目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座

第三節(jié)重組子篩選在重組DNA分子轉化、轉染或轉導過程中，普通僅有少數(shù)受體細胞成為克隆子。必須采取適當方法從大量細胞背景中篩選出期待克隆子。概念克隆子轉化子重組子目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第1頁將攝取外源DNA分子并能使該分子在其中穩(wěn)定維持受體細胞統(tǒng)稱為克隆子。把采取各種轉化方法或轉導方法取得克隆子叫做轉化子（導入外源DNA分子后能穩(wěn)定存在受體細胞稱為轉化子），現(xiàn)在這二者有通用趨向。含有重組DNA分子克隆子被稱為重組子，假如重組子中含有外源目標基因則又稱為陽性克隆子或期望重組子

。經(jīng)過各種方法將外源DNA分子導入受體細胞后，取得所需陽性克隆子過程稱為克隆子篩選。

目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第2頁一、遺傳表型直接篩選法（一）依據(jù)載體選擇標識初步篩選轉化子在構建基因工程載體系統(tǒng)時，通常在載體DNA分子中組裝了一個或兩種選擇標識基因，在受體細胞內進行表示，展現(xiàn)出特殊表型或遺傳學特征，作為篩選轉化子依據(jù)。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第3頁

普通做法是:將轉化處理后受體細胞接種在含適量選擇藥品培養(yǎng)基上，在最適生長溫度條件下培養(yǎng)一定時間，依據(jù)菌落生長情況挑選出轉化子。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第4頁慣用選擇標識基因主要是：抗性基因；

表示產(chǎn)物能夠發(fā)光或使反應底物顯色基因對應選擇條件是：能夠被抗性基因產(chǎn)物分解抗生素；能夠使基因產(chǎn)物發(fā)光光線，或者是能夠使基因產(chǎn)物顯色試劑。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第5頁選擇培養(yǎng)基是：依據(jù)宿主細胞類型配置培養(yǎng)基，對于細菌受體細胞而言，通慣用LB培養(yǎng)基，在LB培養(yǎng)基中加入適量某種選擇物，即為選擇培養(yǎng)基。選擇物：是由載體DNA分子上攜帶選擇標識基因所決定。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第6頁（一）依據(jù)載體選擇標識初步篩選轉化子（1）抗藥性篩選（2）插入失活篩選法（3）插入表示篩選法（4）顯色互補篩選法（5）利用匯報基因篩選植物轉化細胞（6）利用遺傳選擇標識篩選哺乳動物轉基因細胞目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第7頁（1）抗藥性篩選目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第8頁目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第9頁正向選擇方式目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第10頁注意：利用含一個選擇藥品選擇培養(yǎng)基無法區(qū)分重組子和非重組子，只能區(qū)分轉化子和非轉化子。非轉化子呈Aps、Tcs轉化子呈Apr、Tcr/s目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第11頁（2）插入失活篩選法目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第12頁雙抗藥性篩選雙目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第13頁目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第14頁（3）插入表示篩選法利用外源目標基因插入特定載體后能激活篩選標識基因表示，由此進行轉化子篩選。有些載體在設計時，在篩選標識基因前面連接上一段負調控序列，當插入失活該負調控序列時，其下游篩選標識基因才能表示。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第15頁比如pTR262質粒載體，它由pBR322衍生而來，其Tcr基因上游含有一段λ噬菌體DNACI阻遏蛋白編碼基因及其調控序列，CI基因表示阻遏蛋白能夠抑制Tcr基因表示。當外源DNA片段插入CI基因HindⅢ或BglⅠ位點上時，CI基因失活。Tcr基因因妨礙解除而得以表示，故陽性重組子為Tcr表型。

質粒本身因為Tcr基因受妨礙為Tcs表型，當轉化細菌涂布在Tc平板上時，只有含有外源DNA插入片段陽性重組子轉化菌才能生長成菌落。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第16頁（4）顯色互補篩選法目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第17頁目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第18頁lacZ基因上缺失操縱基因區(qū)段突變體與帶有完整近操縱基因區(qū)段β-半乳糖苷酶陰性突變體之間實現(xiàn)互補，這種互補現(xiàn)象稱為α-互補。含有完整乳糖操縱子菌體能轉譯β-半乳糖苷酶(Z)、IPTG和X-gal時，產(chǎn)生蘭色沉淀物，使菌落成為藍色。假如在載體DNA上組入β-半乳糖苷酶基因（lacZ)部分缺失片段(lacZ’)．則重組DNA分子轉化lacZ’互補型菌落，會在含有X-gal和IPTG培養(yǎng)基中得到轉化子是藍色菌落。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第19頁lacZ’是β-半乳糖苷酶基因部分缺失DNA片段，含lacZ’重組載體轉化lacZ’互補型菌株，可轉譯β-半乳糖苷酶，在含有X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）和IPTG（異丙基-β-硫代半乳糖苷）培養(yǎng)基上使轉化子成為藍色菌落，而lacZ’互補型菌株本身為白色菌落。當lacZ’區(qū)插入外源基因后，再轉化lacZ’互補型菌株，因為不能翻譯β-半乳糖苷酶，轉化子即使在含有X－gal和IPTG培養(yǎng)基上也只能長成白色菌落。這么能夠區(qū)分含外源基因和不含外源基因轉化子。此方法主要用于原核生物。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第20頁

