含糊精靈芝膠囊中多糖含量的測定方法

含糊精靈芝膠囊中多糖含量的測定方法

Summary：建立了含糊精靈芝膠囊中多糖含量的測定方法。方法采用糖化酶水解糊精，醇沉后苯酚硫酸法測定多糖含量。對糖化酶的用量、酶解時(shí)間進(jìn)行考察。結(jié)果糖化酶水解糊精的最佳條件為:糖化酶用量0.5ml，反應(yīng)時(shí)間為60min。同時(shí)比較直接測定多糖含量與酶解糊精后測定多糖含量之間的差異。結(jié)果直接測定多糖含量顯著偏高。糖化酶水解法可消除糊精對靈芝膠囊中多糖測定的干擾，且方法簡便、穩(wěn)定。Keys：糖化酶，糊精，靈芝多糖，含量測定引言：靈芝(Ganodermalucidum)又稱靈芝草、神芝芝草、仙草、瑞草,是多孔菌科植物赤芝或紫藝的干燥子實(shí)體。據(jù)本草綱目記載“靈芝性平,味苦，無毒，主胸中結(jié)，益心氣，補(bǔ)中，增智慧,不忘，久服輕身不老，延年神仙”?！?〕靈芝膠囊由靈芝、白術(shù)、黃精等中藥制成的一種保健食品。靈芝多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、抗糖尿病及其并發(fā)癥、抗炎、抗菌等藥理作用。在藥用資源和保健食品添加物方面具有很大的開發(fā)利用價(jià)值?！?〕不少保健食品添加了淀粉、糊精，一定要做相應(yīng)的處理否則結(jié)果偏高。添加淀粉的樣品需加α-淀粉酶及糖化酶（如葡萄糖苷酶）處理。添加糊精的樣品需加糖化酶（如葡萄糖苷酶）處理。處理的原則是將這類非活性多糖的碳水化合物全部酶解成單糖或低聚糖，再用乙醇沉淀所需要的活性多糖已達(dá)到分離的目的。〔3〕本文通過對糖化酶的用量、酶解時(shí)間等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證手段，同時(shí)比較直接測定多糖含量與酶解糊精后測定多糖含量之間的差異，采用苯酚-硫酸法測定含糊精靈芝膠囊多糖的含量。1實(shí)驗(yàn)部分1.1儀器與設(shè)備電子天平（BSA224S-CW型；BT125D型；賽多利斯BL310型）離心機(jī)（LXJ-IIB，上海安亭科學(xué)儀器廠）漩渦震蕩器（MS3basic型，德國IKA）紫外-可見分光光度計(jì)（UV1800型，島津企業(yè)管理（中國）有限公司）超聲波清洗機(jī)（SB25-12DTD寧波新芝生物科技股份有限公司，功率500w，頻率40kHz）水浴鍋（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）1.2試劑及材料濃硫酸（分析純）；無水乙醇（分析純）；乙醇（分析純）；液體糖化酶（阿拉丁,Enzymeactivity≥100000（IU/mlORu/ml））葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1mg/ml）：取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.020g，精密稱量后加水溶解，并定容至200mL，混勻，每1mL約含0.1mg葡萄糖；苯酚溶液（50g/L）：稱取重蒸苯酚5.0g，加適量水使溶解，并定容至100ml容量瓶中，混勻，置冰箱中可保存兩個(gè)月；85%（V/V）乙醇配制：取無水乙醇85mL，加水定容至100mL，混勻；磷酸鹽緩沖液0.2M（PH6.5）：用量筒量取94.5

ml（0.2mol/L）磷酸氫二鈉和205.5

ml（0.2mol/L）磷酸二氫鈉，混合均勻，即得；0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液：精密稱取17.90g磷酸氫二鈉于150ml燒杯中，加入適量純化水?dāng)嚢枞芙夂?，轉(zhuǎn)移至250ml容量瓶中，加入純化水稀釋至刻度，搖勻，即得。0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：精密稱取7.80g磷酸二氫鈉于150ml燒杯中，加入適量純化水?dāng)嚢枞芙夂?，轉(zhuǎn)移至250

ml容量瓶中，加入純化水稀釋至刻度，搖勻，即得。硫酸溶液（2mol/L）：量取112ml濃硫酸加入800ml水中，混勻，冷卻后稀釋至1000ml；靈芝膠囊。1.3實(shí)驗(yàn)步驟1.3.1供試品溶液的制備樣品提?。喝”酒愤m量，傾出內(nèi)容物，混勻，取粉末約2g，精密稱定置150ml碘量瓶中（加玻璃珠數(shù)粒），加水約50ml，超聲處理60分鐘，取出，放冷，加磷酸鹽緩沖溶液0.5mL,加糖化酶液0.5mL，置60℃的水浴鍋中酶解60分鐘后取出，于電爐上小心加熱至沸（滅酶），冷卻后轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，洗滌三角瓶數(shù)次，補(bǔ)加水至刻度，搖勻后過濾，棄去初濾液，收集余下濾液供沉淀粗多糖。沉淀多糖：精確吸取續(xù)濾液5.0ml，加乙醇40ml，輕輕搖勻，常溫放置過夜,置于離心機(jī)中離心（4000rmp）10分鐘，把上清液去掉,用5ml85%乙醇洗滌離心管中的沉淀物,再次離心并把上清液棄去，重復(fù)洗滌操作一次。沉淀以2mol/L的硫酸5mL溶解，轉(zhuǎn)移到50mL的容量瓶中,以水定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。隨行空白的開展：用水取代試樣外，均按上述供試品溶液的制備步驟得到樣品空白溶液。1.3.2供試品溶液的測定：準(zhǔn)確量取供試品溶液2.0mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作步驟于485nm處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得多糖濃度。2結(jié)果與討論2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及線性關(guān)系的考察精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0ml，分別置于25ml的比色管中，精確補(bǔ)水至2.0ml，加入50g/L的苯酚溶液1.0ml，在旋轉(zhuǎn)混勻器上混勻，小心加入濃硫酸10.0ml，與旋轉(zhuǎn)混勻器上小心混勻，置沸水浴中煮沸15min，冷卻后用分光光度計(jì)在波長485nm處以試劑空白溶液為參比，1cm比色皿測定吸光光度值。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定結(jié)果見表1，線性回歸方程如圖1所示。表-1：粗多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)吸取標(biāo)準(zhǔn)品體積（ml）多糖含量（mg）吸光度A000.0000.40.03740.1140.80.07720.2311.20.11620.3461.60.15500.4602.00.20120.596注：D-無水葡萄糖對照品使用液濃度=0.1001mg/ml圖-1：線性圖注：Y軸為吸光度；X軸為多糖含量。由表-1及圖-1可知，葡萄糖含量在0.00mg～0.20mg之間，線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=2.9492X+0.0040，R2=0.99922.2糖化酶添加量對多糖結(jié)果的影響取同一批次樣品，按1.3.1供試品溶液制備方法，分別吸取液體糖化酶約0.2ml、0.5ml、1.0ml各3平行，其余步驟按1.3.2供試品溶液的定方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。表-2

