(shí)例梯度方法開發(fā)實(shí)例-第七步最后用50-90%B，曲線4，得到好的結(jié)果?，F(xiàn)在是78頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用流動相儲液器1.最好使用專用的溶劑瓶來放置流動相2.改變流動相時(shí)防止交叉污染.3.不要使用陳舊的流動相.4.定期清洗或更換流動相儲液瓶.5.使用燒結(jié)不銹鋼吸濾頭6.定期清洗燒結(jié)不銹鋼吸濾頭.現(xiàn)在是79頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用對流動相的要求

由于高效液相色譜中流動相是液體，它對組分有親和力，并參與固定相對組分的競爭。因此，正確選擇流動相直接影響組分的分離度。對流動相溶劑的要求是：

（1）溶劑對于待測樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。

（2）溶劑要與檢測器匹配。對于紫外吸收檢測器，應(yīng)注意選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長要長。所謂溶劑的紫外截止波長指當(dāng)小于截止波長的輻射通過溶劑時(shí)，溶劑對此輻射產(chǎn)生強(qiáng)烈吸收，此時(shí)溶劑被看作是光學(xué)不透明的，它嚴(yán)重干擾組分的吸收測量?，F(xiàn)在是80頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用對流動相的要求

（3）高純度。由于高效液相靈敏度高，對流動相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。痕量雜質(zhì)的存在，將使截止波長值增加50—1OOnm。（4）化學(xué)穩(wěn)定性好。不能選與樣品發(fā)生反應(yīng)或聚合的溶劑。（5）低粘度。若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度過于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測器內(nèi)形成氣泡，影響分離.現(xiàn)在是81頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用常用流動相的紫外截止波長溶劑正己烷二硫化碳四氯化碳苯氯仿二氯甲烷四氫呋喃丙酮乙腈甲醇水紫外截止波長nm190380265210245233212330190205187現(xiàn)在是82頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用常用流動相的強(qiáng)度參數(shù)溶劑ε0溶劑ε0溶劑ε0氟烷－0.25苯0.32乙腈0.65正戊烷0.00氯仿0.40吡啶0.71石油醚0.01甲乙酮0.51正丙醇0.82環(huán)己烷0.04丙酮0.56乙醇0.88四氯化碳0.18二乙胺0.63甲醇0.95現(xiàn)在是83頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用良好的色譜實(shí)驗(yàn)習(xí)慣拿到一根新色譜柱時(shí)，先測柱效保留在新色譜柱上測得的色譜圖，并記錄條件定期檢測柱效定期檢測儀器的譜帶寬度現(xiàn)在是84頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用色譜柱的使用及操作流動相的轉(zhuǎn)換特別是GPC柱流速（壓力）的變化幅度溫度的變化幅度專用色譜柱：樣品及溶劑的要求記?。耗玫揭桓鶑奈从眠^的色譜柱時(shí)一定要先看使用說明！現(xiàn)在是85頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用色譜柱的保養(yǎng)1樣品方面除去微粒和雜質(zhì)。了解樣品在流動相中的溶解度。如樣品的溶劑不是流動相，一定要用流動相試溶解度，防止其在流動相中析出。了解樣品與色譜柱的基質(zhì)/填料是否相互作用現(xiàn)在是86頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用色譜柱的保養(yǎng)2流動相方面除去微粒純度的要求超純水，梯度實(shí)驗(yàn)時(shí)水中有機(jī)雜質(zhì)含量要低緩沖液的pH值要在填料的允許范圍內(nèi)緩沖液（鹽）的濃度溶劑：色譜純，并與填料相匹配溶劑中的雜質(zhì)含量流動相對樣品的溶解度有機(jī)溶劑或水的比例現(xiàn)在是87頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用在線的保護(hù)裝置給色譜柱提供物理的保護(hù)除去樣品及流動相中的顆粒給色譜柱提供化學(xué)的保護(hù)防止分析柱被化學(xué)污染裝置在線過濾器自裝填料保護(hù)柱預(yù)裝保護(hù)柱現(xiàn)在是88頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用在線過濾器在線過濾器防止顆粒在色譜柱頭累積優(yōu)點(diǎn)：基本不影響柱效在需要高柱效的分析中常用（如氨基酸分析）可更換的消耗品更換濾芯更換墊圈現(xiàn)在是89頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用保護(hù)柱可避免化學(xué)污染。多數(shù)保護(hù)柱影響到整個(gè)色譜柱的柱效，特別是使用微柱時(shí)保護(hù)柱的種類普通自裝填料的保護(hù)柱用戶自裝填料影響柱效同裝填技術(shù)有關(guān)，柱效降低較大ONGUARD預(yù)裝保護(hù)柱有各種填料的預(yù)裝柱供選擇，使用方便。