α互補檢測目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第21頁目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第22頁以顯色劑x-gal作為選擇物時:DNA對照組不應出現(xiàn)任何菌落；感受態(tài)細胞對照組長出菌落應全是藍色；感受態(tài)細胞有效性對照組長出菌落中應有白色。其中一項不符，就有可能挑出假轉化子菌落。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第23頁（5）利用匯報基因篩選植物轉化細胞匯報基因：系指其編碼產(chǎn)物能夠被快速地測定，慣用來判斷外源基因是否已經(jīng)成功地導入寄主細胞（器官或組織）并檢測其表示活性一類特殊用途基因。在植物轉基因研究中，在有選擇壓力情況下，可利用匯報基因在受體細胞內表示，從大量非轉化克隆中選擇出轉化細胞；同時，匯報基因能夠和一些目標基因組成嵌合基因，從匯報基因表示了解目標基因表示情況及推測基因調控序列。慣用匯報基因有抗生素抗性基因以及編碼一些酶類或其它持殊產(chǎn)物基因等。

目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第24頁特征作為匯報基因，在遺傳選擇和篩選檢測方面必須含有以下幾個條件：

(1)已被克隆和全序列已測定；

(2)表示產(chǎn)物在受體細胞中本不存在，即無背景，在被轉染細胞中無相同內源性表示產(chǎn)物；

(3)其表示產(chǎn)物能進行定量測定。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第25頁①新霉素磷酸轉移酶基因（nptⅡ）抗新霉素、卡那霉素、慶大霉素和G418等抗生素，成為篩選動植物轉化子選擇標識基因。②潮霉素磷酸轉移酶基因（hpt）賦予轉化子能抗潮霉素，作為選擇標識基因主要用于篩選動植物轉化子。潮霉素是致癌物質，操作時應慎重。③氯霉素乙酰轉移酶基因（cat）也被用于篩選動植物轉化子標識基因。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第26頁④β-葡萄糖酸酶基因（gus）gus基因產(chǎn)物β-葡萄糖酸酶（GUS）能夠催化4-甲基傘形花酮-β-D-葡萄糖苷酸，產(chǎn)生熒光物質4-甲基傘形花酮，以此篩選含gus基因轉化子。因為植物細胞GUS本底非常低，所以廣泛地應用于篩選植物轉化子。尤其是gus基因3’端與其它結構基因連接產(chǎn)生嵌合基因仍能正常表示，產(chǎn)生融合蛋白中仍有GUS活性，可用于外源基因在轉化生物體中定位分析。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第27頁⑤螢火蟲熒光素酶基因（luc）luc表示產(chǎn)物螢火蟲熒光素酶（LUC）在Mg2+作用下，能夠與熒光素和ATP底物發(fā)生反應，形成與酶結合腺苷酸熒光素酰化復合物，經(jīng)過氧化脫羧作用后，該復合物轉變成為處于激活狀態(tài)氧化熒光素，能夠用熒光測定儀快速靈敏地檢測出產(chǎn)生熒光，是當前研究動植物轉基因很好用一個匯報基因。Luc基因檢測十分快速，靈敏度高，成本低，不存在放射性同位素檢測對人體健康和環(huán)境生態(tài)所造成危害，也沒有內源熒光產(chǎn)生背景干擾，所以，Luc是一個理想?yún)R報基因。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第28頁⑥抗除草劑bar基因。bar基因編碼磷化乙酰轉移酶（PAT），使轉化子對含有磷化麥黃酮（PPT）成份除草劑含有抗性。⑦冠癭堿合成酶基因。主要包含胭脂堿合成酶基因和章魚堿合成基因兩類，存在于土壤農(nóng)桿菌Ti質粒T-DNA區(qū)段。冠癭堿合成酶基因在植物細胞中表示產(chǎn)物能夠催化一些特殊反應，經(jīng)過電泳分離及菲醌熒光染料染色，方便地觀察，據(jù)此作為匯報基因用于轉植物基因細胞篩選。冠癭堿合成酶基因在植物基因工程早期應用較多，現(xiàn)已逐步被其它更為理想?yún)R報基因所取代。