糖化酶添加量的考察糖化酶添加量（ml）取樣量

(g)吸光度A

（Abs）多糖含量（g/100g）平均值

（g/100g）RSD

(%)0.22.00510.6775.765.802.772.03440.7125.972.01630.6685.660.52.02670.4183.533.611.232.00590.4263.632.01590.4323.671.02.05670.4423.683.812.402.01090.4653.962.00900.4453.79從表2看出，當(dāng)糖化酶添加量為0.2ml時(shí)，樣品中添加的糊精（這類非活性多糖的碳水化合物）沒有全部酶解成單糖或低聚糖，造成多糖結(jié)果偏高。當(dāng)糖化酶添加量為0.5ml或1.0ml時(shí)，測試結(jié)果接近，證明糊精已全部水解。從節(jié)省成本角度考慮，實(shí)驗(yàn)選擇糖化酶添加量為0.5ml。（注：隨行空白吸光度為0,樣品添加糊精量約25%）2.3酶解時(shí)間的考察取同一批次樣品，按1.3.1供試品溶液制備方法，酶解時(shí)間分別為：30min、60min、90min各3平行，其余步驟按1.3.2供試品溶液的定方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。表-3酶解時(shí)間的考察酶解時(shí)間（min）取樣量

(g)吸光度A

（Abs）多糖含量（g/100g）平均值

（g/100g）RSD

(%)302.05340.4853.903.833.422.01880.4763.902.04290.4543.67602.02930.4353.543.581.052.03330.4403.582.02420.4433.62902.01800.4223.463.513.672.04790.4533.662.04800.4233.42從表3看出，當(dāng)酶解時(shí)間為60min和90min時(shí)，多糖含量變化無顯著性差異，故本實(shí)驗(yàn)選擇酶解時(shí)間為60min。2.4直接測定與糖化酶水解后測定多糖含量的結(jié)果比對取同一批次樣品，按1.3.1供試品溶液的制備方法，糖化酶添加量分別0ml、0.5ml，制得供試品溶液，其余步驟按1.3.2供試品溶液的定方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。表-4直接測定與糖化酶水解后測定對多糖結(jié)果的影響檢測方法取樣量

(g)吸光度A

（Abs）多糖含量（g/100g）平均值

（g/100g）RSD

(%)直接測定2.03571.28010.6910.932.552.00751.28210.862.01551.33211.24糖化酶水解測定2.01860.4203.563.581.132.02640.4293.622.00290.4153.55從表4看出，直接測定含糊精樣品所得的結(jié)果顯著偏高，經(jīng)糖化酶水解后所測定樣品多糖含量降低。進(jìn)一步證明糖化酶水解法可消除糊精對靈芝膠囊中多糖測定的干擾。2.4精密度試驗(yàn)2.4.1重復(fù)性試驗(yàn)取同一批次樣品，同一操作人員，同一天，取六份平行樣品，按1.3.1供試品溶液制備方法和1.3.2供試品溶液的定方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如表5所示。表-5重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果多糖含量（g/100g）平均值

(g/100g）RSD(%)3.563.623.553.603.603.633.590.93結(jié)果表明,6個(gè)平行樣品重復(fù)測定結(jié)果RSD為0。93%，小于3.0%，重復(fù)性良好，符合《中國藥典》2020版四部9101藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則要求。2.4.2中間精密度試驗(yàn)取同一批次樣品，由兩位檢測人員進(jìn)行平行性實(shí)驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)如下表-6表-6中間精密度試驗(yàn)結(jié)果人員多糖含量（g/100g）平均值（g/100g）RSD

(%)13.563.623.553.603.603.633.590.9323.583.633.573.573.663.693.621.38結(jié)果表明，不同人員檢測結(jié)果平均值分別為3.59g/100g、3.62g/100g，相對平均偏差為0.42%，不同人員比對，多糖檢測結(jié)果接近。3結(jié)語通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，建立了含糊精靈芝膠囊的多糖檢測方法。結(jié)果表明，糖化酶水解糊精的最佳條件為:糖化酶用量0.5ml，反應(yīng)時(shí)間為60min。同時(shí)比較直接測定多糖含量與酶解糊精后測定多糖含量之間的差