植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座

植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法種類及特點植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第1頁植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)普通操作過程植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第2頁

間接轉(zhuǎn)化法：農(nóng)桿菌介導(dǎo)法病毒介導(dǎo)法植物基因轉(zhuǎn)化技術(shù)方法

DNA直接轉(zhuǎn)化法：基因槍法電擊法花粉管通道法化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)法顯微注射法脂質(zhì)體法植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第3頁

間接轉(zhuǎn)化法是以生物體為媒介植物轉(zhuǎn)基因方法,有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和病毒介導(dǎo)法。

間接轉(zhuǎn)化法植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第4頁

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是以農(nóng)桿菌為媒介對植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化方法。1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第5頁

它是經(jīng)過根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒(Tumerinducingplasmid)和發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒(Rootinducingplasmid)上一段T-DNA區(qū)在農(nóng)桿菌侵染植物形成腫瘤過程中,T-DNA能夠被轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞并插入到染色體基因中。

植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第6頁T-DNA能夠進(jìn)行高頻率轉(zhuǎn)移,而且Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒上能夠插入到50kb外源基因,所以Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒就成為植物基因轉(zhuǎn)化理想載體系統(tǒng)。植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第7頁

T-DNA能夠?qū)⑵鋽y帶外源基因整合到植物基因組中，T-DNA上較主要是T區(qū)兩端左右邊界各為25bp重復(fù)序列。其中14bp是中心,分10bp和4bp兩組,是完全保守。這兩個邊界是T-DNA轉(zhuǎn)移所必需。其中尤以右邊界最為重要。T-DNA植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第8頁vir基因

Ti質(zhì)粒vir區(qū)大小為30kb,分VirA、B、C、D、E、G、H等7個操縱子,一共有24個基因共同控制著T-DNA加工和轉(zhuǎn)移,它們總稱調(diào)控子。植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第9頁葉盤消毒切取土壤農(nóng)桿菌浸泡篩選培養(yǎng)基愈傷組織分化幼苗植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第10頁優(yōu)點：

技術(shù)較成熟,轉(zhuǎn)化效率高操作簡單，不需要特殊儀器，培養(yǎng)周期短外源基因多以單拷貝或低拷貝插入受體細(xì)胞,穩(wěn)

定性好，降低了共抑制等基因緘默現(xiàn)象?？蓪⑤^大片段DNA完整地轉(zhuǎn)移到植物基因組中

等。植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第11頁缺點：主要轉(zhuǎn)化雙子葉植物。T-DNA能夠在植物染色體任何區(qū)域內(nèi)插入,有可能造成有益基因插入失活。迄今所取得近200種轉(zhuǎn)基因植物中80%以上是經(jīng)過根癌農(nóng)桿菌系統(tǒng)轉(zhuǎn)化取得。植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第12頁病毒介導(dǎo)法是以病毒為媒介對植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化

載體系統(tǒng)。詳細(xì)來說就是將外源基因插入到病

毒基因組中,經(jīng)過病毒對植物細(xì)胞感染而將外源

基因?qū)胫参锛?xì)胞一個植物轉(zhuǎn)基因方法。2.病毒介導(dǎo)法植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第13頁利用植物病毒介導(dǎo)法對植物基因進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化效

率比較高,但它安全性受到質(zhì)疑,主要用于動物

基因轉(zhuǎn)移。

植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第14頁

直接轉(zhuǎn)化法(又稱DNA直接導(dǎo)入法),它指不依賴于生物體將裸露DNA直接轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞和原生質(zhì)體中,造成細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù),與間接轉(zhuǎn)化法相比,直接轉(zhuǎn)化法不需構(gòu)建載體,所以又叫無載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法。它適合用于對農(nóng)桿菌侵染不敏感植物,使用此法前提是需要建立良好細(xì)胞或原生質(zhì)體培養(yǎng)及再生系統(tǒng)。DNA直接轉(zhuǎn)移法植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第15頁