填料容積小，也引起柱效降低現(xiàn)在是90頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用常用流動相的強(qiáng)度參數(shù)對所做的樣品要有充分的了解用對該樣品洗脫能力強(qiáng)的流動相清洗硅膠柱的一般方法先用甲醇洗去極性雜質(zhì)用干燥的二氯甲烷、正庚烷100－200ml依次活化鍵合相柱（烷基）的一般方法20倍柱體積的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次沖洗記?。好糠N色譜柱可能有特定的方法，一定要先看其使用說明現(xiàn)在是91頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用色譜柱的存放存放前的處理除去雜質(zhì)、鹽合適的存放溶劑避免色譜柱床的干枯避免機(jī)械震動防止細(xì)菌生長注意存放溫度現(xiàn)在是92頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用色譜柱常見毛病柱壓過高多少才算高？不同色譜柱有差異不同系統(tǒng)有差異不同溶劑有差異柱效低重復(fù)性差不出峰，回收率低現(xiàn)在是93頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用柱壓過高為什么柱壓會過高？微粒堵塞樣品中微粒流動相中微粒密封墊柱床膨脹不可逆吸附細(xì)菌生長現(xiàn)在是94頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用柱效低為什么柱效低？色譜柱被污染過濾片部分堵塞樣品、流動相或密封墊的細(xì)小顆粒造成的堵塞色譜柱內(nèi)的死體積流動相pH值及組成不合適造成固定相流失流速急劇變化造成固定相物理損壞機(jī)械震動造成固定相產(chǎn)生裂縫柱床收縮或干枯現(xiàn)在是95頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用重復(fù)性差、回收率低實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性差色譜柱被污染流動相pH值及組成不合適造成鍵合相流失樣品溶劑不同或樣品本身不穩(wěn)定回收率低，不出峰“不可逆”吸附固定相過強(qiáng)或流動相過弱非特異性吸附現(xiàn)在是96頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用色譜柱以外的因素1“柱效”問題不一定是色譜柱問題！儀器問題：連接不好造成死體積進(jìn)樣器檢測器管路、連接口保護(hù)柱在線過濾器堵塞流動相問題：色譜柱未平衡好進(jìn)樣量太大現(xiàn)在是97頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用色譜柱與儀器的連接不同公司產(chǎn)品，其接頭不同。處理不當(dāng)會造成：色譜峰展寬（死體積）使柱效下降、或滲漏解決辦法：自制相應(yīng)的轉(zhuǎn)換接頭使用通用型接頭（刃環(huán)和螺母）這種刃環(huán)在不銹鋼管上是活動的，因此可以換接不同的色譜系統(tǒng)及色譜柱?，F(xiàn)在是98頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用色譜柱以外的因素2柱壓過高的問題，不一定是色譜柱問題！系統(tǒng)反壓問題阻尼器堵塞進(jìn)樣器堵塞管路或連接口堵塞在線過濾器不干凈保護(hù)柱壓力傳感器不準(zhǔn)確流速是否錯誤？現(xiàn)在是99頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用色譜柱以外的因素3實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性差梯度實(shí)驗(yàn)時(shí)平衡時(shí)間不足溫度波動流動相組成改變樣品溶劑不同樣品穩(wěn)定性不好方法的開發(fā)不好緩沖液的pH值不合適緩沖液的緩沖能力不足現(xiàn)在是100頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用簡單的判別方法高的柱反壓是否伴隨著保留時(shí)間的變化？峰形變壞？分辨率變壞？測量色譜系統(tǒng)的譜帶展寬典型的分析系統(tǒng)應(yīng)遠(yuǎn)小于100微升如大于此數(shù)應(yīng)檢查儀器系統(tǒng)現(xiàn)在是101頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用測量色譜系統(tǒng)的譜帶展寬卸下色譜柱，用管子代替之按測柱效方法，以1/10的樣品濃度進(jìn)樣，大約2－5微升用5σ方法測4.4%峰高處的峰寬：W儀器參數(shù)：流速1.0ml/min檢測器靈敏度：0.5-1.0AUFS（用記錄儀時(shí)）檢測器時(shí)間常數(shù)：小于0.2譜帶展寬（ml）＝1000×W（min）（工作站）現(xiàn)在是102頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用設(shè)備和材料：溶劑過濾器、真空泵、0.45u或更細(xì)的水性濾膜和有機(jī)濾膜過濾的方法：用加了濾膜的溶劑過濾器和真空泵抽濾過濾的目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機(jī)鹽配制的緩沖液。必須做!