目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第29頁（6）利用遺傳選擇標識篩選哺乳動物轉基因細胞

在植物轉基因研究中采取氯霉素乙酰轉移酶(Cat)基因和新霉素磷酸轉移酶(NptⅡ)基因也可用于哺乳動物轉基因細胞篩選。慣用標識基因還有：--胸腺核苷激酶基因（tk）、--二氫葉酸還原酶基因（dhfr）--次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因（hgprt）--細菌黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶基因(ecogpt)等。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第30頁胸腺核苷激酶基因（tk）、二氫葉酸還原酶基因（dhfr）及次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因（hgprt）等表示產(chǎn)物直接或間接參加核苷酸合成代謝。這些基因缺失缺點型細胞因核苷酸合成代謝失調而死亡，只有在添加一些核苷酸培養(yǎng)基中才能生長。假如用這么缺點型細胞作為受體細胞，導入含有上述基因外源DNA，補充原來缺失基因，使核苷酸合成代謝恢復正常，能夠在不添加核苷酸培養(yǎng)基中正常生長。依據(jù)這一性質能夠在不添加核苷酸培養(yǎng)基中篩選出轉化子。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第31頁三、核酸分子雜交檢測法（p239）基本原理復性RNADNA目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第32頁待測核酸序列雜交雙方用于檢測已知核酸片段—探針目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第33頁目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第34頁

依據(jù)待測核酸起源以及將其分子結合到固相支持物上方法不一樣。Southern印跡雜交Northern印跡雜交斑點和狹線印跡雜交菌落（或噬菌體）原位雜交核酸分子雜交檢測法分類目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第35頁又稱DNA印跡雜交、SouthernDNA印跡雜交1、Southern印跡雜交經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段↓轉移到濾膜上↓

與標識DNA或RNA探針雜交↓放射自顯影顯雜交帶基本原理：目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第36頁（1）提取總DNA（2）酶解（3）電泳（4）轉?。?）變性解鏈（6）雜交（7）洗脫（8）放射自顯影（9）比較分析

目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第37頁毛細管虹吸印跡法電轉移印跡法真空轉移法核酸轉移（印跡）方法目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第38頁毛細管虹吸印跡法濕濾紙高鹽緩沖液濾紙橋凝膠硝酸纖維素膜吸水紙玻璃板支持臺容器重物目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第39頁利用核酸分子在電場中電泳作用將凝膠中DNA轉移到固相支持物上。濕式電轉移干式電轉移電轉移法目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第40頁尼龍膜凝膠濾紙海綿凝膠支持夾緩沖液電極+–濾紙電極濕式電轉移法目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第41頁真空轉移法目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第42頁真空轉移裝置目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第43頁①硝酸纖維素膜（簡稱NC膜）優(yōu)點：吸附能力強，雜交信號本底低缺點：DNA分子結合不牢靠，膜易碎裂，依賴高鹽溶液慣用固相支持物目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第44頁②尼龍膜（Nylon）優(yōu)點：結合單鏈，雙鏈DNA能力比NC膜強，韌性高，可重復雜交缺點：雜交信號本底高慣用固相支持物目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第45頁凝膠濾膜轉移RNA至膜上RNA分子甲醛變性電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳）帶有RNA片段凝膠轉膜雜交、顯影2、Northern印跡雜交目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第46頁兩種印跡技術比較(P248)1\2\3\4目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第47頁3、斑點印跡雜交和狹線印跡雜交兩種方法基本原理和操作步驟相同——

即經(jīng)過特殊加樣裝置將變性DNA或RNA核酸樣品，直接轉移到適當雜交濾膜上，然后與核酸探針分子進行雜交以檢測核酸樣品中是否存在特異性DNA或RNA。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第48頁斑點雜交法目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第49頁狹縫式點樣器目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第50頁

