醫(yī)學分子生物學技術

醫(yī)學分子生物學實驗技術4/24/20231編輯ppt第一章蛋白質(zhì)的分離與純化第一節(jié)蛋白質(zhì)分離純化的一般原則一、蛋白質(zhì)分離純化技術及其依據(jù)表1－1主要的蛋白質(zhì)分離純化方法及依據(jù)

性質(zhì)分離方法分子大小與形狀超濾、透析、密度梯度離心、凝膠過濾層析、凝膠電泳溶解度沉淀法、相分配法、分配層析、結(jié)晶、溶劑抽提、逆流分配電荷分布電泳技術、等電點沉淀、離子交換層析、聚焦層析、等電聚倍數(shù)電泳生物功能專一性親和層析疏水性疏水作用層析、反相高效液相層析4/24/20232編輯ppt第一章蛋白質(zhì)的分離與純化二、蛋白質(zhì)純化的一般設計原則1、目的蛋白的分離和純化應該盡可能選擇來源方便、成本低、易操作的組織或細胞作為原料；2、要建立一個特異、快速、可重復、經(jīng)濟的目的蛋白活性檢測方法；3、蛋白質(zhì)分離純化工藝的設計應該分級分離、先粗后細的原則；4、純化條件要盡可能溫和。4/24/20233編輯ppt第一章蛋白質(zhì)的分離與純化第二節(jié)蛋白質(zhì)的層析(chromatography)分離一、層析技術的發(fā)展簡史及科學意義二、層析技術的基本原理固定相：在層析系統(tǒng)分離過程中靜止不動的相。流動相：在層析系統(tǒng)分離過程中在載體上延一定方向移動的相。4/24/20234編輯ppt4/24/20235編輯ppt4/24/20236編輯ppt塔板理論：K＝＝(溶質(zhì)在固定相中的濃度)Cs(溶質(zhì)在流動相中的濃度)Cm把色譜柱比作一個精餾塔，沿用精餾塔中塔板的概念來描述組分在兩相間的分配行為，同時引入理論塔板數(shù)作為衡量柱效率的指標，即色譜柱是由一系列連續(xù)的、相等的水平塔板組成。每一塊塔板的高度用H表示，稱為塔板高度，簡稱板高。

4/24/20237編輯ppt塔板理論假設：1.在柱內(nèi)一小段長度H內(nèi)，組分可以在兩相間迅速達到平衡。這一小段柱長稱為理論塔板高度H。2.以氣相色譜為例，載氣進入色譜柱不是連續(xù)進行的，而是脈動式，每次進氣為一個塔板體積（ΔVm）。3.所有組分開始時存在于第0號塔板上，而且試樣沿軸（縱）向擴散可忽略。4.分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)，與組分在某一塔板上的量無關。4/24/20238編輯ppt

簡單地認為：在每一塊塔板上，溶質(zhì)在兩相間很快達到分配平衡，然后隨著流動相按一個一個塔板的方式向前移動。對于一根長為L的色譜柱，溶質(zhì)平衡的次數(shù)應為：n=L/H

n稱為理論塔板數(shù)。與精餾塔一樣，色譜柱的柱效隨理論塔板數(shù)n的增加而增加，隨板高H的增大而減小。4/24/20239編輯ppt4/24/202310編輯ppt4/24/202311編輯ppt4/24/202312編輯ppt洗脫法也稱沖洗法。工作時，首先將樣品加到色譜柱頭上，然后用吸附或溶解能力比試樣組分弱得多的氣體或液體作沖洗劑。由于各組分在固定相上的吸附或溶解能力不同，被沖洗劑帶出的先后次序也不同，從而使組分彼此分離。流出曲線下圖。層析的展開方式4/24/202313編輯ppt頂替法是將樣品加到色譜柱頭后，在惰性流動相中加入對固定相的吸附或溶解能力比所有試樣組分強的物質(zhì)為頂替劑（或直接用頂替劑作流動相），通過色譜柱，將各組分按吸附或溶解能力的強弱順序，依次頂替出固定相。很明顯，吸附或溶解能力最弱的組分最先流出，最強的最后流出。頂替法的流出曲線如下圖。4/24/202314編輯ppt4/24/202315編輯ppt迎頭法是將試樣混合物連續(xù)通過色譜柱，吸附或溶解能力最弱的組分首先一純物質(zhì)的狀態(tài)流出，其次則以第一組分和吸附或溶解能力較弱的第二組分混合物，以此類推。流出曲線如下圖。A+BA4/24/202316編輯ppt層析流出曲線及相關術語色譜流出曲線和色譜峰由檢測器輸出的電信號強度對時間作圖，所得曲線稱為色譜流出曲線。曲線上突起部分就是色譜峰。如果進樣量很小，濃度很低，在吸附等溫線（氣固吸附色譜）或分配等溫線（氣液分配色譜）的線性范圍內(nèi)，則色譜峰是對稱的。4/24/202317編輯ppt基線在實驗操作條件下，色譜柱后沒有樣品組分流出時的流出曲線稱為基線，穩(wěn)定的基線應該是一條水平直線。峰高色譜峰頂點與基線之間的垂直距離，以（h）表示。4/24/202318編輯ppt色譜流出曲線色譜流出曲線和色譜峰基線（a）峰高（h）信號進樣空氣峰色譜峰ha4/24/202319編輯ppt保留值