溶劑和水的前處理：過濾現(xiàn)在是103頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用脫氣的目的：使色譜泵的輸液準(zhǔn)確

輸液均勻準(zhǔn)確，且脈動減小。保留時(shí)間及色譜峰面積的重現(xiàn)性提高

提高檢測的性能

防止氣泡引起的尖峰基線穩(wěn)定，信噪比增加溶劑的紫外吸收本底降低

保護(hù)色譜柱減少死體積防止填料的氧化必須做!

溶劑和水的前處理：脫氣現(xiàn)在是104頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用流動相脫氣的方法：抽真空：同上，一般在溶劑抽濾的同時(shí)，也有脫氣的效果超聲波：簡單，但效果不理想脫氣機(jī)：可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度通氦氣：可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度加熱：簡單、如同抽真空一起使用，其效果很好但容易造成流動相組成的變化必須做!

溶劑和水的前處理：脫氣現(xiàn)在是105頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用分析結(jié)果重現(xiàn)性好提高柱效降低柱壓保證檢測穩(wěn)定性

柱溫控制的優(yōu)點(diǎn)：使用柱溫箱現(xiàn)在是106頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用高壓輸液泵1.每次使用后要把泵中的含鹽緩沖液洗干凈，防止鹽的沉積，泵要浸在無緩沖液的溶液或有機(jī)溶劑中。2.使用HPLC級的流動相試劑.3.使用不銹鋼燒結(jié)吸液濾頭.4.用純水或雙蒸蒸餾水，流量3～5ml/分，沖洗15分鐘，沖洗時(shí)必須打開排放閥（逆時(shí)針擰松）必須做!使用輸液泵的注意事項(xiàng)現(xiàn)在是107頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用高壓進(jìn)樣閥必須做!每次使用后要沖洗干凈進(jìn)樣閥中殘留的樣品和緩沖鹽.防止無機(jī)鹽沉積和樣品微粒磨損閥轉(zhuǎn)子.沖洗方法見進(jìn)樣閥說明書.嚴(yán)禁用!嚴(yán)禁使用氣相色譜那樣的尖頭針進(jìn)樣.根據(jù)情況定在注射針前加裝針式過濾器,防止樣品中的微粒進(jìn)入進(jìn)樣閥.現(xiàn)在是108頁\一共有119頁\編輯于星期六液相色譜儀的使用液相色譜柱1.流動相或溶劑的化學(xué)腐蝕性不能太強(qiáng).2.避免樣品微粒在柱頭沉積.3.防