復(fù)方青錢柳鉻粉的安全性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究

復(fù)方青錢柳鉻粉的安全性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究

Summary：目的在于觀察復(fù)方青錢柳鉻粉的安全性。方法按《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版)之毒理學(xué)檢驗(yàn)方法，進(jìn)行小鼠急性毒性試驗(yàn)、Ames實(shí)驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)及大鼠30d喂養(yǎng)試驗(yàn)。結(jié)果復(fù)方青錢柳鉻粉對雌雄小鼠急性經(jīng)口的最大耐受劑量MTD均大于10.0g/kg·bw，屬實(shí)際無毒級。Ames實(shí)驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。大鼠30d喂養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果，各個劑量組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)與對照組比較均無顯著性差異。結(jié)果顯示復(fù)方青錢柳鉻粉屬實(shí)際無毒級，安全性較高。Keys：青錢柳葉；葛根；鉻；毒理；安全性SafetyandToxicologicalStudyonCompoundpowderofCyclocaryapaliurusandchromiumAbstract:TostudythesafetyofcompoundpowderofC.paliurusandchromium,theacutetoxicitytest,Amestest,bonemarrowcellmicronucleustestonmiceandthe30-dayfeedingtestonratswerecarriedoutaccordingtothetoxicologicaltestmethodofTechnicalStandardsforTesting&AssessmentofHealthFood(2003).Asaconsequence,themaximumtolerateddose(MTD)ofcompoundpowderofC.paliurusandchromiumtobothmaleandfemalemicewasgreaterthan10.0g/kg·bw,whichwasnon-toxic.Besides,theresultsofAmestestandbonemarrowcellmicronucleustestwerenegative,andnosignificantdifferencewasobservedineachdosegroupcomparedwiththecontrolgroupinthe30-dayfeedingtest.Altogether,ourdatasuggeststhatthecompoundpowderofC.paliurusandchromiumwasactuallynon-toxicandhadhighsafety.Keywords:Cyclocaryapaliurusleaves;Puerarialobataroots;chromium;toxicological;safety青錢柳系雙子葉植物綱(Dicotyledoneae)胡桃科(Juglandaceae)青錢柳屬（CyclocaryaIljinsk.）的單一屬種植物，其拉丁文命名為Cyclocaryapaliurus(Batal.)Iljinsk，[1]。青錢柳被稱為植物界的大熊貓，是冰川世紀(jì)的孑遺樹種[2]，是中國特有的單種屬植物，屬于國家二級保護(hù)樹種，被譽(yù)為醫(yī)學(xué)界的第三棵樹[3]。青錢柳葉片常被用于清熱消腫、生津止渴，老百姓亦習(xí)慣把其當(dāng)茶飲[4]，被譽(yù)為降糖神茶。據(jù)《全國中草藥名鑒》記載：“青錢柳樹葉、樹皮及其根，能殺蟲止癢，有消炎、止痛、祛風(fēng)之功效”［5］?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明，青錢柳具有有降血糖、降血壓、降血脂等多種藥理方面的作用[6-7]，其化學(xué)成分含量豐富，目前已分離獲得的成分有鞣質(zhì)、逆沒食子酸、黃酮及其苷類、多糖類、三萜及其苷類、酚酸類和無機(jī)元素類等[5]。葛根系豆科植物(Leguminosae)野葛（PuerariaLlohbata(Willd)Ohwi）的干燥塊根[1]，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載其性味甘、辛、涼，入脾、胃經(jīng)；具發(fā)表解肌、升陽透疹、清熱生津、止瀉等功效[8]。科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)葛根的主要功效成分有葛根素、葛根黃酮、皂苷類等[9]。藥理研究表明，葛根素可降低心肌耗氧量、改善局部微循環(huán)障礙，降低血糖，還可提高視覺功能等[10]。隨著葛根功能因子不斷被人們所研究和發(fā)現(xiàn)，葛根的保健作用也日益被人們所認(rèn)識。鉻是人體必需的微量營養(yǎng)元素之一，是人體內(nèi)葡萄糖耐量因子（glucosetolerancefactor，GTF）的重要組成成分。在有機(jī)鉻制劑中，富鉻酵母具有生物活性高、毒性小、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，在作為預(yù)防和治療糖尿病藥物的重要功效成分方面受到了人們重視。富鉻酵母中含有生物活性較高的有機(jī)鉻，能改善生物體內(nèi)的糖代謝和脂肪代謝，有效降低糖尿病人的血糖和血脂[11]。本文以青錢柳葉、葛根浸提浸膏干粉和富鉻酵母混合，得到復(fù)方青錢柳鉻粉。本研究以復(fù)方青錢柳鉻粉為試驗(yàn)材料,依據(jù)保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范(2003年版)之毒理學(xué)檢驗(yàn)方法，對其進(jìn)行安全性試驗(yàn)評價(jià)。1材料1.1受試物實(shí)驗(yàn)室自制的復(fù)方青錢柳鉻粉，批號ZH201902。1.2制備工藝以等比例青錢柳葉、葛根混合浸泡提取，用90℃熱水，浸提2次，每次2h，合并濾液、過濾、干燥，得浸膏干粉。干膏粉得率為12.83%。94份干膏粉加6份富鉻酵母混合均勻，得受試物復(fù)方青錢柳鉻粉。1.3試驗(yàn)動物及環(huán)境清潔級昆明種小鼠70只，雌雄各半，體重19～22g；Wistar大鼠40只，雌雄各半，體重70～80g。試驗(yàn)用動物購自廈門萬泰滄海生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)動物室溫度為22-25攝氏度，相對濕度為60％-75％。1.4實(shí)驗(yàn)菌株鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102，由復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院提供1.5試驗(yàn)主要儀器及試劑S-9來源于MolecularToxicology,Inc.；顯微鏡、電子分析天平、全自動五分類血細(xì)胞分析儀、全自動生化分析儀、lmL注射器等。2方法2.1安全性試驗(yàn)方法小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)動物禁食（不禁水）16h后，體重19～22g的雌、雄小鼠各10只。采用最大耐受劑量（maximumtolerateddose，MTD）法將受試樣品以10.0g/kgBW劑量對實(shí)驗(yàn)動物經(jīng)口灌胃染毒。染毒后，觀察動物的一般狀態(tài)、體重變化、中毒癥狀和死亡情況等。實(shí)驗(yàn)?zāi)┰俅螌游锓Q重。對死亡動物及到期處死動物進(jìn)行尸體解剖，肉眼觀察大體病理改變情況。Ames實(shí)驗(yàn)按《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》2003年版，采用標(biāo)準(zhǔn)平板摻入法，選鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102進(jìn)行試驗(yàn)。陽性物為2,4,7-三硝基芴銅，甲基磺酸甲酯，2-氨基芴，1,8-二羥基蒽醌(TA102)，同時設(shè)陰性對照組(未處理對照組和溶劑對照組)。在加與不加S-9混合液的情況下以5000、1000、200、40和8μg/皿劑量進(jìn)行試驗(yàn)，每個劑量組做3個平皿。如果受試樣品組的回變菌落數(shù)是陰性對照組回變菌落數(shù)2倍以上，并具有劑量-反應(yīng)關(guān)系則為陽性。整個試驗(yàn)在相同條件下重復(fù)做一次。小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)小鼠50只，隨機(jī)分為5個組，每組10只，雌雄各半。設(shè)1.05、2.10、4.20g/kg·bw3個劑量組、陰性對照組（無菌水）、陽性對照組（環(huán)磷酰胺，40mg/kg·bw腹腔注射）。采用30h給受試物法。兩次給受試樣品間隔24h，第二次給受試樣品后6h處死動物，取胸骨常規(guī)制片、鏡檢，每鼠計(jì)數(shù)1000個骨髓嗜多染紅細(xì)胞（PCE），觀察含微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)并計(jì)算微核發(fā)生率，以千分率計(jì)。大鼠30d喂養(yǎng)試驗(yàn)大鼠隨機(jī)分1.05、2.10、4.20g/kg·bw低、中、高劑量組和空白對照組，每組10只，雌、雄各半，連續(xù)喂養(yǎng)30d。每天觀察并記錄動物的一般表現(xiàn)、行為、中毒癥狀和死亡情況，實(shí)驗(yàn)開始及實(shí)驗(yàn)后每周稱量1次動物體重，每周2次記錄飼料攝入量，計(jì)算每周及總的食物利用率。實(shí)驗(yàn)期末禁食16h，眼球取血，斷頭處死，對每只大鼠進(jìn)行臟器大體觀察，取肝、腎、脾、睪丸稱重并計(jì)算臟體比，同時進(jìn)行血象、血生化檢查，留取肝、腎、脾、胃、腸、睪丸、卵巢進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。2.2數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