死時間t0

不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)進入色譜柱時，從進樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時間稱為死時間，它正比于色譜柱的空隙體積，如下圖。信號進樣t0因為這種物質(zhì)不被固定相吸附或溶解，故其流動速度將與流動相流動速度相近。測定流動相平均線速ū時，可用柱長L與t0的比值計算，即ū=L/t04/24/202320編輯ppt信號進樣tr2.保留時間tr試樣從進樣到柱后出現(xiàn)峰極大點時所經(jīng)過的時間，稱為保留時間，如下圖。4/24/202321編輯ppt3.調(diào)整保留時間tr′某組分的保留時間扣除死時間后，稱為該組分的調(diào)整保留時間，即

tr′=tr

t0由于組分在色譜柱中的保留時間tr包含了組分隨流動相通過柱子所須的時間和組分在固定相中滯留所須的時間，所以tr實際上是組分在固定相中保留的總時間。保留時間是色譜法定性的基本依據(jù)，但同一組分的保留時間常受到流動相流速的影響，因此色譜工作者有時用保留體積來表示保留值。4/24/202322編輯ppt4.死體積V0

指色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測器的空間的總和。當后兩相很小可忽略不計時，死體積可由死時間與色譜柱出口的載氣流速Fco（cm3·min-1）計算。

V0=t0Fco式中Fco為扣除飽和水蒸氣壓并經(jīng)溫度校正的流速。僅適用于氣相色譜，不適用于液相色譜。4/24/202323編輯ppt5.保留體積Vr指從進樣開始到被測組分在柱后出現(xiàn)濃度極大點時所通過的流動相的體積。保留時間與保留體積關系：

Vr=trFco6.調(diào)整保留體積Vr

某組分的保留體積扣除死體積后，稱為該組分的調(diào)整保留體積。

Vr=Vr

V0=trFco

4/24/202324編輯ppt7.相對保留值r2,1某組分2的調(diào)整保留值與組分1的調(diào)整保留值之比，稱為相對保留值。

r2,1=tr2/tr1′=Vr2/Vr1

由于相對保留值只與柱溫及固定相性質(zhì)有關，而與柱徑、柱長、填充情況及流動相流速無關，因此，它在色譜法中，特別是在氣相色譜法中，廣泛用作定性的依據(jù)。4/24/202325編輯ppt在定性分析中，通常固定一個色譜峰作為標準（s），然后再求其它峰（i）對這個峰的相對保留值，此時可用符號表示，即

=tr(i)/tr(s)式中tr(i)為后出峰的調(diào)整保留時間，所以總是大于1的。相對保留值往往可作為衡量固定相選擇性的指標，又稱選擇因子。區(qū)域?qū)挾壬V峰的區(qū)域?qū)挾仁巧V流出曲線的重要參數(shù)之一，用于衡量柱效率及反映色譜操作條件的動力學因素。表示色譜峰區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ腥N方法。4/24/202326編輯ppt1.標準偏差