DNA直接導(dǎo)入法最大優(yōu)點是無需選擇宿主,能夠?qū)肷锛?xì)胞；缺點是嵌合基因整合進(jìn)宿主染色體頻率低。該方法能夠分為化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)法、電穿孔法、脂質(zhì)體法、顯微注射法、基因槍法、離子束介導(dǎo)法和花粉管通道法。植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第16頁基因槍法電擊法花粉管通道法化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)法顯微注射法脂質(zhì)體法植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第17頁

基因槍法最早是由美國康奈爾大學(xué)Sanford最先提出。它經(jīng)過高速飛行金屬顆粒將包被其外目標(biāo)基因直接導(dǎo)入到受體細(xì)胞內(nèi)，最終整合到植物基因組并得以表示從而實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化方法。1992年，世界首例轉(zhuǎn)基因小鼠就是經(jīng)過該法取得。

1.基因槍法植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第18頁DNA1.2m鎢彈頭吸附特制手槍射擊植物裝入植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第19頁植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第20頁優(yōu)點：克服了受體材料限制，無須制備原生質(zhì)體。試驗操作簡單易行，適合于大多數(shù)細(xì)胞或組織，含有相當(dāng)廣泛應(yīng)用范圍，已經(jīng)成為植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化最有效方法之一。缺點：進(jìn)去DNA片段整合效率極低，遺傳穩(wěn)定性差，拷貝數(shù)多，不易取得再生植株。植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第21頁

至今為止,該法已成為除了農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法以外應(yīng)用最廣泛基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。此法已在葡萄、水稻等植物轉(zhuǎn)基因中應(yīng)用,并取得轉(zhuǎn)基因植株?；驑尫ㄒ材軌蛴行У赜糜谌~綠體轉(zhuǎn)化，還能夠轉(zhuǎn)移RNA、DNA克隆等。植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第22頁

是在高壓電脈沖作用下在新鮮分離原生質(zhì)體質(zhì)膜上形成瞬時可逆性開放小孔,為外源DNA提供通道,借此導(dǎo)入DNA等遺傳物質(zhì),到達(dá)轉(zhuǎn)化目標(biāo)。由于質(zhì)膜含有可修復(fù)性,外加電壓造成膜穿孔可在一定時間內(nèi)自動修復(fù),從而使細(xì)胞恢復(fù)到正常生理情況。2.電擊法植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第23頁植物細(xì)胞原生質(zhì)體纖維素酶和果膠酶DNA混合入電擊緩沖液1-2kV,3-25F電擊愈傷組織幼苗分化植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第24頁優(yōu)點：操作簡便，能夠一次轉(zhuǎn)化許多原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)化效率較高，尤其適于瞬間表示。缺點：有原生質(zhì)體培養(yǎng)麻煩,電穿孔易造成原生質(zhì)體損傷使再生率降低。

該法已在甘蔗、大麥小孢子、剪股穎等植物基因轉(zhuǎn)化當(dāng)中。植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第25頁花粉管通道法是利用植物授粉后,所形成天然花粉管通道,經(jīng)珠心通道,將外源DNA攜帶入胚囊,從而到達(dá)轉(zhuǎn)化目標(biāo)一個植物轉(zhuǎn)基因方法。3.花粉管通道法植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第26頁優(yōu)點：

適用范圍廣，不依賴組織培養(yǎng)人工再生植株；

可直接取得轉(zhuǎn)基因種子，育種時間短，在判定

時可直接針對目標(biāo)性狀表現(xiàn)型來進(jìn)行,簡單快

捷；

轉(zhuǎn)化速度較快，變異性狀穩(wěn)定較快；

方法簡單,不需要復(fù)雜昂貴儀器設(shè)備。植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第27頁缺點：轉(zhuǎn)化受體受植物花期限制，同時必須充分了解

每一個植物開花受精時間過程。在自然田間進(jìn)行操作，受環(huán)境條件影響很大。操作經(jīng)驗性很強,需要一定技巧。利用此方法取得水稻、煙草、甘藍(lán)、小麥等植物轉(zhuǎn)基因植株。植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第28頁化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)法是以原生質(zhì)體為受體,借助于特定化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)DNA直接導(dǎo)入植物細(xì)胞方法。慣用轉(zhuǎn)化細(xì)胞化學(xué)物質(zhì)有PEG(聚乙二醇)、PLO(多聚鳥氨酸)、PVA(聚乙烯醇)等,其中PEG法應(yīng)用較多,效果很好。PEG法是一個經(jīng)過化學(xué)物質(zhì)PEG處理去壁原生質(zhì)體作為轉(zhuǎn)化受體,改變細(xì)胞膜通透性使原生質(zhì)體取得轉(zhuǎn)化方法。4.化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)法植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第29頁優(yōu)點：PEG法操作簡單、成本低、結(jié)果較穩(wěn)定、重復(fù)性