用SPSS軟件進(jìn)行T檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)。3試驗(yàn)結(jié)果3.1急性毒性試驗(yàn)結(jié)果在試驗(yàn)期間各組小鼠活動正常，毛色光澤度好，未見任何中毒癥狀和死亡，到期處死動物，大體解剖肉眼觀察各臟器情況，未見異常。雄性小鼠：MTD＞10.0g/kgBW，雌性小鼠：MTD＞10.0g/kgBW，見表1。表1.雌雄小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果組別劑量（g/kg）動物（只）死亡數(shù)（只）死亡率（%）MTD（g/kg）雌性10.01000＞10.0雄性10.01000＞10.03.2Ames試驗(yàn)結(jié)果由表2、表3可見，復(fù)方青錢柳鉻粉各劑量組回變菌落數(shù)均未超過陰性對照組回變菌落數(shù)的2倍，亦無劑量-反應(yīng)關(guān)系。即復(fù)方青錢柳鉻粉對鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102四株試驗(yàn)菌株，在加與不加S-9時，均未見有致基因突變作用。表2復(fù)方青錢柳鉻粉Ames試驗(yàn)回變菌落數(shù)(±s)（第一次）組別劑量回變菌落數(shù)μg/皿+S-9-S-9TA97TA98TA100TA102TA97TA98TA100TA102自發(fā)回變0114±1535±5142±14287±16112±2037±6143±15280±20無菌水0.1mL111±1137±5165±18259±19120±1034±5148±15291±10復(fù)方青錢柳鉻粉8113±1837±5172±19272±19109±1434±4151±16268±2740112±1235±4169±13255±16120±1536±7172±23279±23200126±1437±5160±13283±15128±1334±5178±11260±221000108±1234±4161±12284±14108±1835±5161±21270±255000121±1035±5159±12265±29107±1537±6183±15282±162-氨基芴101146±98**3342±240**2721±136**1,8-二羥基蒽醌501213±155**2,4,7-三硝基芴銅0.22724±117**2449±130**甲基磺酸甲酯1.0μL2763±179**3257±121**注：**超過陰性對照組菌落數(shù)2倍以上表3