即0.607倍峰高處色譜峰寬的一半。2.半峰寬W1/2

即峰高一半處對應的峰寬。它與標準偏差的關系為W1/2=2.3543.峰底寬度W

即色譜峰兩側(cè)拐點上的切線在基線上截距間的距離。它與標準偏差的關系是W=44/24/202327編輯ppt4/24/202328編輯ppt從色譜流出曲線中，可得許多重要信息：(i)根據(jù)色譜峰的個數(shù)，可以判斷樣品中所含組分的最少個數(shù)；(ii)根據(jù)色譜峰的保留值，可以進行定性分析；(iii)根據(jù)色譜峰的面積或峰高，可以進行定量分析；(iv)色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾龋窃u價色譜柱分離效能的依據(jù)；(v)色譜峰兩峰間的距離，是評價固定相（或流動相）選擇是否合適的依據(jù)。4/24/202329編輯ppt三、離子交換層析離子交換層析(ionexchangechromatography)利用物質(zhì)的電荷與層析載體(離子交換劑)電荷之間的相互作用達到分離純化的目的的層析方法稱離子交換層析。離子交換劑：離子交換層析所用的固相基質(zhì)，由不溶于水的、具有網(wǎng)狀結(jié)構的高分子聚合物組成。4/24/202330編輯ppt4/24/202331編輯ppt離子交換層析的操作1、樣品的準備：固體樣品必須溶于適當離子強度和pH的緩沖液中。組織液或細胞裂解液用緩沖液稀釋后可直接上柱。鹽析樣品必須除鹽后才能進行分離。2、離子交換劑的處理：根據(jù)被分離樣品的性質(zhì)選擇合適的離子交換劑，離子交換劑在使用前須先進行處理。4/24/202332編輯ppt3、層析柱的準備：離子交換層析柱一般選擇粗短柱為宜，使得樣品在分離的同時進行濃縮。離子交換劑的用量根據(jù)樣品量和交換劑的交換容量確定。4、樣品分離：上樣量的多少與目的蛋白的性質(zhì)、濃度及交換劑的親和力有關。在分離過程中，應注意4/24/202333編輯ppt1）樣品的濃度不宜過大2）溶解蛋白質(zhì)樣品的緩沖液的離子強度要低于起始緩沖液3）上樣速度不要過快4）上樣緩沖液的pH應合適5、洗脫4/24/202334編輯ppt6、洗脫液的鑒定和回收7、離子交換劑的再生與儲存4/24/202335編輯ppt4/24/202336編輯ppt兔γ－球蛋白的木瓜蛋白酶水解物在CM纖維素柱上的層析分離4/24/202337編輯ppt天花粉各成分用特種離子交換劑層析分離4/24/202338編輯ppt4/24/202339編輯ppt4/24/202340編輯ppt二、分子篩原理4/24/202341編輯ppt4/24/202342編輯ppt4/24/202343編輯ppt凝膠過濾的分配系數(shù)K=(Ve-V0)(Vi)4/24/202344編輯ppt主要凝膠過濾介質(zhì)的牌號及骨架結(jié)構4/24/202345編輯ppt葡聚糖凝膠(G)型號分離范圍(分子量)吸水量(克／克干凝膠)膨脹體積(毫升／克干凝膠)浸泡時間蛋白質(zhì)多糖20～25℃90~100℃10<700<7001.02-33115<1500<15001.52.5-3.531251000-5000100-50002.54-631501500-30000500-100005.09-1131753000-700001000-500007.512-152431004000-1500001000-1000001015-207251505000-4000001000-1500001520-307252005000-8000001000-2000002030-407254/24/202346編輯ppt親和層析：利用生物分子間特殊的親和關系進行的分離方法。是蛋白質(zhì)分離純化的最有效的方法之一，有時甚至可以僅用一步純化即可達到純化目的。只要被分離蛋白、配基和載體之間能形成以下的關系，即可進行親和層析4/24/202347編輯ppt4/24/202348編輯ppt基本原理：親和層析法利用了生命現(xiàn)象中生物分子之間非常特異的相互作用而進行分離純化的方法。生物體內(nèi)能發(fā)生特異的相互作用的成分有：酶與酶的底物酶與酶的抑制劑酶與酶的變構效應劑酶與酶的輔酶激素與細胞膜上的受體維生素與結(jié)合蛋白核酸抗原與抗體外源凝集素與紅細胞表面的抗原4/24/202349編輯ppt特異性強分辨率高回收率高層析柱的再生方便親和層析特點特別適用于微量生物活性物質(zhì)的分離4/24/202350編輯ppt電泳

