細(xì)胞生物學(xué)研究方法課件

第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法進(jìn)行初步觀察形成可驗(yàn)證的假說設(shè)計對照試驗(yàn)收集資料作出合理結(jié)論生物學(xué)研究模式生物不同物種享有共同分子機(jī)制如何學(xué)習(xí)細(xì)胞生物學(xué)？抽象思維與動態(tài)觀點(diǎn)結(jié)構(gòu)與功能統(tǒng)一的觀點(diǎn)同一性(unity)和多樣性(diversity)的問題細(xì)胞生物學(xué)的主要內(nèi)容：結(jié)構(gòu)與功能（動態(tài)特征）；細(xì)胞的生命活動；實(shí)驗(yàn)科學(xué)與實(shí)驗(yàn)技術(shù)——細(xì)胞真知源于實(shí)驗(yàn)室——Whatweknow//Howweknow.第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

細(xì)胞組分的分析方法

細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)

用于細(xì)胞生物學(xué)研究的模式生物第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法

離心分離技術(shù)

細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類等的顯示方法

特異蛋白抗原的定位與定性

細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

放射自顯影技術(shù)

定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)

細(xì)胞的培養(yǎng)

細(xì)胞工程一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy)

普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)

倒置顯微鏡

熒光顯微鏡技術(shù)（FluorescenceMicroscopy）

激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)（LaserConfocalMicroscopy）

相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）

微分干涉顯微鏡（differentialinterferencecontrastmicroscope,DIC）

錄像增差顯微鏡技術(shù)（video-enhancemicroscopy）三、掃描遂道顯微鏡ScanningProbeMicroscope,SPM(80年代發(fā)展起來的檢測樣品微觀結(jié)構(gòu)的儀器)包括：STM、AFM、磁力顯微鏡、摩擦力顯微鏡等原理：掃描探針與樣品接觸或達(dá)到很近距離時，即產(chǎn)生彼此間相互作用力，如量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)（隧道電流）、原子間作用力、磁力、摩擦力等，并在計算機(jī)顯示出來，從而反映出樣品表面形貌信息、電特性或磁特性等。裝置：掃描的壓電陶瓷，逼近裝置，電子學(xué)反饋控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)采集、處理、顯示系統(tǒng)。特點(diǎn)：（1）可對晶體或非晶體成像，無需復(fù)雜計算，且分辨本領(lǐng)高。（側(cè)分辨率為0.1～0.2nm，縱分辨率可達(dá)0.01nm）； （2）可實(shí)時得到樣品表面三維圖象，可測量厚度信息；（3）可在真空、大氣、液體等多種條件下工作；非破壞性測量； （4）可連續(xù)成像，進(jìn)行動態(tài)觀察用途：納米生物學(xué)研究領(lǐng)域中的重要工具,在原子水平上揭示樣本表面的結(jié)構(gòu)。普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)

光鏡樣本制作分辨率是指區(qū)分開兩個質(zhì)點(diǎn)間的最小距離λ:光源波長N:介質(zhì)折射率α:物鏡鏡口角(標(biāo)本在光軸的一點(diǎn)對物鏡鏡口的張角)通常:

α最大值可達(dá)1400，空氣中N=1，最短的可見光波長λ為450nm，此時D=292nm，約0.3μm。在油鏡下，N可提高到1.5，此時D可達(dá)0.2μm。激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)

（LaserScanningConfocalMicroscopy）原理共焦點(diǎn)：物鏡與聚光鏡同時聚焦到同一個小點(diǎn)，即它們互相共焦點(diǎn)。應(yīng)用： 排除焦平面以外光的干擾，增強(qiáng) 圖像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)。相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）

將光程差或相位差轉(zhuǎn)換成振幅差，可用于觀察活細(xì)胞。微分干涉顯微鏡（differential-interferencemicroscope）偏振光經(jīng)合成后，使樣品中厚度上的微小區(qū)別轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別，增加了樣品反差且具有立體感。適于研究活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器。錄像增差顯微鏡技術(shù)（video-enhancemicroscopy）

計算機(jī)輔助的DIC顯微鏡可在高分辨率下研究活細(xì)胞中的顆粒及細(xì)胞器的運(yùn)動。電鏡與光鏡的比較

顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可見光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差電子顯微鏡的基本構(gòu)造主要電鏡制樣技術(shù)超薄切片技術(shù)用于電鏡觀察的樣本制備示意圖