1、斑點印跡為圓形

2、狹縫印跡為線狀

3、判別DNA、RNA4、簡單、快速，同一張膜可檢測多個樣品

5、特異性不高、不能判別核酸分子量斑點及狹縫印跡雜交特點目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第51頁4、菌落（或噬菌斑）原位雜交基本原理直接把菌落和噬菌斑轉移到濾膜上溶菌、變性DNA暴露并于濾膜原位結合與探針雜交目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第52頁溶菌、使DNA暴露洗菌體碎片和Pr使單鏈DNA牢靠結合在膜上目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第53頁操作用途Southern印跡雜交從轉化子中提取總DNA，經(jīng)酶切、電泳分帶及變性，轉移膜上，再用DNA探針與其雜交。操作麻煩。判定轉化子中是否含有待檢測重組DNA分子；判定待檢測DNA分子大小。斑點印跡雜交把提取轉化子總DNA直接點樣到膜上，變性處理后再用DNA探針與其雜交。操作簡單。只能區(qū)分總DNA中是否含有待檢測重組DNA分子重組子菌落（或噬菌斑）原位雜交直接把菌落或噬菌斑印跡轉移到膜上，經(jīng)溶菌和變性處理后使DNA暴露出來并與濾膜原位結合，再用DNA探針與其雜交。操作簡單。廣泛地用于從基因組DNA文庫和cDNA文庫中篩選含目標基因重組子。三種篩選方法比較目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第54頁雜交探針——指含有一定序列核苷酸片段，它能與互補核酸序列復性雜交，而且經(jīng)過適當標識進行檢測。5、核酸雜交探針(自學)目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第55頁①同源或部分同源探針②總cDNA探針③特異性cDNA探針④人工合成寡核苷酸探針（1）核酸雜交探針種類目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第56頁理想探針標識物應滿足條件：1)不會影響探針主要理化性質；2)檢測靈敏度高、特異性強、本底低、重復性好；3)操作簡便、省時．經(jīng)濟實用：4)化學穩(wěn)定性高、易于長久保留；5)安全、無環(huán)境污染。慣用于分子雜交探針標識物分放射性及非放射性。（2）探針標識物目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第57頁放射性標識物是指以放射性同位素對核苷酸等進行標識后產(chǎn)物，常見放射性同位素有32P、3H、35S、14C、125I等，其中以32P、3H、35S最為慣用。標識物放射性檢測主要使用蓋革計數(shù)器和液體閃爍計數(shù)器等射線探測儀來完成。①放射性標識物目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第58頁非放射性標識物最大優(yōu)勢是無放射性污染，分辨力高，穩(wěn)定性好，能夠較長時間保留使用，但與放射性探針相比，多數(shù)非放射性探針敏感性及特異性較差。當前已廣泛應用非放射性標識物有：生物素(biotin)標識核苷酸、地高辛(digoxigenin)標識核苷酸熒光素(fluorescein)標識核苷酸②非放射性標識物目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第59頁（3）探針標識方法探針標識有體內標識及體外標識兩種方法。體內標識法是以標識化合物作為代謝底物，經(jīng)過活體生物或活細胞體內代謝完成核酸分子標識，比如在培養(yǎng)基中加入3H-胸苷，就能夠標識到生長在該培養(yǎng)基中活細胞DNA分子上。體內標識法受各種原因限制，且標識活性不高，普通極少使用。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第60頁體外標識包含化學法和酶法兩種?；瘜W標識法是利用標識物活性基團與核酸分子中某種基因(如磷酸基團)發(fā)生化學反應而直接將標識物連接到探針分子上，含有簡單快速、標識均勻特點，尤其適于制備非放射性標識物探針。酶標識法則是先將標識物標識在核苷酸上，然后經(jīng)過酶促聚合反應使帶標識核苷酸摻入到核酸序列中，取得核酸探針。酶法應用廣泛，適于制備全部放射性標識探針及部分非放射性標識探針。慣用酶法有DNA缺口平移標識法、DNA隨機引物標識法、DNA末端標識法及PCR標識法等。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第61頁①切口平移標識法

(nickthanslationlabeling)DNA聚合酶Ⅰ目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第62頁該法標識模板鏈目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第63頁②隨機引物標識法

(randomprimedDNAlabeling)Klenow片段催化該法標識模板互補鏈隨機引物是含有各種可能排列寡核苷酸片段混合物。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第64頁隨機引物：46使用隨機引物標識探針普通長400-600個核苷酸，具各種序列，但都與模板互補。與切口平移法不一樣是，該方法標識是模板互補鏈，而非模板本身。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第65頁③末端標識法

(DNAterminallabeling)該法標識是線性DNA或RNA5’端或3’端，屬非均一性標識。1)3’凸出末端加尾標識法：末端脫氧核苷酸轉移酶將帶有標識dGTP或dCTP加到DNA3’-OH端2)雙鏈DNA3’隱蔽末端填充標識：（若反應體系存在全部與模板序列互補dNTP）以凸出序列為模板，Klenow酶或T4DNA連接酶催化補平3’末端（若一個dNTP帶標識則成為探針）。3)5’末端標識：T4多聚核苷酸激酶將ATP標識γ-磷酸基團轉移到游離5’-OH上。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第66頁④PCR標識法(PCRlabeling)：標識一個dNTP⑤光敏標識法⑥化學衍生結合標識法：生物素和地高辛等非放射性標識物能夠與事先經(jīng)過化學修飾得到核酸衍生物愈加牢靠地結合，進行非放射性探針制備。慣用化學修飾反應包含磺化、轉氨、溴化等反應類型。⑦交叉相連標識法：利用一些高分子化合物，如細胞色素c、組蛋白H1及大腸桿菌單鏈結合蛋白質等能與核酸結合特征，制備對應探針。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第67頁四、DNA序列測定法（錄像）