復(fù)方青錢柳鉻粉Ames試驗(yàn)回變菌落數(shù)(±s)（第二次）組別劑量回變菌落數(shù)μg/皿+S-9-S-9TA97TA98TA100TA102TA97TA98TA100TA102自發(fā)回變0110±1137±4168±13284±25120±1836±6162±26289±21無菌水0.1mL119±1437±5170±25269±20113±1536±5155±26269±27復(fù)方青錢柳鉻粉8115±1834±5172±14271±23117±1236±5169±26271±1740115±1738±6172±17263±11116±937±6162±15279±20200121±934±7166±17284±17117±1235±8164±26261±151000122±1934±6166±25265±27119±1235±5165±25288±235000115±935±4169±14283±20126±1335±4164±14258±192-氨基芴101193±108**3473±287**2808±149**1,8-二羥基蒽醌501266±105**2,4,7-三硝基芴銅0.22738±133**2470±176**甲基磺酸甲酯1.0μL2687±158**3318±130**注：**超過陰性對照組菌落數(shù)2倍以上3.3小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)由表4可見，復(fù)方青錢柳鉻粉的各劑量組微核率與陰性對照組比較無顯著性差異（P>0.05），而陽性對照組高于陰性對照組，有顯著性差異（P<0.01）。表4

復(fù)方青錢柳鉻粉對小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率的影響性別劑量(mg/kg·bw)動物數(shù)PCE數(shù)含微核的PCE數(shù)微核率(‰,±s)雌05500071.4±0.910505500051.0±0.721005500081.6±0.942005500071.4±0.440mg/kg（環(huán)磷酰胺）5500010020.0±3.5**雄05500051.0±1.110505500061.2±1.321005500071.4±1.242005500071.4±0.540mg/kg（環(huán)磷酰胺）5500010521.0±4.3**注：**與陰性對照組比較，P<0.01。3.430天喂養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果以1.05g/kg·bw/d、2.10g/kg·bw/d、4.20g/kg·bw/d三個劑量給予大鼠30天，受試動物一般情況良好。與對照組相比，雌、雄大鼠各劑量組每周體重、增重、攝食量、食物利用率和總增重、總攝入量、總食物利用率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；各實(shí)驗(yàn)組大鼠在試驗(yàn)的各項(xiàng)血常規(guī)指標(biāo)及血清生化指標(biāo)均在正常范圍,且與對照組值的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；各實(shí)驗(yàn)組大鼠臟器重和臟體比與對照組比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對肝臟、腎臟、脾臟、胃、十二指腸、睪丸和卵巢等臟器的組織病理切片檢查結(jié)果也未見異常。根據(jù)衛(wèi)生部《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003年版）之30天喂養(yǎng)試驗(yàn)，最高給予5.00g/kg·bw/d的復(fù)方青錢柳鉻粉，未觀察到有害作用。4討論與結(jié)論本研究結(jié)果顯示，復(fù)方青錢柳鉻粉對雌雄小鼠急性經(jīng)口的最大耐受劑量（MTD）均大于10.0g/kg·bw，屬實(shí)際無毒級。Ames實(shí)驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)均為陰性結(jié)果。經(jīng)口給予大鼠不同劑量的復(fù)方青錢柳鉻粉連續(xù)30d,與空白對照組比較，低、中、高各實(shí)驗(yàn)組大鼠無明顯差異。結(jié)果顯示該復(fù)方青錢柳鉻粉屬實(shí)際無毒級，安全性較高的一種復(fù)配方。Reference：[1]中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志(第21卷)[M].北京:科學(xué)出版社,1979:19.[2]中國藥材公司.中國中藥資源志要[M]．北京：科學(xué)出版社，1994．[3]李善斌,鄒健,趙晶等.青錢柳生物活性物質(zhì)研究進(jìn)展