負(fù)染色技術(shù)（Negativestaining）與金屬投影 染色背景，襯托出樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)。 冰凍蝕刻技術(shù)（Freezeetching）（技術(shù)示意圖） 冰凍斷裂與蝕刻復(fù)型：主要用來觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)。快速冷凍深度蝕刻技術(shù)（quickfreezedeepetching）電鏡三維重構(gòu)技術(shù) 電子顯微術(shù)、電子衍射與計算機(jī)圖象處理相結(jié)合而形成的具有重要應(yīng)用前景的一門新技術(shù)。電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與X-射線晶體衍射技術(shù)及核磁共振分析技術(shù)相結(jié)合，是當(dāng)前結(jié)構(gòu)生物學(xué)（StructuralBiology）——主要研究生物大分子空間結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系的主要實(shí)驗(yàn)手段。掃描電鏡原理與應(yīng)用：電子“探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測器收集二次電子成象。CO2臨界點(diǎn)干燥法防止引起樣品變形的表面張力問題二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、

酶、糖與脂類等的顯示方法

原理：利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些 特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特征，通過顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量。

FeulgenStaining三、特異蛋白抗原的定位與定性

免疫熒光技術(shù)： 快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限（圖）*蛋白電泳(SDS)與免疫印跡反應(yīng)(Western-Blot)

免疫電鏡技術(shù)：免疫鐵蛋白技術(shù)免疫酶標(biāo)技術(shù)免疫膠體金技術(shù)

應(yīng)用：通過對分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等。五、放射自顯影技術(shù)原理及應(yīng)用：利用同位素的放射自顯影，對細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行定性、定位與半定量研究；實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行動態(tài)和追蹤研究。步驟：前體物摻入細(xì)胞（標(biāo)記：持續(xù)標(biāo)記和脈沖標(biāo)記）———放射自顯影六．定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)細(xì)胞顯微分光光度術(shù)（Microspectrophotometry）利用細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)對特異光譜的吸收，測定這些物質(zhì) （如核酸與蛋白質(zhì)等）在細(xì)胞內(nèi)的含量。 包括：

紫外光顯微分光光度測定法可見光顯微分光光度測定法

流式細(xì)胞儀（FlowCytometry）主要應(yīng)用：用于定量測定細(xì)胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量； 測定細(xì)胞群體中不同時相細(xì)胞的數(shù)量； 從細(xì)胞群體中分離某些特異染色的細(xì)胞； 分離DNA含量不同的中期染色體。

對細(xì)胞生命活動的研究成為當(dāng)今生命科學(xué)發(fā)展的瓶頸

細(xì)胞生命活動突變體分析突變體分析蛋白修飾分析基因表達(dá)多肽定性分析生物信息學(xué)序列測定雙向電泳分析DNA分離與克隆機(jī)器人技術(shù)(robotics)

功能基因組學(xué)蛋白質(zhì)分離與制備蛋白質(zhì)組學(xué)構(gòu)成①照明系統(tǒng)②光學(xué)放大系統(tǒng)③機(jī)械裝置原理經(jīng)物鏡形成倒立實(shí)像，經(jīng)目鏡放大成虛像。LightPathwayofMicroscopeLCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)AcomparisonofyeastcellsthatweregrowingonthevaginalepitheliumseenwithdifferenttypesofLM.a)underbright-field;b)phase-contrast;c)DIC超薄切片厚度僅50nm左右，用超薄切片機(jī)（ultramicroto-me）制作。Examplesofnegtivelystainedandmetal-shadowedspecimens.Electronmicrographsofatobaccorattlevirusafternegtivestainingwithpotassiumphosphotungstate(a)orshadowcastingwithchromium(b).CaenorhabditiselegansDrosophilamelanogasterArabidopsisthaliana體外培養(yǎng)的細(xì)胞正在分裂生長的Hela細(xì)胞（左）、CHO細(xì)胞（右）的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中常用的幾種細(xì)胞系細(xì)胞系名稱細(xì)胞類型來源3T3成纖維細(xì)胞小鼠HeLa宮頸癌上皮細(xì)胞HenriettaLacks

BHK21成纖維細(xì)胞敘利亞倉鼠PtKl上皮細(xì)胞袋鼠L6成肌細(xì)胞大鼠PCI2嗜鉻細(xì)胞大鼠SP2漿細(xì)胞小鼠SP2／0骨髓瘤漿細(xì)胞小鼠CHO卵巢細(xì)胞中國地鼠HenriettaLacks,Americanblack,diedofcancerofuterinecervixin1951原理包在鞘液中的細(xì)胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計算機(jī)處理，輸出統(tǒng)計結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，分離純度可達(dá)99%。包被細(xì)胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細(xì)胞計（flowcytometer）。同核體：相同基因型的細(xì)胞融合而成。異核體：不同基因型的細(xì)胞融合而成。自發(fā)融合：同種細(xì)胞在培養(yǎng)過程中自發(fā)合并的現(xiàn)象。誘發(fā)融合：異種間的細(xì)胞必須經(jīng)誘導(dǎo)劑處理才能融合。