是指帶電粒子在電場中向與其自身帶相反電荷的電極移動的現(xiàn)象

正極負極帶負電粒子帶正電粒子蛋白質(zhì)的電泳分離4/24/202351編輯ppt++++++++--------++++++++--------蛋白質(zhì)膠體顆粒的沉淀

帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負電荷的蛋白質(zhì)在等電點的蛋白質(zhì)酸酸堿堿脫水脫水脫水不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒（沉淀）帶正電荷的蛋白質(zhì)（疏水膠體）帶負電荷的蛋白質(zhì)（疏水膠體）堿酸（親水膠體）（親水膠體）（親水膠體）4/24/202352編輯ppt帶電顆粒在電場中所受到的電場力F=EQ根據(jù)Stoke定律，球形分子在液體中泳動所受到的阻力F’=6πrηv電泳原理：4/24/202353編輯pptF=F’即：EQ=6πrηv時，V=EQ6πrη當物質(zhì)在電場中移動時，受到電場力和液體阻力兩方面的力的影響，當電場力和阻力平衡時，帶電顆粒作勻速運動，4/24/202354編輯ppt兩個帶電顆粒能否分開，由兩個顆粒在電泳過程中的遷移率所決定，即U=dlVt或d=UVtldU==VEtVl=dlVt或d1-d2=(U1-U2)VtlΔd=4/24/202355編輯ppt遷移率（或泳動度）是指帶電顆粒在單位電場強度下泳動的速度，可用下列公式計算：

Ｕ=υ/E=(d/t)/(V/l)=dl/Vt

Ｕ為遷移率（cm2·V-1·min-1）；υ為顆粒泳動速度（cm·s-1）；E為電場強度（V·cm-1）；d為顆粒泳動的距離（cm）；l為濾紙有效長度（cm）；V為實際電壓（V）；t為通電時間（s或min）。通過測量d,l,V,t,即可計算出被分離物質(zhì)的遷移率。