DNA序列測定，即核酸一級結構測定，簡稱DNA測序。對克隆DNA片段進行序列測定及分析:能夠直觀地判定出重組DNA分子中是否含有目標基因;能夠取得目標基因編碼序列和基因調控序列.這對目標基因表示及其功效研究含有主要意義。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第68頁DNA序列分析當前用于測序技術主要有:Sanger等（1975）創(chuàng)造雙脫氧鏈末端終止法Maxam和Gilbert（1977）創(chuàng)造化學降解法。這二種方法在原理上差異很大，但都是依據(jù)核苷酸在某一固定點開始，隨機在某一個特定堿基處終止，產(chǎn)生A，T，C，G四組不一樣長度一系列核苷酸，然后在尿素變性PAGE膠上電泳進行檢測，從而取得DNA序列。當前Sanger測序法得到了廣泛應用。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第69頁1DNA化學降解測序法DNA化學降解測序法也叫Maxam-Gilbert測序法基本原理是，將待測DNA分子進行末端放射性標識，然后置于4組獨立化學反應體系中分別進行部分降解，其中每一組反應特異性地針對某一堿基或某一類堿基。經(jīng)過化學降解一段時間后，在每一組反應體系中，生成各種不一樣長度、一端為放射性標識固定寡聚核苷酸分子，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影檢測后能夠讀出待測DNA分子堿基序列。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第70頁（2）堿基切割反應體系進行堿基特異性化學切割反應試劑是硫酸二甲酯、肼（聯(lián)氨）以及哌啶（六氫吡啶）。硫酸二甲酯、肼（聯(lián)氨）——堿基進行化學修飾；哌啶——從修飾堿基處斷裂核苷酸鏈。在不一樣酸、堿、高鹽和低鹽條件下，三種化學試劑按不一樣組合能特異地切割核苷酸序列中特定堿基，降解待測模板DNA分子。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第71頁硫酸二甲酯（DMS）：G；pH2甲酸哌啶：

G+A;肼（NH2NH2）：

C+T;肼（NH2NH2）+高鹽：C目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第72頁1、待測模板制備3、待測模板DNA分子序列分析2、化學降解待測模板DNA分子測序步驟（3）DNA目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第73頁序列讀取是逆電泳方向進行DNA目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第74頁化學降解測序法不但適于單鏈DNA，也適于雙鏈DNA測序，主要用于研究DNA一級和二級結構、DNA甲基化位點測定和DNA-蛋白質相互作用等方面，結果準確可靠，是DNA測序基本方法之一。它缺點是一輪反應所能測定模板DNA長度只有250bp左右，若測定大片段DNA分子時，操作較為繁瑣費時。另外，化學降解測序法不能在載體上直接進行，標識后模板DNA分子難以純化。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第75頁2DNA雙脫氧鏈終止測序法雙脫氧鏈終止測序法是由Sanger等在加減法基礎上建立一個簡單快速DNA序列分析法，故也稱為Sanger測序法。有時又稱為引物合成法，或酶促引物合成法，因為該法是以待測DNA分子為模板，在DNA聚合酶Ⅰ作用下，利用適當DNA合成引物進行DNA互補鏈合成來完成測序工作。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第76頁基本原理：DNA聚合酶能夠利用單鏈DNA作模板，合成出對應DNA互補鏈，但在反應過程中，假如2’，3’-雙脫氧核糖核苷三磷酸底物（ddNTP）摻入到寡核苷酸鏈3’端，DNA鏈延伸反應即被終止。ddNTP——鏈終止核苷酸（1）基本原理目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第77頁目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第78頁目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第79頁在4個特定反應體系中分別加入一個ddNTP反應底物（ddCTP、ddATP、ddGTP、ddTTP）以及DNA模板、合成引物、DNA聚合酶I、一定濃度dNTP（dCTP、dATP、dGTP、dTTP，其中有一個是帶32P放射性標識），DNA鏈合成隨機終止于某一特定ddNTPs。最終經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影技術讀出待測DNA模板堿基序列。雙脫氧鏈終止測序法準確度較高，絕大多數(shù)以單純測定DNA序列為目標試驗室均采取此法。此法讀取堿基序列是待測DNA模板互補鏈，而非模板鏈本身。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第80頁ddNTP

目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第81頁目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第82頁目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第83頁目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第84頁（2）雙脫氧核糖核苷三磷酸作用機制

2’，3’-雙脫氧核糖核苷三磷酸（ddNTP）分子結構式與2’-脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）極為相同，惟一區(qū)分是，ddNTP在脫氧核糖3’位置上缺乏一個羥基。在DNA鏈合成過程中，ddNTP能夠利用其5’-磷酸基團與DNA鏈上游離羥基基團形成磷酸二酯鍵而使鏈得以延伸，不過因為ddNTP缺乏3’-0H基團，不能與下一個底物分子5’-磷酸基團進行反應，所以新生寡核酸鏈一旦加入ddNTP，DNA鏈合成就會終止。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第85頁目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第86頁（3）待測模板DNA分子制備限制性核酸內切酶消化切割形成DNA小片段↓隨機地克隆到一個適當載體分子上↓經(jīng)轉化篩選后得到含有同一起源DNA片段重組子克隆后代↓以此大量制備重組DNA分子，直接用于DNA測序需要采取DNA分子克隆方法制備模板DNA：目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第87頁因為新生DNA鏈合成反應是從引物3’端定向進行，無須將待測DNA片段從載體上切下。實際上，載體存在不但不會影響測序結果，反而有利于測序進行，因為在實際操作中，引物往往是與載體克隆位點兩側序列互補，這么能夠測定完整DNA序列。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第88頁

