中國農業(yè)大學本科生“URP”立項申請書

中國農業(yè)大學本科生“URP”立項申請書項目名稱制動應激對妊娠母鼠下丘腦GnRH蛋白的影響申請人 王子旭工作單位 動物醫(yī)學院聯(lián)系電話 電子信箱填表日期2018418中國農業(yè)大學教務處制項目名稱制動應激對妊娠母鼠下丘腦GnRH蛋白的影響項目起止時間項目申請人情況二、實施計劃及方案（明確各個環(huán)節(jié)對培養(yǎng)學生創(chuàng)新能力的具體思路及考核辦法）姓名王子旭性別女出生日期1964.3最后學歷與學碩士專業(yè)技術職務高級實驗師從事專業(yè)基礎獸醫(yī)學：熟悉實驗室環(huán)境，摸索實驗方法，查閱國內外參考文獻，進行理論知識鞏固提高。提交一篇綜述性文章。翻譯一篇與本項目相關的外文文獻。培養(yǎng)學生的專業(yè)外語能力。：進行實驗內容。（1）實驗動物的飼養(yǎng)和取材：培養(yǎng)學生的準備工作能力，包括小鼠的飼養(yǎng)、配種方法和小鼠的解剖結構認知。50日齡雌性ICR小鼠30只，雄性ICR小鼠10只，于試驗動物房中飼養(yǎng)，飼喂鼠全價料，自由采食與飲水（白開水）。光照：黑暗=14h:10h。鼠房內溫度保持在22℃。小鼠進入實驗動物房適應一周以后，每天下午4點左右開始做陰道涂片，確定發(fā)情后進行配種，次日7:30左右觀察雌鼠陰道口是否有陰栓，確定懷孕后將30只小鼠隨機分成2組，每組15只，一組進行制動應激，一組對照處理，分別在妊娠5d進行取材，各取5只小鼠的下丘腦、垂體和腎上腺進行-80℃凍存。（2）相關蛋白的檢測：該階段進一步培養(yǎng)學生的實驗室操作技能，甚至研究方法的探索和創(chuàng)新，培養(yǎng)學生嚴謹?shù)目蒲袘B(tài)度。提取組織內蛋白：將下丘腦組織取出，與蛋白裂解液進行1：10的比例進行組織勻漿，勻漿完之后，靜置20min,待裂解完全后，14000g,離心15min。吸取上清于另一干凈的EP管中。蛋白濃度的測定：.樣品稀釋液的制備5倍稀釋10piL的原液+40匹的蛋白裂解液；.稀釋液的量吸取稀釋液中25mL;.BCA工作液的配制根據(jù)樣品的數(shù)量（n）混合適量的AB液A:B=50：1配的量為n+1的量A液200pL*（n+1）X混合每個樣品孔200piLB液4pL*（n+1） /.溫箱37℃孵育30分鐘.570nm測吸光值（注意各個參數(shù)的設定）.測三次吸光值，求平均值.所測蛋白的濃度：5*（1.0097*mean+0.0337）煮樣：.總體積：每次加樣量（自己定）*次數(shù)（自己定）.原液體積：總體積*設定濃度（所測蛋白濃度的最低濃度）/蛋白濃度.5*SDS的體積：總體積/5.RIPA的體積：總體積-5*SDS的體積-原液的體積.離心：1000轉2min.在沸水中煮3min混勻，將樣品放入-20℃待測。然后進行下列步驟：.清洗玻璃板：在自來水中將玻璃板用洗潔精洗干凈，不要有掛壁現(xiàn)象，再在自來水中涮洗一遍，在蒸鐳水中再清洗一次，浸泡一段時間后放入烘箱烘干;.裝置安裝：短板在內，長板在外，對齊將夾子擰到相應位置（1.5的板對準1.5』的板對準1）加入蒸鐳水，若液面下降過快，則重新安裝裝置，若無明顯漏液，則等十分鐘進行觀察，若無漏液則加分離膠；.配膠此步驟可以在檢漏時進行，分離膠分為8%、10%、12%三種常用的，分子量越大配膠濃度越小，一般分子量在40以上的可以用8%的，20-40的可以用10%的，20以下可用12%的。分離膠和濃縮膠的成分一樣，只是各個組分加入的量不一樣，可以一起配。（分離膠：H2O、30%Acryamide（丙烯酰胺）、1.5MTrisHCl（pH8.8）>10%SDS>10%AP（過硫酸鏤）、TEMED。濃縮膠：H2O>30%Acryamide（丙烯酰胺）、l.OMTrisHCl（pH6.8）＞10%SDS、10%AP（過硫酸鏤）、TEMED）,組份的后兩種容易使膠凝固，可以暫時不用加，等到往裝置中加膠時進行添加。.