4/24/202356編輯ppt影響電泳的因素1、帶電粒子的性質(zhì)與電泳行為2、電場強度對帶電粒子遷移的影響：電場強度也稱電位梯度，是指單位長度（每一厘米）支持物體上的電位降，它對泳動速度起著十分重要的作用。一般，電場強度越高，帶電顆粒移動速度越快。4/24/202357編輯ppt3、溶液的pH對帶電粒子遷移的影響：溶液的pH值決定了帶電顆粒解離的程度，也決定了物質(zhì)所帶凈電荷的多少。4、電滲對電泳的影響：電滲是在電場中液體對固體的相對移動。4/24/202358編輯ppt電滲作用4/24/202359編輯ppt5、離子強度對電泳的影響：電泳液中的離子增加會使電泳遷移率降低，原因是帶電的離子會吸引相反符號的離子聚集在其周圍，形成一個與運動粒子符號相反的離子氛，它使該離子向相反的方向運動，從而降低了該粒子的遷移率。4/24/202360編輯ppt6、溫度對的電泳的影響：電泳過程中由于通電產(chǎn)生焦耳熱，熱對電泳有很大的影響。溫度每升高1℃，遷移率約增加2.4%。為降低熱效應對電泳的影響，可控制電壓或電流，或在電泳系統(tǒng)中安裝冷卻散熱裝置。4/24/202361編輯ppt電泳的分類和特點電泳的分類自由移動界面電泳區(qū)帶電泳穩(wěn)態(tài)電泳4/24/202362編輯ppt自由移動界面電泳（movingboundaryelectrophoresis），沒有支持物，在一個U形管中進行電泳，目前已被區(qū)帶電泳所取代。區(qū)帶電泳（zoneelectrophoresis）在一定的支持物上進行的電泳，電泳結(jié)果形成一條條的區(qū)帶而得名。穩(wěn)態(tài)電泳（steadystateelectrophoresis）帶電顆粒電泳一定時間后達到穩(wěn)態(tài)而停止移動。4/24/202363編輯ppt4/24/202364編輯ppt聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺Acr和交聯(lián)劑N,N’-甲叉雙丙烯酰胺Bis聚合而成4/24/202365編輯ppt4/24/202366編輯ppt聚合過程需要有催化劑參加，有兩種聚合方式，化學聚合和光聚合。催化劑包括引發(fā)劑和加速劑兩部分組成?；瘜W聚合反應的引發(fā)劑常為過硫酸銨，過硫酸銨首先形成自由基，通過自由基傳遞，使丙烯酰胺成為自由基，發(fā)動聚合反應。加速劑四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）可加快引發(fā)劑釋放自由基的速度；光學聚合反應的引發(fā)劑為核黃素。4/24/202367編輯ppt聚丙烯凝膠的特點①在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好；②化學性能穩(wěn)定，與被分離物不發(fā)生化學反應；③對pH和溫度變化較穩(wěn)定；④幾乎無電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復性極好。⑤樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達10-6g。⑥凝膠孔徑可通過選擇單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)。⑦分辯率高，尤其在不邊疆凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應為一體。4/24/202368編輯ppt凝膠孔徑及其有關性質(zhì)①凝膠性能與總濃度及交聯(lián)度的關系凝膠的孔徑、機械性能、彈性、透明度、黏度和聚合程度取決于凝膠總濃度和Acr與Bis之比。T（Acr和Bis總濃度）%=×100%a+bmc（交聯(lián)劑百分比）%=×100%ba+b4/24/202369編輯ppta/b與凝膠的機械性能密切相關。當（a/b）<10時，凝膠脆而易碎，堅硬呈乳白色；（a/b）>100時，即使5%的凝膠也呈糊狀，易于斷裂。欲制備完全透明而又有彈性的凝膠，應控制（a/b）=30左右。T一般為5%~10%。②凝膠濃度與孔徑的關系T與c不僅與凝膠的機械性能有關，還與凝膠的孔徑關系極為密切。一般講，T越大，孔徑越小。此外，孔徑還同Bis與Acr的比例有關，Bis占Acr總濃度5%時，孔徑最小。③凝膠濃度與被分離物相對分子質(zhì)量有關。4/24/202370編輯ppt4/24/202371編輯ppt聚丙烯酰胺凝膠電泳垂直平板電泳水平板電泳圓盤電泳連續(xù)電泳不連續(xù)電泳Disc電泳4/24/202372編輯ppt丙烯酰胺凝膠電泳的應用

聚丙烯酰胺凝膠電泳根據(jù)其有無濃縮效應，可分為連續(xù)的和不連續(xù)的兩類。前者指整個電泳系統(tǒng)中所用緩沖液，pH值和凝膠網(wǎng)孔都是相同的；后者是指在電泳系統(tǒng)中采用了兩種或兩種以上的緩沖液、pH值和孔徑，不連續(xù)電泳能使稀的樣品在電泳過程中濃縮成層，從而提高分辨能力。

4/24/202373編輯ppt在不連續(xù)PAGE系統(tǒng)里，存在三種物理效應,，即電荷效應、分子篩效應和濃縮效應。１、電荷效應：各種蛋白質(zhì)按其所帶電荷的種類及數(shù)量，在電場向一定電極，以一定速度泳動。２、分子篩效應：區(qū)別不同大小分子種類的能力是凝膠所具有的一種篩分大小的能力即分子篩效應。這種效應與凝膠過濾過程中的情況不同。

4/24/202374編輯ppt濃縮效應4/24/202375編輯ppt4/24/202376編輯ppt4/24/202377編輯ppt4/24/202378編輯ppt§9蛋白質(zhì)的研究歷史與方法SDS－PAGE電泳是應用聚丙烯凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量的一種有效的方法。SDS是陰離子變性劑，使蛋白質(zhì)分子變性為直鏈狀，且其所帶陰離子將蛋白質(zhì)分子所帶電荷完全履蓋，具有相似的荷質(zhì)比，電泳過程完全與蛋白質(zhì)的分子量相關。電泳結(jié)束后的凝膠用考馬斯亮蘭或銀染后與已知分子量的蛋白質(zhì)的標準蛋白比較得出。4/24/202379編輯ppt4/24/202380編輯ppt§9蛋白質(zhì)的研究歷史與方法二維電泳是等電聚焦電泳與SD