好、無需昂貴基因轉(zhuǎn)化儀器，且嵌合轉(zhuǎn)化體很

少產(chǎn)生。

植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第30頁缺點：原生質(zhì)體培養(yǎng)再生難度較大；原生質(zhì)體再生培養(yǎng)轉(zhuǎn)化植株變異率高,易產(chǎn)生白

化苗，且因為PEG法對原生質(zhì)體活力有害，轉(zhuǎn)化

率低。應(yīng)用這種方法已成功取得大麥、柑桔、胡椒等植物轉(zhuǎn)基因植株。植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第31頁顯微注射法是使用毛細(xì)微管(普通針尖直徑為

0.5nm),在顯微鏡下將外源DNA注射入植物細(xì)胞

或原生質(zhì)體中一個直接而完善方法。5.顯微注射DNA植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第32頁該方法是Pena等1987年首創(chuàng),在用此方法進(jìn)行

基因?qū)霑r,通常需要把原生質(zhì)體或培養(yǎng)細(xì)胞固

定在瓊脂或低熔點瓊脂糖上,或用聚賴氨酸處理

使原生質(zhì)體附著在玻璃平板上,也能夠經(jīng)過一固著毛細(xì)管將原生質(zhì)體吸著在管口,再進(jìn)行操作。

植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第33頁優(yōu)點：轉(zhuǎn)化率高，尤其是在沒有適當(dāng)DNA載體系統(tǒng)時

更有價值對轉(zhuǎn)移物質(zhì)沒有限制，可選擇受體細(xì)胞核接

受位點受體不用特殊選擇系統(tǒng)能夠控制轉(zhuǎn)移量和轉(zhuǎn)移物濃度植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第34頁缺點：設(shè)備和技術(shù)要求較高要想取得轉(zhuǎn)化植株,需要注射大量細(xì)胞或原生質(zhì)體，費時費工對細(xì)胞有損傷，一次處理細(xì)胞數(shù)量不能太多，比較適合大細(xì)胞操作，主要用于動物基因轉(zhuǎn)化中植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第35頁脂質(zhì)體是依據(jù)生物膜結(jié)構(gòu)和功效特征，人工用

脂類化合物合成雙層膜囊。脂質(zhì)體法是Dellaporta等在1981年創(chuàng)造,就是將

包含外源基因脂質(zhì)體與植物原生質(zhì)體融合,從而

到達(dá)轉(zhuǎn)基因目標(biāo)一個轉(zhuǎn)化方法。6.脂質(zhì)體法植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第36頁優(yōu)點：可防止DNA在導(dǎo)入受體細(xì)胞之前被核酸酶降解；適用植物種類廣泛重復(fù)性高,包裝在脂質(zhì)體內(nèi)

DNA或RNA可穩(wěn)定地貯藏。植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第37頁缺點：在包裝DNA時必須有短時間超聲處理,會使相當(dāng)

多DNA斷裂；

所用材料必使用含有全能性原生質(zhì)體作為受體

細(xì)胞；轉(zhuǎn)化效率較低。

主要用于動物基因轉(zhuǎn)化,在植物上此方法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移在煙草、青菜等植物上有報道。植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家講座第38頁幾個植物轉(zhuǎn)基因方法比較轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)化優(yōu)點轉(zhuǎn)化缺點DNA間接轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移受體種類，能夠在原生質(zhì)體、和細(xì)胞團、組織器官或整株等多級水平上進(jìn)行，方法成熟可靠，簡便易行，周期短，轉(zhuǎn)化率高；轉(zhuǎn)化雙子葉植物為主。大多數(shù)單子葉植物和