灌膠等到檢漏結束后，將蒸儲水倒掉，用lOOOpL的槍加分離膠，動作要迅速，但不能有氣泡，槍頭與平面的夾角要小，槍頭緊貼長板，使膠充分加入板槽中，加到黃色夾子上方大約2厘米處為止，然后加滿蒸儲水（目的：將分離膠壓平，趕走氣泡），加蒸儲水時也要保持槍頭與水平面的小夾角，不要猛加,防止沖壞分離膠造成彎曲，待膠凝固20-30分鐘，看到與水面有一條明顯的分界線時，將蒸譙水倒掉，配好濃縮膠，加入濃縮膠（注意要點同分離膠，），插上梳子（注意對應板用對應的梳子，毛面朝短板，光面朝長板），注意梳齒底部不能有氣泡，等大約20-30分鐘，即可拔梳子加樣，若此時不加樣，不要拔梳子，將裝置打開放入電泳槽，加入電泳液放入4℃冰箱；.加樣加的樣是煮好的樣，按照原來設定的加樣量加樣，確保樣都加入梳槽內，marker加5pL,有空孔時，用SDS液補齊，防止周圍的樣品將marker擠窄;.電泳將電極對好，紅對紅，黑對黑，調好濃縮膠電壓（50V-80V之間，在實驗摸索中調好合適的電壓），等藍線跑至分離膠頁面時，電壓調至120V左右。該過程時間大約2-3小時，電壓調高一點可能會更快一點（他人經(jīng)驗），待藍線跑至底端時，marker跑開時，進行轉膜；.轉膜準備好裝有自來水的水盆，準備好適當大小的平皿，將適量無水甲醇倒入平皿中，用尺子量好所跑條帶的分子量范圍和長度，裁剪PVDF膜，將膜放入無水甲醇中，注意不要用手觸碰白色的膜。拿出搪瓷盤，倒入轉膜緩沖液,將濾紙（2-3層/每邊）、海綿（1層/每邊）和轉膜夾板放入搪瓷盤浸泡。暫停電泳過程，取出電泳夾板，小心將長板和短板分開，將不用的板放入水盆中，用小刀或尺子將自己所需要的分子量范圍裁剪下來，將轉膜夾板打開，黑板朝下（正極），白板朝上，鋪上一層海綿和兩層濾紙，每鋪一層都要用玻璃棒趕一下氣泡，將膠用塑料夾子鋪在濾紙上，這個過程要時刻用轉膜緩沖液淋洗，保持膠的濕潤，鋪好膠之后再鋪上裁剪的膜，注意不要有氣泡，有氣泡用轉膜緩沖液淋洗，再加上兩層濾紙，一層海綿，同樣要注意不要有氣泡。夾好夾子，放入轉膜槽中，黑對黑，白對紅，將搪瓷盤中的轉膜緩沖液加入轉膜缸中，將泡膜的無水甲醇也導入轉膜缸中，蓋好蓋子，恒流（200毫安），轉膜進行1小時15分鐘左右;.封閉配好5%脫脂乳，將其倒入平皿中，暫停轉膜過程，將轉膜夾子打開,看marker是否完全轉到膜上，若沒有，則繼續(xù)轉膜，若轉好了，則用塑料夾子將膜夾入脫脂乳中，封閉2小時以上；.孵一抗將膜取出，放入另一個干凈平皿中，準備好一個盒子，加入一抗（下丘腦：GnRH）,將膜放入盒子中，4℃過夜；.孵二抗將膜取出放入平皿，用1*TBST漂洗三次，每次十分鐘，又放入盒子，加二抗，孵2個小時左右；.曝光將膜取出，用1*TBST再漂洗三次，進行曝光，曝光液是按一比一比例配制；.定量計算：將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標帶的分子量和凈光密度值。（3）對結果進行總結，整理，提交一份數(shù)據(jù)完整的實驗報告。培養(yǎng)學生的分析問題、解決問題和寫作能力。3.2019.4?2019.6：總結實驗，分析數(shù)據(jù)，查閱中外文文獻，提交一篇高水平的研究性報告。通過以上幾個階段鍛煉，培養(yǎng)學生初步的科研工作能力，一定科研創(chuàng)新能力，嚴謹、踏實的科研態(tài)度，并且具有一定的文字寫作能力。三、項目實施的基礎和條件.工作基礎本課題組長期從事腸黏膜免疫、生殖生物學和神經(jīng)生物學的研究，妊娠期的子宮對制動應激非常敏感，會使得下丘腦-垂體-腎上腺軸和下丘腦-垂體-卵巢軸發(fā)生變化以調節(jié)妊娠期的激素水平；本課題組具有扎實的理論基礎，獲得了豐富的實驗經(jīng)驗，掌握了一套成熟的實驗方法，配備了完備的實驗儀器。.實驗室條件本項目依托中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院，國家“211工程”重點建設實驗室。本單位已具有完善的實驗室條件。已具備的實