M13載體能克隆單鏈DNA分子，制備產(chǎn)物可直接用作引物合成反應中單鏈模板，同時，因為待測DNA片段均被克隆在M13載體同一個特定區(qū)段內，全部待測DNA片段，都能夠使用同一個引物，即M13載體克隆位點兩側通用引物（universalprimer）進行DNA鏈合成延伸，防止了因合成和分離各種不一樣引物而造成許多麻煩。所以，M13載體雙脫氧鏈終止法當前已經(jīng)成為一個普遍采取快速DNA序列分析法。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第89頁1985年Chen和Seeburg為了提升DNA測序速度建立。該法是將待測定DNA片段克隆到質粒載體上，直接用閉合環(huán)形雙鏈質粒DNA按雙脫氧鏈終止法測定模板DNA序列。因為通常使用質粒是PUC載體系列，所以又稱之為Sanger雙脫氧鏈終止-pUC體系DNA序列分析法。這種方法最大優(yōu)點是，它無須將DNA克隆到M13載體分子上，而是直接用堿變性雙鏈閉合環(huán)形重組質粒DNA作為模板進行序列分析，所以比M13法更為簡單快速，實用價值高。☆針對雙鏈DNA模板進行雙脫氧鏈終止測序法目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第90頁（4）測序反應物合理應用雙脫氧鏈終止測序法操作關鍵：是ddNTP與dNTP用量百分比，二者較為理想分子比在1：3至1：4之間。大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段、測序酶（經(jīng)過改造T7噬菌體聚合酶）、TaqDNA聚合酶DNA序列分析中通常采取[α-35S］dATP代替[α-32P］dNTP，方便取得更高分辨率。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第91頁3大片段DNA測序策略

DNA測序通常包含克隆、測序反應和讀序三個步驟。前述兩種DNA測序方法中，一次測序能直接讀出DNA序列長度受到聚丙烯酰胺凝膠分離效果限制，普通情況下，最大程度不超出350個堿基序列。所以，對于較大DNA片段而言，必須將其分成較小片段分別測序，才能取得完整堿基序列。

選擇恰當測序策略將直接關系到大片段DNA或基因組DNA序列分析工作效率。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第92頁①隨機克隆策略又叫鳥槍法克隆策略，先將克隆DNA片段用超聲波打斷或DNA酶Ⅰ切斷，隨機亞克隆到M13載體上，分別進行DNA序列測定，然后利用計算機進行數(shù)據(jù)分析，排出完整DNA序列。鳥槍法缺點隨機亞克隆易造成序列重復測定，也易丟失一些序列；測序及測序后數(shù)據(jù)處理和分析工作量大，并需要計算機幫助進行排序才能得到完整序列。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第93頁目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第94頁②引物步移策略將待測DNA片段克隆在質粒載體上，利用引物步移延伸，從DNA片段一端開始逐步進行序列測定，直到另一端為止。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第95頁目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第96頁引物步移法克服了鳥槍法盲目性，并省去亞克隆制備繁瑣步驟，也減輕了隨即數(shù)據(jù)分析工作量。但因為測定下一段序列前要預先知道上游序列堿基序列，才能合成適當引物進行測序，所以該策略難以自動化操作。另外，引物合成費時費勁，再加上當前慣用質粒載體不易純化等也都影響了該法實施。最近研究表明：隨機引物可作為引物步移法中測序引物，比如采取線性連接3條6堿基隨機引物即可很好地引導測序反應，這些結果為引物步移法自動化帶來可能。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第97頁③定向缺失克隆策略利用核酸外切酶Ⅲ、Bal31或T4DNA聚合酶等酶解方法，從克隆DNA片段一側進行不一樣時間定向缺失，逐步縮短DNA片段大小，分別回收并環(huán)化DNA缺失片段，使DNA片段被保護一側引物結合位點與缺失不一樣長度一側連接重組，轉化篩選后得到一系列由待測DNA片段定向缺失后形成嵌套重組子，然后利用引物結合位點逐一測定這些嵌套重組子中待測DNA模板，最終依據(jù)重合序列將不一樣片段序列拼接為完整DNA片段序列。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第98頁利用ExoⅢ能特異性起始切割5’凸出端或平末端雙鏈DNA，而不能有效切割3’凸出端雙鏈DNA特征，構建待測DNA定向嵌套缺失。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第99頁4、DNA測序技術發(fā)展第一，非放射性標識檢測物使用第二，DNA測序自動化：1是測序過程中一些詳細步驟機械化和自動化，2是高度集成自動化測序儀創(chuàng)造及應用第三，計算機在DNA測序中應用：大規(guī)模測序計劃在很大程度上依賴于計算機程序對原始數(shù)據(jù)進行分類、整理和排序，尤其是在隨機測序策略中，采取計算機輔助分析，大大加緊了DNA測序發(fā)展進程。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第100頁第四，現(xiàn)有技術其它改進。主要包含：增加每塊膠上泳道數(shù)；采取新型凝膠和電泳技術；改進光學檢測系統(tǒng)；提升測序聚合酶催化效能等。其目標是大大加緊測序速度，提升測序反應靈敏度及準確性，降低測序反應對模板質量要求，簡化模板制備程序等。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第101頁DNA測序方法分為兩類：一類是基于凝膠電泳技術測序法，包含當前普遍采取手工DNA測序技術、自動化DNA測序技術、毛細管凝膠電泳激光熒光法、陣列毛細管電泳激光熒光法和超薄層凝膠板電泳激光熒光法等；另一類是不依賴于電泳分離直接測序法，包含質譜法、原子探針法、雜交法和流動式單分子熒光檢測法等。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第102頁（1）以凝膠電泳為基礎測序方法①DNA全自動序列分析系統(tǒng)（ALFsystem）DNA自動測序采取熒光替換放射性核素標識是實現(xiàn)DNA序列分析自動化基礎。用不一樣熒光分子標識四種雙脫氧核苷酸，然后進行Sanger測序反應，反應產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細管電泳）分離后，經(jīng)過四種激光激發(fā)不一樣大小DNA片段上熒光分子使之發(fā)射出四種不一樣波長熒光，檢測器采集熒光信號，并依此確定DNA堿基排列次序。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第103頁②超薄層板凝膠電泳（ultra-thingelelectrophoresis，UGE）激光熒光法在電泳方式方面有2處改進：1是超高壓電場使用，它能夠大幅度提升電泳速度；2是超薄凝膠使用，因為降低了凝膠厚度，不但提升了電泳速度，還能夠提升電泳條帶分辨率，使一次性閱讀由原來500個堿基上升至1000個堿基，總效果是測序速度提升到8000bp／h以上。在電泳結果檢測方式方面，以激光熒光檢測法取代了傳統(tǒng)放射自顯影檢測法，既杜絕了放射性核素帶來危害，也便于自動化操作。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第104頁③PCR測序技術第一，利用PCR技術直接從大DNA片段或基因組DNA中擴增取得足夠量待測DNA模板，從而省去亞克隆等繁瑣步驟。當前，不對稱PCR、單鏈PCR、固相PCR以及循環(huán)PCR等新PCR技術都已應用到DNA測序中。第二，經(jīng)過PCR技術進行重合群排序。將由重合群末端序列確定引物逐一配對，以待測大片段DNA為模板進行PCR，如能擴增出陽性條帶，便說明這兩個重合群相鄰。重合群次序一經(jīng)確定，便可利用PCR擴增重合群間DNA片段。第三，利用PCR技術進行DNA鏈終止測序反應，這一過程被稱為循環(huán)測序。循環(huán)測序是在模板DNA分子過少時，用耐高溫Taq酶代替DNA聚合酶進行酶法測序。在測序反應中，首先模板DNA分子得以擴增，另首先ddNTP插入造成以特定ddNTP結尾長短不一樣DNA片段。經(jīng)過電泳分離便可取得待測DNA分子堿基序列。循環(huán)測序優(yōu)點有：大大降低了模板DNA用量；重復變性、復性、鏈延伸循環(huán)可使雙鏈DNA酶法測序高效進行；初始階段加入試劑后無須在中途補充，可實現(xiàn)自動化。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第105頁

④毛細管及陣列毛細管電泳激光熒光法與普通凝膠電泳相比，毛細管凝膠電泳具備很多優(yōu)勢：第一，高效、快速。毛細管內徑普通在25～100pm，比表面積大，散熱快，可使用較高電場強度，大大提升了分析速度和分辨率。第二，所需樣品量少，靈敏度高。采取電動進樣或壓力進樣，樣品量僅為1-50ul，普通紫外檢測器可檢測10-13-10-15mol，激光誘導熒光檢測可達10-18-10-21mol。第三，在線檢測。利用檢測窗口直接進行柱檢測，不受凝膠長度影響。第四，操作自動化、重復試驗誤差低。所以，利用毛細管凝膠電泳進行DNA測序，分辨率極高，其關鍵在于選擇適當毛細管長度、電場強度、凝膠聚合物濃度及溫度原因等，以到達將一個堿基大小差異DNA片段順利分離開來目標。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第106頁（2）非電泳分離測序技術①雜交法（SBH）SBH基本原理是，用特定長度含有全部可能堿基序列寡核苷酸群體，與未知序列特點數(shù)目標DNA片段雜交，依據(jù)一些寡核苷酸探針形成完全雙鏈推知目標DNA堿基序列。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第107頁利用共價結合在寡核苷酸3’或5’端衍生物與玻璃板或凝膠結合，形成固定寡核苷酸小區(qū)；不一樣堿基組合寡核苷酸小區(qū)排列在一起形成探針點陣，組成DNA測序芯片或稱為基因芯片、寡核苷酸矩陣芯片。芯片中寡核苷酸小區(qū)數(shù)目取決于寡核苷酸片段長度，以八聚體單鏈DNA探針為例，包含全部可能4種堿基全部排列序列共計48=65536種，所以在芯片上寡核苷酸小區(qū)數(shù)目為65536個，每一個寡核苷酸小區(qū)則代表了一個已知序列探針。每一個探針序列與其所處位置對應關系是已知，測序時，只須將待測DNA樣品變性解鏈，在單鏈DNA片段末端上共價標識一個熒光分子，然后與基因芯片進行復性雜交。經(jīng)適當清洗后，與探針完全雜交單鏈DNA熒光分子在特定波長激光束照射下，發(fā)射出一定波長熒光，然后再由熒光掃描儀將基因芯片上全部方格點陣進行熒光掃描檢測，并將熒光發(fā)射是否正負信號傳輸?shù)诫娔X，最終依據(jù)發(fā)射熒光探針序列排出待測DNA樣品全序列。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第108頁目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第109頁②原子探針顯微鏡法掃描隧道顯微鏡（STM）和原子顯微鏡（AFM）等新技術發(fā)展，使快速、高分辨、直接觀察DNA分子構象成為可能。STM采取了相當于原子直徑導電探針掃描樣品表面，經(jīng)過連續(xù)測量移動探頭與分子表面之間形成隧道電流，確定樣品三維圖像。AFM則是經(jīng)過測量探針和DNA樣品表面作用力來確定分子表面形狀，并不要求樣品導電。當前，應用STM已成功地觀察到DNA雙螺旋結構和單個堿基對以及單鏈分子中單個核苷酸，所以能夠直接從DNA單鏈上讀取堿基序列。依據(jù)掃描速度，DNA測序能力可達1000bp／min以上。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第110頁③流動式單分子熒光檢測法美國LosAlamos國家試驗室建立一個快速DNA測序新技術，可對單個分子進行檢測?；驹硎?，對模板DNA片段上4種堿基分別標識上不一樣熒光基團，然后置于液體系統(tǒng)中，用水流載帶DNA片段流動，利用外切酶快速逐一地切斷DNA中標識單個堿基，經(jīng)過激光熒光檢測堿基類型，便可得到模板DNA序列。據(jù)報道，此法測序速度可達100～1000bp/s，而常規(guī)自動測序儀最快閱讀速度僅為0.1bp/s。存在主要問題是怎樣快速酶切單個熒光標識核苷酸分子以及怎樣用4種不一樣熒光基團標識不一樣4種堿基等。目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第111頁基本過程與菌落分子雜交法相同，但該法使用抗體探針，而非DNA探針來判定目標基因表示產(chǎn)物。免疫學檢測法含有專一性強、靈敏度高特點，只要有一個拷貝目標基因在克隆子細胞內表示合成蛋白質，就能夠檢測出來。前提條件是克隆基因可在宿主細胞內表示，而且有目標蛋白抗體。依據(jù)試驗伎倆不一樣，免疫學檢測法能夠分為抗體測定法和免疫沉淀測定法等類型。四、免疫化學檢測法（自學）目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第112頁（1）放射性抗體測定法（2）非放射性抗體測定法1、抗體測定法目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第113頁基本依據(jù)一個免疫血清中含有各種類型免疫球蛋白IgG分子，這些IgG分子分別與同一抗原分子上不一樣抗原決定簇特異性結合?？贵w分子或其某部分可牢靠地吸附在固體支持物（如聚乙烯塑料制品）表面上，所以不會被洗脫掉。經(jīng)過體外碘化作用，IgG抗體會快速地被放射性125I標識上。（1）放射性抗體測定法目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第114頁放射性抗體測定法操作過程目的基因導入受體細胞專業(yè)知識講座第115頁當前所采取免疫學檢測方法中，更多是先將待檢測菌落或噬菌斑按原位印跡到硝酸纖維素膜等固相支持物上，然后裂解細胞，使目標蛋白抗原結合到硝酸纖維素膜上，深入與對應抗體（即第一抗體）反應，形成抗原-抗體復合物。反抗原-抗體復合物檢測，既可采取125I標識第二抗體直接檢測，也可采取125I標識A蛋白進行間接分析。直接檢測法中，針對不一樣第一抗體，應分別標識對應第二抗體進行檢測；間接分析法中，只須標識一個A蛋白分子便可檢測各種不一樣第一抗體（A蛋白是金